趙偉 李濤 吳華蓮 陳浩 劉德海 向文洲 吳后波

（1. 中國科學院南海海洋研究所，中國科學院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室，廣州 510301；2. 中國科學院大學，北京 100049；3. 中國科學院南海生態(tài)環(huán)境工程創(chuàng)新研究院，廣州 510301；4. 廣州市白云聯(lián)佳精細化工廠，廣州 510412）

真眼點藻屬（Eustigmatos）藻類可以積累超過干重60%的儲藏性油脂和長鏈二十碳五烯酸（C20∶5，EPA）等多不飽和脂肪酸，受到國內(nèi)外科學家的廣泛關(guān)注。真眼點藻發(fā)現(xiàn)之初被劃分在黃藻綱，20世紀70年代，Hibberd和Leedale將其分出并設立獨立的真眼點藻綱（Eustigmatophyceae），目前已發(fā)現(xiàn)14個屬、超過30多個種［1-3]。目前發(fā)現(xiàn)的真眼點藻屬均為淡水種，尚未見適應高鹽海水的報道。

本課題組于2017年在寧夏固原市羅洼鄉(xiāng)一處荒漠表層基質(zhì)中分離純化獲得一株真眼點藻類似藻株，經(jīng)18S RNA序列分析和形態(tài)鑒定，發(fā)現(xiàn)該藻株與波氏真眼點藻（E.polyphem）具有非常高的相似性，該藻可在的高鹽海水中適應生長，其中15‰為最適鹽度（結(jié)果另行發(fā)表）。

研究表明，不同真眼點藻在營養(yǎng)需求、生長情況、油脂積累和脂肪酸組成方面存在較大差異，在眾多影響微藻生長和脂類積累的因素中，氮元素的影響最為明顯，利用氮限制方式培養(yǎng)微藻，也常常被用來評價微藻油脂的生產(chǎn)能力［4]。氮源和氮濃度對真眼點藻生理生化的影響，國內(nèi)已開展大量的研究工作。蘇怡等［5]對8株真眼點藻綱微藻的生長和油脂積累進行了研究，結(jié)果表明，不同硝酸鈉濃度對8株微藻的油脂含量的影響極為明顯，8株微藻均在3 mmol/L氮濃度條件下油脂含量達到最高，其中魏氏真眼點藻油脂積累量約為60%干重（Dry weight，DW）。周芷薇等研究表明，斧形魏氏藻和點狀魏氏藻在硝酸鈉濃度為3.6 mmol/L條件下，兩種微藻的油脂含量分別為56.4% DW和64.7% DW［6]。何思思等［7]對一株魏氏真眼點藻的研究表明，該株在低氮（3 mmol/L）條件下總脂含量高達60.81%，明顯高于其在高氮組（17.6 mmol/L）的總脂含量。

本論文以獲得的適應高鹽的真眼點藻SCSIO-45821藻株為實驗材料，通過研究其在不同氮源和氮濃度條件下的生長及油脂積累情況，對該藻株的應用潛力進行初步評估。設置硝酸鈉（NaNO3）、尿素（Urea）、碳酸氫銨（NH4HCO3）三種氮源，每種氮源設置高、中、低三種氮濃度（3.5 mmol/L、5.9 mmol/L、17.6 mmol/L），跟蹤測定藻細胞生長、總脂含量、脂類及脂肪酸組成，并計算總脂產(chǎn)量和EPA產(chǎn)量，研究結(jié)果為該真眼點藻SCSIO-45821的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種 本實驗研究的藻株采自寧夏固原市羅洼鄉(xiāng)，利用多次平板涂布法獲得該藻的純培養(yǎng)藻株，再將藻株進行海水馴化，保藏于中國科學院南海海洋研究所海藻資源與生物技術(shù)實驗室，藻種編號為SCSIO-45821。

1.1.2 培養(yǎng)條件 微藻培養(yǎng)于光徑為3.0 cm、長度為60 cm、有效培養(yǎng)體積為320 mL的柱式光生物反應器中，培養(yǎng)溫度為25±1℃，熒光燈提供單側(cè)光源，培養(yǎng)光強為300 μmol·photons/m2s，連續(xù)鼓入二氧化碳加富的壓縮空氣提供碳源和攪拌（CO2∶Air，1∶99）。所用培養(yǎng)基為15‰海水BG-11，用15‰海水按改良的BG-11培養(yǎng)基配方配制而得［8]。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 在15‰海水BG-11無氮培養(yǎng)基中，分別以硝酸鈉、尿素、碳酸氫銨為氮源，每種氮源設置3.5 mmol/L、5.9 mmol/L、17.6 mmol/L三種初始氮濃度（換算成N濃度相同），以光徑為3.0 cm的光生物反應器作為培養(yǎng)體系，在溫度為25℃，光強為 300 μmol·photons/m2s條件下，采用 24小時不間斷光照以及連續(xù)通入含1%CO2的壓縮空氣培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為14 d，每2 d測定生物質(zhì)濃度，第0天、第4天、第8天、第12天、第14天離心收取藻泥，冷凍干燥并測定總脂含量及脂肪酸組成。

1.2.2 測序方法和引物序列 提取該藻的DNA，采用18S rDNA基因引物，在PCR內(nèi)擴增后測序，正向引物：CTGGTTGATCCTGCCAGT，反向引物：CACCTACGCAAACCTTGTTACGACTT。

1.2.3 生物質(zhì)濃度的測定 利用干重法進行測定，取一定量的藻液，用預先在80℃烘箱中烘干至恒重的混合纖維濾膜（0.45 μm）進行抽濾，再將有藻細胞的濾膜放置在80℃烘箱烘至恒重，稱重，用減差法得到微藻細胞干重。

1.2.4 總脂的測定與分級 總脂的提取與含量的測定采取改良的Khozin-Goldberg方法［9]，利用Christie的方法［10]，將總脂分為中性脂、糖脂、磷脂。

1.2.5 脂肪酸的測定 稱取25 mg凍干藻粉于10 mL玻璃離心管中，加入2 mL 2% H2SO4無水甲醇∶甲苯（9∶1，V∶V），充入氮氣后，用80℃水浴攪拌1小時，再依次加入1 mL去離子水和1 mL正己烷，充分震蕩后3 500 r/min離心5 min，將上層有機相轉(zhuǎn)移至另一離心管中，氮氣吹干，再加入1 mL含有C17標準品的正己烷，并用孔徑為0.22 μm的濾膜過濾至1.5 mL的小玻璃瓶中，最后利用氣相色譜儀測定脂肪酸。

1.2.6 產(chǎn)量計算 總脂產(chǎn)量（g/L）=Mt×Lt，Mt為收藻時微藻的生物質(zhì)濃度（g/L），Lt為相對應的總脂含量（DW，g/L）。EPA 產(chǎn) 量（mg/L）=Mt×Ft×1000，Mt為收藻時微藻的生物質(zhì)濃度（mg/L），F(xiàn)t為收藻時微藻EPA絕對含量（DW，g/L）。

1.2.7 統(tǒng)計分析 本論文中所有圖表所示的平均值和標準偏差均由2個生物學重復和3個測定重復計算獲得；利用Origin 8.1和Excel對實驗數(shù)據(jù)進行分析（ANOVA）；采用S-N-K方法對不同處理組進行多重比較；用最小顯著性差異（LSD）分析樣品均值之間的差異，置信度為0.05。

2 結(jié)果

2.1 藻株的分子鑒定圖

該藻生長在海拔高、降水少、風沙大及植被稀少的黃土高原上，為了確定該藻的分類學特征，將其18S rDNA基因序列輸入到NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，得到與該藻基因序列相似度最大的藻株分別為波氏真眼點藻（EustigmatospolyphemCCAP 860/8）和大真眼點藻（EustigmatosmagnusSAG 2266），根據(jù)18S rDNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。如圖1所示，該藻株命名為真眼點藻SCSIO-45821。

2.2 不同氮源及濃度對真眼點藻SCSIO-45821生長的影響

如圖2所示，經(jīng)過0-2 d的生長延滯期，從第2天開始，真眼點藻SCSIO-45821藻細胞在三種不同氮源中均開始迅速增長，第10天后，藻細胞生長變緩，在以尿素為氮源的培養(yǎng)基中，三種不同氮濃度下的藻細胞生物質(zhì)濃度無明顯差異（P＞0.05），至第14天，3.5 mmol/L、5.9 mmol/L和17.6 mmol/L三種氮濃度處理組的生物質(zhì)濃度分別為6.49 g/L、5.39 g/L和5.66 g/L。在以碳酸氫銨為氮源的培養(yǎng)基中，三種不同氮濃度下的藻細胞長勢差異明顯（P＜0.01），3.5 mmol/L、5.9 mmol/L和17.6 mmol/L三種氮濃度處理組的生物質(zhì)濃度分別為5.72 g/L、6.48 g/L和7.07 g/L。在以硝酸鈉為氮源的培養(yǎng)基中，3.5 mmol/L、5.9 mmol/L和17.6 mmol/L三種氮濃度處理組的生物質(zhì)濃度分別為6.73 g/L、6.76 g/L和5.93 g/L。由上述分析可知，真眼點藻SCSIO-45821在碳酸氫銨為氮源，濃度為17.6 mmol/L時，取得了高于其他氮源和氮濃度處理組的生物質(zhì)濃度，為7.07 g/L。

2.3 不同氮源及氮濃度對真眼點藻SCSIO-45821總脂積累的影響

對不同氮源及氮濃度條件下藻細胞油脂進行提取和分析發(fā)現(xiàn)（圖3），整個培養(yǎng)周期內(nèi)，真眼點藻SCSIO-45821的總脂含量均呈增加趨勢，但不同處理組之間的油脂積累規(guī)律存在明顯差異。三種氮源3.5 mmol/L組的油脂積累速率均高于5.9 mmol/L組和17.6 mmol/L組（P＜0.01），培養(yǎng)至第14天，尿素組總脂含量最高為63.2% DW，其次為硝酸鈉（60.5%DW）和碳酸氫銨（59.9% DW）。17.6 mmol/L條件下，至培養(yǎng)結(jié)束均未超過35.0% DW。

圖1 基于18SrDNA基因序列對該藻構(gòu)建的進化樹

圖2 不同氮源及氮濃度對真眼點藻SCSIO-45821生長的影響

圖3 不同氮源及氮濃度對真眼點藻SCSIO-45821油脂積累的影響

2.4 不同氮源及氮濃度對真眼點藻SCSIO-45821脂類組分的影響

按照總脂分級方法，對實驗獲得的總脂進行分級，結(jié)果如圖4所示，隨著氮濃度的降低及培養(yǎng)時間的延長，真眼點藻SCSIO-45821的中性脂比例也隨之增加。培養(yǎng)至第14天，三種氮源條件下，3.5 mmol/L處理組的中性脂比例顯著高于17.6 mmol/L處理組，然而與5.9 mmol/L處理組相比無明顯差異（P＞0.05），尿素、碳酸氫銨和硝酸鈉在3.5 mmol/L條件下的中性脂比例分別為79.0% TL（Total lipid）、77.0% TL和75.7% TL，而它們在17.6 mmol/L條件下的中性脂比例均未超過70% TL。

2.5 不同氮源及濃度對真眼點藻SCSIO-45821脂肪酸組成的影響

真眼點藻SCSIO-45821脂肪酸組成顯示，該藻的脂肪酸主要包括：C14∶0（豆蔻酸）和C16∶0（棕櫚酸）兩種飽和脂肪酸，C16∶1（棕櫚油酸）和C18∶1（油酸）兩種單不飽和脂肪酸以及C18∶2（亞油酸）、C20∶4（Arachidonic acid，AA）和C20∶5（eicosapentaenoic acid，EPA）三種多不飽和脂肪酸，其中C16∶1的含量遠高于其他脂肪酸。在三種不同的氮源組分中，隨著氮濃度的升高，真眼點藻 SCSIO-45821細胞中 C14∶0、C16∶1和 C18∶1的 百 分 含 量 下 降，C16∶0、C18∶2、C20∶4和C20∶5（EPA）的含量上升（表1），在以硝酸鈉為氮源的處理組中，17.6 mmol/L條件下C20∶5（EPA）的百分含量最高，為7.18% TFA（Total fatty acid），尿素氮源次之（6.20% TFA），最小為碳酸氫鈉（4.82% TFA）。

圖4 不同氮源及氮濃度對真眼點藻SCSIO-45821總脂組分的影響

2.6 不同氮源及氮濃度對真眼點藻SCSIO-45821總脂及EPA產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)至14 d，真眼點藻SCSIO-45821總脂和EPA產(chǎn)量如表2所示，該藻株在低氮組和高氮組中的總脂產(chǎn)量差異明顯（P＜0.01）。隨著氮濃度的升高，該藻的總脂產(chǎn)量降低，低氮條件下總脂產(chǎn)量最高。在低氮條件下，以尿素為氮源的培養(yǎng)基中的該藻油脂產(chǎn)量最高，為4.18 g/L，在高氮條件下該藻的總脂產(chǎn)量僅有1.64 g/L。本實驗結(jié)果表明，在3.5 mmol/L條件下，以碳酸氫銨和硝酸鈉為氮源培養(yǎng)的該藻總脂產(chǎn)量分別為3.42 g/L和4.07 g/L，可見尿素可作為該藻生產(chǎn)油脂的最佳氮源。EPA的產(chǎn)率隨氮濃度的升高而升高，該藻在氮濃度為17.6 mmol/L硝酸鈉的培養(yǎng)基中EPA產(chǎn)量最高，為85.71 mg/L。

3 討論

3.1 不同氮源及濃度對真眼點藻SCSIO-45821生長的影響

氮源是微藻生長所必需的營養(yǎng)元素之一［11-12]，本研究結(jié)果顯示，在以碳酸氫銨為氮源的實驗組中，真眼點藻SCSIO-45821在17.6 mmol/L處理組中的生物質(zhì)濃度高于其在3.5 mmol/L和5.9 mmol/L處理組中的生物質(zhì)濃度，與已有實驗結(jié)果相符［13]。而在以尿素和硝酸鈉為氮源的實驗組中，SCSIO-45821藻株的生長隨著濃度的降低而得以顯著提高，3.5 mmol/L最低濃度組遠高于高濃度17.6 mmol/L處理組，這一現(xiàn)象較為罕見，造成這一現(xiàn)象的深層機制還有待進一步考究。

表1 不同氮源及氮濃度對真眼點藻SCSIO-45821脂肪酸組成的影響

3.2 不同氮源及濃度對真眼點藻SCSIO-45821總脂及脂肪酸積累的影響

低氮脅迫可誘導該藻積累油脂，本實驗結(jié)果顯示，三種氮源中3.5 mmol/L組的油脂積累量均高于5.9 mmol/L組和17.6 mmol/L組。有報道指出，在氮饑餓（3.5 mmol/L和5.9 mmol/L）條件下，藻細胞因缺少氮元素而抑制蛋白質(zhì)合成，從而使微藻細胞內(nèi)的碳流向油脂轉(zhuǎn)化，而在高氮（17.6 mmol/L）條件下，微藻細胞可以正常分裂，細胞內(nèi)碳流向蛋白質(zhì)積累轉(zhuǎn)化，油脂含量降低［14]。本實驗設置的三種氮源中，低氮組的油脂含量均顯著高于高氮組，這一結(jié)果與已有的文獻報道結(jié)果一致［15-16]。而由于低氮組細胞生長均高于高氮組，該藻株在硝酸鈉和尿素為氮源低氮組培養(yǎng)中，其油脂產(chǎn)量均顯著高于碳酸氫銨組的最大油脂產(chǎn)量，其中低濃度尿素更為適宜油脂生產(chǎn)。目前已知的大多數(shù)微藻在低氮條件下大幅提高油脂含量，但同時也顯著抑制生長，導致油脂產(chǎn)量不高甚至降低，因此，這一現(xiàn)象對微藻油脂的高效積累具有重要意義，具有進一步探索的價值。

表2 不同氮源及氮濃度對真眼點藻SCSIO-45821總脂及EPA產(chǎn)量的影響

本研究還發(fā)現(xiàn)，三種氮源中，隨著氮濃度的升高，SCSIO-45821藻株EPA含量也隨之升高，在以硝酸鈉為氮源的處理組中，17.6 mmol/L條件下C20∶5（EPA）的百分含量最高，為7.18% TFA，在3.5 mmol/L條件下EPA百分含量僅為1.79%（表1）。有文獻報道，真眼點藻的EPA存在于細胞膜脂上［17-18]，低氮條件下，中性脂含量均大幅提高，膜脂降解程度高，因此高氮條件下會獲得更高的EPA含量，本研究結(jié)果表明，高濃度的硝酸鈉條件更宜于SCSIO-45821藻株的EPA積累。

3.3 真眼點藻SCSIO-45821的耐高鹽性及潛在價值

SCSIO-45821藻株細胞內(nèi)含有豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、油酸、亞油酸、花生四烯酸以及二十碳五烯酸（EPA）等7種脂肪酸，其中棕櫚油酸的含量最高，占總脂肪酸的50%以上，該藻株脂肪酸組成與類波氏真眼點藻基本一致［19]。在低氮條件下，該藻株的油脂產(chǎn)率高、中性脂比例高，流動性好，在食用油脂及生物能源行業(yè)具有極大的開發(fā)前景。而其EPA產(chǎn)量隨著氮濃度的升高呈上升趨勢，最高含量達1.59%（占干重），最高產(chǎn)量達到85.71 mg/L。EPA具有很好的保健功能［20]，降低人患心腦血管疾病的風險以及抗癌抗腫瘤等作用［21-22]。此外，棕櫚油酸占該藻總脂肪酸的50%以上，棕櫚油酸具有抗炎，改善皮膚色澤和緩解肥胖癥等作用［23-24]，因此，該藻在醫(yī)藥保健品及化妝品行業(yè)具有極大的開發(fā)應用價值。

隨著我國耕地資源和淡水資源的日益緊缺，利用海水以及灘涂、鹽堿地建立微藻規(guī)?；B(yǎng)殖技術(shù)具有重要意義。SCSIO-4582藻株具有良好的耐高鹽性，在15%-20‰的海水中能夠正常生長，可望作為海水新資源藻種，開發(fā)前景廣闊。

4 結(jié)論

低氮（3.5 mmol/L）脅迫真眼點藻SCSIO-45821積累油脂，以尿素為氮源更有利于該藻積累油脂；高氮（17.6 mmol/L）有利于誘導真眼點藻SCSIO-45821的EPA的積累，并且以硝酸鈉為氮源可獲得較高產(chǎn)量的EPA，運用不同的氮濃度可誘導真眼點藻SCSIO-45821積累不同的高值化產(chǎn)品，因此，該藻具有極大開發(fā)應用潛力。