集賢，張平*，朱志強(qiáng)，李志文，商佳胤，魏雅純

（1. 國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心（天津）/天津市林業(yè)果樹(shù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2. 天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384；3. 天津市設(shè)施農(nóng)業(yè)研究所，天津 301700）

葡萄品種按用途可分為鮮食、釀酒、制干、制汁等加工品種，中國(guó)是世界上葡萄較早栽培地之一。目前，中國(guó)栽培較多的鮮食品種有：‘巨峰’‘紅地球’‘玫瑰香’‘無(wú)核白’‘夏黑’等。葡萄不僅味美可口，而且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高。葡萄中的多種果酸有助于消化，適當(dāng)多吃些葡萄，能健脾和胃。

近些年，隨著市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)的逐漸加快，對(duì)于葡萄的需求量也越來(lái)越大，市場(chǎng)供應(yīng)期相應(yīng)延長(zhǎng)，因此對(duì)鮮食葡萄的貯藏保鮮技術(shù)提出了更高的要求。葡萄灰霉病，病原菌為灰葡萄孢，寄生范圍廣泛，腐生能力強(qiáng)，是目前葡萄采后貯藏運(yùn)輸過(guò)程中主要病害之一。因?yàn)樵摼诘蜏貤l件（-0.5 ℃）仍能生長(zhǎng)繁殖，因此充分了解不同品種采后對(duì)灰霉病的抗病性以及對(duì)果實(shí)的侵染規(guī)律，可以有效地控制采后病害的發(fā)生，為葡萄采后貯運(yùn)保鮮提供理論基礎(chǔ)。

在葡萄采后運(yùn)輸貯藏過(guò)程中，環(huán)境因子對(duì)生物的生長(zhǎng)影響較大[1-2]，溫度是影響果品質(zhì)量最重要的因素之一，能夠直接影響果蔬的生理活性。溫控技術(shù)應(yīng)用廣泛且歷時(shí)已久，早期的窖藏、現(xiàn)代的冷庫(kù)貯藏等都是采用控制貯藏溫度的方法來(lái)延長(zhǎng)果蔬貯藏期的。而隨著科學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，貯藏保鮮技術(shù)也在不斷更新，如今溫控技術(shù)在果蔬貯藏調(diào)控方面的應(yīng)用已非常成熟。近年來(lái)，關(guān)于溫度的貯藏技術(shù)包括低溫貯藏技術(shù)[3]、變溫貯藏技術(shù)[4]及冰溫貯藏技術(shù)[5]已廣泛用于果蔬貯運(yùn)活動(dòng)中。

本試驗(yàn)采用有傷接種和無(wú)傷接種兩種方式，系統(tǒng)研究不同貯藏溫度對(duì)3個(gè)葡萄品種接種菌落直徑和發(fā)病率的影響，充分了解溫度對(duì)不同品種葡萄果實(shí)采后灰霉病的發(fā)病規(guī)律，了解不同葡萄品種對(duì)采后灰霉病的抗病性差異，為有效指導(dǎo)采后貯藏生產(chǎn)實(shí)踐和保鮮技術(shù)理論充分發(fā)揮實(shí)際作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試葡萄：葡萄品種選擇‘玫瑰香’‘巨峰’和‘紅地球’，2015年9月分別購(gòu)于天津市漢沽茶淀鎮(zhèn)、河北石家莊晉州市葡萄園、河北張家口市。

儀器：高壓滅菌鍋、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、高速冷凍離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、水浴鍋、塑料密封盒等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 灰霉菌的分離和提純

參照方中達(dá)[6]法，將發(fā)病葡萄表面菌絲在超凈工作臺(tái)上接入到PDA培養(yǎng)基中，放入恒溫培養(yǎng)箱不斷分離純化培養(yǎng)，直至在顯微鏡下觀察到提純的灰霉菌。

1.2.2 不同溫度下灰霉病菌對(duì)葡萄果實(shí)致病性的影響

（1）有傷接種。在超凈工作臺(tái)中，將分離純化后的灰霉菌PDA平板用燒熱的打孔器打滿3 mm的菌餅備用。選取大小整齊、無(wú)損傷的帶柄葡萄果粒，將實(shí)心桿燒熱刺傷果粒（直徑3 mm，深度5 mm），滅菌濾紙吸干溢出果汁，并接入直徑3 mm的菌餅。每果粒接種一個(gè)菌碟，每種溫度接種處理20粒左右（以占滿密封盒為準(zhǔn)），放入墊有無(wú)菌紗布的滅菌密封盒中。設(shè)置3個(gè)重復(fù)，于0 ℃、10 ℃、25 ℃下貯藏。從第2天開(kāi)始，每天觀察發(fā)病情況，用游標(biāo)卡尺測(cè)量菌餅直徑并記錄，連續(xù)觀察7 d。

（2）無(wú)傷接種。在超凈工作臺(tái)中，將分離純化后的灰霉菌PDA培養(yǎng)基用燒熱的打孔器打10個(gè)10 mm的菌餅，放入滅菌的錐形瓶中，加入200 mL無(wú)菌水，震蕩1 h制成孢子懸浮液。選取大小整齊、無(wú)損傷的帶柄葡萄果粒浸入孢子懸浮液中，取出后自然晾干。每種溫度接種處理20粒左右（以占滿密封盒為準(zhǔn)），放入墊有無(wú)菌紗布的滅菌密封盒中。設(shè)置3個(gè)重復(fù)，于0 ℃、10 ℃、25 ℃下貯藏。從第2天開(kāi)始，每天觀察發(fā)病情況，記錄連續(xù)拍照觀察7 d。隔幾天用液氮凍樣一次，共3次。葡萄果粒出現(xiàn)凹陷、長(zhǎng)出灰霉菌計(jì)為發(fā)病果粒。計(jì)算發(fā)病葡萄果粒所占每盒總個(gè)數(shù)的百分?jǐn)?shù)含量，即發(fā)病率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯溫對(duì)有傷接種果實(shí)病斑直徑的影響

由圖1所示，從菌落生長(zhǎng)趨勢(shì)來(lái)看，3個(gè)品種有傷接種變化趨勢(shì)類似，10 ℃和25 ℃貯藏條件下，隨著貯藏期的延長(zhǎng)，果實(shí)上菌落直徑均呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)；而0 ℃貯藏條件下，菌落的生長(zhǎng)完全受到抑制。從菌落直徑的比較來(lái)看，0 ℃貯藏條件下，培養(yǎng)至7 d，由于菌落生長(zhǎng)完全受到低溫的抑制，菌落直徑生長(zhǎng)量為0，極顯著（P＜0.01）低于其余兩個(gè)溫度處理；10 ℃貯藏條件下，菌落直徑均極顯著（P＜0.01）小于25 ℃溫度處理。

圖1的分析結(jié)果可以明顯得出，隨著貯藏溫度的降低，有傷接種于各個(gè)品種果實(shí)上的灰霉菌生長(zhǎng)均會(huì)受到不同程度的抑制，當(dāng)貯藏溫度降至0 ℃時(shí)，7 d內(nèi)3個(gè)品種果實(shí)上接種的灰霉菌均停止生長(zhǎng)。從不同品種灰霉菌對(duì)溫度變化的耐受性來(lái)看，當(dāng)貯溫從25 ℃降至10 ℃，‘玫瑰香’接種的灰霉菌菌落直徑變化相對(duì)較小，因此其上接種灰霉菌對(duì)溫度變化的耐受性更強(qiáng)，說(shuō)明‘玫瑰香’葡萄品種更易感病。

圖1 不同貯溫對(duì)有傷接種果實(shí)病斑直徑的影響Table 1 The effect of disease spot diameter of damage inoculation on fruit in different storage temperature

2.2 不同貯溫對(duì)無(wú)傷接種果實(shí)灰霉病發(fā)病率的影響

由圖2所示，從菌落生長(zhǎng)趨勢(shì)來(lái)看，隨著貯藏期的延長(zhǎng)，25 ℃貯藏條件下的發(fā)病率總體上呈先驟然增加后緩慢增加的趨勢(shì)；10 ℃貯藏條件下，發(fā)病率除‘玫瑰香’葡萄與25 ℃的發(fā)病率相差不大外，總體呈逐漸增加的趨勢(shì)；而0 ℃貯藏條件下，菌落的生長(zhǎng)完全受到抑制。從發(fā)病率上來(lái)看，0 ℃貯藏條件下，培養(yǎng)至7 d，其發(fā)病率為0，極顯著（P＜0.01）低于其余兩個(gè)溫度處理；10 ℃貯藏條件下，‘玫瑰香’在培養(yǎng)1～3 d時(shí)菌落直徑接近25 ℃處理，在其余的貯藏時(shí)間內(nèi)，菌落直徑均小于25 ℃溫度處理；‘巨峰’僅在培養(yǎng)第1天、第2天和第6天時(shí)菌落直徑接近于25 ℃處理，而‘紅地球’在第4天時(shí)菌落直徑接近于25 ℃處理，在其余的貯藏時(shí)間內(nèi)，菌落直徑均顯著（P＜0.05）小于10 ℃處理。

圖2 不同貯溫對(duì)無(wú)傷接種果實(shí)灰霉病發(fā)病率的影響Table 2 The effect of Botrytis cinerea incidence by non-damage inoculation in different storage temperature on fruit

圖2的分析結(jié)果得出，隨著貯藏溫度的降低，無(wú)傷接種的‘玫瑰香’‘紅地球’果實(shí)上的灰霉菌生長(zhǎng)均受到不同程度的抑制。‘玫瑰香’和‘巨峰’在25 ℃下發(fā)病率低于‘紅地球’，但‘紅地球’葡萄在10 ℃下發(fā)病率最低。當(dāng)貯藏溫度降至0 ℃時(shí)，7 d內(nèi)3個(gè)品種葡萄果實(shí)上接種的灰霉菌均停止生長(zhǎng)。

2.3 不同貯溫對(duì)自然發(fā)病條件下葡萄灰霉病發(fā)病率的影響

自然狀態(tài)下，不同貯溫對(duì)采后灰霉病發(fā)病率的影響如圖3所示。從生長(zhǎng)趨勢(shì)來(lái)看，隨著貯藏期的延長(zhǎng)，25 ℃貯藏條件下，灰霉病發(fā)病率總體上呈增加的趨勢(shì)，而‘玫瑰香’葡萄發(fā)病率增加的最快，‘紅地球’葡萄增加的最慢；10 ℃貯藏條件下，發(fā)病率總體呈逐漸增加的趨勢(shì)，但‘玫瑰香’后期增加迅速；而0 ℃貯藏條件下，菌落的生長(zhǎng)完全受到抑制。從發(fā)病率上來(lái)看，0 ℃貯藏條件下，培養(yǎng)至7 d，由于菌落生長(zhǎng)完全受到低溫的抑制，其發(fā)病率幾乎為0，極顯著（P＜0.01）低于其余兩個(gè)溫度處理；10 ℃貯藏條件下，發(fā)病率均顯著（P＜0.05）小于25 ℃溫度處理。

圖3的分析結(jié)果可以得出，隨著貯藏溫度的降低，無(wú)傷接種于‘玫瑰香’‘巨峰’‘紅地球’果實(shí)上的灰霉菌生長(zhǎng)均會(huì)受到不同程度的抑制。模擬自然狀態(tài)下生長(zhǎng)的灰霉菌，25 ℃時(shí)‘玫瑰香’的發(fā)病率最高，‘巨峰’在25 ℃和10 ℃下發(fā)病率相近，第5天后增長(zhǎng)緩慢。在0 ℃下，3個(gè)葡萄品種發(fā)病率均為零。

圖3 不同貯溫對(duì)自然條件下葡萄灰霉病發(fā)病率的影響Table 3 Effects of Botrytis cinerea incidence on under natural conditions in different storage temperatures

3 討論與結(jié)論

有傷接種模擬在運(yùn)輸過(guò)程中有擠壓裂果的情況下灰霉病菌對(duì)果實(shí)的侵染狀況。結(jié)果表明，有傷接種灰霉病菌顯著增長(zhǎng)，無(wú)傷接種灰霉菌的增長(zhǎng)高于自然狀態(tài)下發(fā)病率。在運(yùn)輸中，應(yīng)采取低溫貯藏的方法，并且做好防止裂果的工作，可以在一定程度上抑制灰霉菌的生長(zhǎng)。

貯藏溫度是影響灰霉菌生長(zhǎng)繁殖的重要因子之一[7]，本試驗(yàn)研究得出以下結(jié)論：‘玫瑰香’‘巨峰’‘紅地球’葡萄在0 ℃的兩種接種方法下，觀察期內(nèi)并未發(fā)病，而在10 ℃和25 ℃下灰霉菌有明顯的生長(zhǎng)繁殖現(xiàn)象，菌斑直徑顯著增大?？梢?jiàn)低溫有效抑制灰霉病的發(fā)生與生長(zhǎng)。本研究結(jié)果也印證了葡萄最適貯藏溫度普遍認(rèn)為是0～-1 ℃[8-10]的結(jié)論，同時(shí)也與前期本課題組低溫能夠很好地抑制灰霉病菌孢子的研究相呼應(yīng)[11]。低溫條件下灰霉病對(duì)果實(shí)的侵染率低，與低溫可以降低果實(shí)的呼吸速率和抑制酚類物質(zhì)的增加有關(guān)[12]，同時(shí)也與低溫條件能顯著減少葡萄果肉和果皮抗氧化組分含量的下降，可以維持果實(shí)較高的自由基清除能力有關(guān)[13]。