許映雪 尹煥才

（1. 中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，蘇州 215163；2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

細(xì)胞外基質(zhì)對于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要，它們通常分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間，是由細(xì)胞合成并分泌到胞外的大分子，主要是一些多糖和蛋白，或蛋白多糖。這些物質(zhì)構(gòu)成復(fù)雜網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，支持并連接組織結(jié)構(gòu)，參與細(xì)胞的各種生理活動。在炎癥、腫瘤等病理情況下，正常的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞，進(jìn)一步加劇炎性細(xì)胞浸潤、腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移等病理進(jìn)程，這些病理進(jìn)程通常與基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）息息相關(guān)［1］。

迄今為止，在人體中已發(fā)現(xiàn)超過20種MMPs。MMPs作為一類Zn2+依賴性內(nèi)切酶家族，是分解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶類中最重要的一類。根據(jù)其降解底物的不同，可將人源性MMPs分為膠原酶類（MMP-1、-8、-13和 -18）、明膠酶類（MMP-2和 -9）、間質(zhì)溶解素（MMP-3、-10和 -11）、膜型MMPs（MMP-14、-15、-16、-17、-24 和 -25）及其他MMPs五大類［2］。正常生理條件下，MMPs活性很低并受到轉(zhuǎn)錄水平上的嚴(yán)格調(diào)控，同時受到金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）的調(diào)節(jié)，其以酶原的形式被分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中，被激活后特異性作用于細(xì)胞外基質(zhì)［3］。而在某些疾病病程中MMPs活性卻顯著增強，如動脈粥樣硬化、腎炎、纖維素炎等［4］。

MMP-9，又稱明膠酶B，是MMPs家族中相對分子質(zhì)量最大的酶，其基因定位于20q11.2-13.1［5］，可由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及多種腫瘤細(xì)胞分泌［6］，其表達(dá)受到多種正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子及生長因子的調(diào)控，如白介素［7-9］、干擾素［10］、EGF［11］、NGF［12］、FGF［13］、VEGF［14］、PDGF［15］、TGF-β［16-18］等，其活化形式的作用底物也十分廣泛，包含明膠、部分類型的膠原蛋白，彈性蛋白以及層粘連蛋白等。MMP-9的主要結(jié)構(gòu)包括MMPs家族共有的氨基端前肽區(qū)、羧基端類血紅蛋白結(jié)構(gòu)域和一個高度保守的含有Zn2+結(jié)合位點的催化區(qū)，其催化區(qū)還有一個能與明膠及纖維蛋白高度親和的嵌入式區(qū)域［19］。正常生理條件下，MMP-9與其他MMPs協(xié)同作用，共同參與正常組織的發(fā)育及重塑，如胚胎發(fā)育、血管生成、骨骼塑型、傷口愈合等，另一方面也通過破壞局部組織結(jié)構(gòu)和基膜屏障，促進(jìn)腫瘤新生血管的形成和腫瘤生長，利于腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等病理過程［20-21］。

目前，市場上已有的MMP-9抗體產(chǎn)品中，國外單克隆抗體占據(jù)主要市場，但因其價格較為昂貴，臨床大批量使用成本較高。國內(nèi)的MMP-9抗體以多克隆抗體為主，且只用于科研使用，尚未出現(xiàn)臨床產(chǎn)品。本研究旨在初步開發(fā)MMP-9單抗臨床試劑盒，為MMP-9的腫瘤臨床篩查應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人源cDNA為本實驗室保存，TOP10和BL21（DE3）為本實驗室保存。Taq DNA聚合酶及其相應(yīng)的PCR反應(yīng)用試劑購自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶BamHI、XhoI、T4 DNA連接酶及其相關(guān)試劑購自 Fermentas公司；1.5 kb DNA ladder marker、PCR產(chǎn)物純化和DNA片段膠回收試劑盒購自Axygen公司；TIANprep快速質(zhì)粒小提試劑盒（離心柱型）購自北京天根生物技術(shù)公司；HRP交聯(lián)的兔抗鼠二抗購自Rockland公司；化學(xué)發(fā)光底物檢測試劑購自Millipore公司；胎牛血清（Fetal Bovine Serum）、胰酶Trypsin-EDTA購自GIBCO公司；HAT培養(yǎng)基購自Sigma公司；基因合成測序由上海生工生物工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1 MMP-9蛋白的抗原表位預(yù)測及引物設(shè)計 通過uniport數(shù)據(jù)庫獲取MMP-9基因全長序列，利用DNAstar-Protean、PBD對其跨膜區(qū)、親水性等性質(zhì)進(jìn)行分析，篩選其抗原表位區(qū)，命名為Δmmp9。通過分析抗原表位區(qū)序列，釣取最終目的基因的片段，設(shè)計引物序列，并在5′端和3′端分別引入BamH I和XhoI的酶切位點。

1.2.2 重組表達(dá)載體pET28α（+）-Δmmp9構(gòu)建 以人源cDNA為模板，以人工合成引物擴(kuò)增目的片段，引物序列為Primer1：5′-CGGGATCCATGCAGGACGG CAATGCTGAT -3′（下劃線序列為BamH I酶切位點），Primer2 ：5′-CGCTCGAGCGCCACGAGGAACAAACT-3′（下劃線序列為XhoI酶切位點）。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件 ：94℃ 5 min ；94℃ 1 min，56℃ 30 s，72℃ 45s，40個循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物與原核表達(dá)載體pET28α（+）質(zhì)粒用BamHI和XhoI進(jìn)行雙酶切，將兩者的雙酶切產(chǎn)物用T4 DNA連接酶連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到TOP10，篩選陽性克隆，提取重組表達(dá)載體pET28α（+）-Δmmp9后送往上海生工測序。

1.2.3 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 將分析結(jié)果正確的重組載體 pET28α（+）-Δmmp9 轉(zhuǎn)化至 BL21（DE3），選用終濃度為1 mmol/L的IPTG，37℃，220 r/min，誘導(dǎo)4 h，陰性對照組不加IPTG誘導(dǎo)劑。5 000 r/min 10 min，棄上清，收集菌體沉淀，并用PBS溶液重懸，冰浴超聲，參數(shù)為time 20 min，pluse 5 s，超聲5 s，功率39%。超聲后4℃，16 000 r/min 1 h，分別收集并標(biāo)記上清液及沉淀。用包涵體溶解液溶解沉淀，分別取上清液和包涵體溶解液的樣品進(jìn)行SDSPAGE電泳驗證，分析結(jié)果。

1.2.4 重組蛋白擴(kuò)增培養(yǎng)及純化 將上步含有重組載體 pET28α（+）-Δmmp9的 BL21（DE3）菌液及時擴(kuò)增培養(yǎng)，按照同樣誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體沉淀，重懸后冰浴超聲破碎，離心取沉淀，溶解后離心取上清液，此上清液即為溶解的重組蛋白。過0.22 μm膜后用Ni柱純化，將洗脫液咪唑濃度按照 100 μmol/L → 300 μmol/L → 500 μmol/L 梯度調(diào)節(jié)，保留流穿樣品及純化樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳驗證。按照電泳結(jié)果將含目的蛋白的洗脫液進(jìn)行透析復(fù)性、超濾濃縮，過濾除菌后-80℃保存。

1.2.5 重組蛋白免疫小鼠 將純化后的重組蛋白作為抗原與弗氏完全佐劑1∶1混合，對5只7-10周齡的BALB/c小鼠按照常規(guī)免疫程序進(jìn)行首免，首免抗原濃度為1 mg/mL，免疫劑量為0.1 mL/只。二免-四免抗原與弗氏不完全佐劑混合，抗原濃度為0.5mg/mL，免疫劑量為0.1 mL/只，首免后第21 d進(jìn)行二免，二免到三免，三免到四免間隔時間為14 d。四免后第7 d小鼠眼眶采血，10 000 r/min 10 min，取上清做抗體檢測時的陽性對照，陰性對照取免疫前小鼠血清。

1.2.6 單克隆雜交瘤細(xì)胞株的建立及篩選 已經(jīng)免疫的BALB/c小鼠無菌條件下摘取脾臟，制成脾細(xì)胞懸液，與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按5∶1比例混合，采用PEG1500作為融合劑，按照常規(guī)融合方法。待細(xì)胞集落長至孔底1/2時吸出所有克隆生長孔的上清用間接ELISA法進(jìn)行抗體檢測，挑取特異性好的陽性孔及時凍存和克隆化，篩選出單克隆細(xì)胞株。

1.2.7 腹水制備、純化及效價檢測 取3-6只BALB/c小鼠提前7 d腹腔注射滅菌液體石蠟，0.5mL/只，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整待接種的雜交瘤細(xì)胞密度至8×105個/mL，腹腔注射，1 mL/只。密切觀察小鼠的腹水征象，每隔1-3 d取一次腹水。用親和層析柱純化腹水，收集純化的單抗，用間接ELISA法進(jìn)行抗體效價測定。

1.2.8 配對單抗的篩選 采用雙抗夾心ELISA法篩選配對抗體。從得到的單抗中取出兩種單抗，一種作為捕獲抗體，一種作為標(biāo)記抗體（經(jīng)過HRP酶標(biāo)記），將捕獲抗體包被抗原板，加入稀釋的重組蛋白作為抗原，再加標(biāo)記抗體，最后加入顯色液顯色。根據(jù)配對實驗結(jié)果調(diào)整后續(xù)配對實驗，最終篩選出合適的配對抗體并確定其有效工作濃度。

2 結(jié)果

2.1 MMP-9蛋白的抗原表位預(yù)測

通過uniport數(shù)據(jù)庫獲取MMP-9基因信息，其數(shù)據(jù)顯示該蛋白經(jīng)成熟化后，包含的氨基酸序列為第94-707位，為了避免產(chǎn)生針對信號肽和前導(dǎo)肽的抗體副產(chǎn)物而影響最終抗體的總效價，重組蛋白抗原的最終片段必須包括第94-707位氨基酸中。通過DNAstar-Protean軟件分析重組蛋白的氨基酸序列分布情況，預(yù)測結(jié)果（圖1-A）表明：該蛋白主要以親水性氨基酸為主，α螺旋結(jié)構(gòu)較少，該蛋白整體親水性較強，選取該蛋白中親水性較強又具有較小空間位阻的氨基酸序列區(qū)段，通過該蛋白現(xiàn)有的不完全晶體結(jié)構(gòu)利用PBD等數(shù)據(jù)庫同源建模得到MMP-9蛋白的空間立體結(jié)構(gòu)圖（圖1-B）表明：該蛋白具有一個較長的信號肽末端，同時含有4個明顯的二級結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)之間有幾條完全暴露在外的強親水性的氨基酸序列?；谝陨闲畔?，選取包含暴露在二級結(jié)構(gòu)外的、具有較強親水性的多肽序列，即包括第288-389位氨基酸的多肽序列（圖1-C），即選取包含第278-399位氨基酸多肽作為最終基因釣取片段，命名為Δmmp9。

2.2 重組表達(dá)載體pET28α（+）-Δmmp9構(gòu)建

以人源cDNA為模板，以人工合成的引物擴(kuò)增目的基因片段，結(jié)果（圖2-A）顯示該片段大小為581 bp，質(zhì)粒pET28α（+）大小為5 369 bp，重組表達(dá)載體pET28α（+）-Δmmp9轉(zhuǎn)化抽提后，使用BamH I和XhoI進(jìn)行雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果（圖2-B）顯示有2條DNA條帶，分別獲得581 bp的目的基因和5 369 bp的載體片段。將基因測序的結(jié)果與NCBI中MMP-9序列對比，無堿基突變，表明目的基因片段已正確插入pET28α（+）載體中。

2.3 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

重組表達(dá)載體 pET28α（+）-Δmmp9轉(zhuǎn)化至BL21（DE3），以終濃度為1 mmol/L的IPTG，37℃，220 r/min，誘導(dǎo)表達(dá)4 h。離心取菌體沉淀冰浴超聲破碎，高速離心分離上清液和包涵體，對其進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果（圖3）顯示包涵體樣品中在15 kD左右有一條清晰明顯的深色條帶，其蛋白大小與預(yù)期重組蛋白大小一致，證明該蛋白即為重組蛋白Δmmp9，且在BL21的包涵體中表達(dá)成功。

圖1 抗原表位區(qū)預(yù)測

圖2 重組表達(dá)載體pET28α（+）-Δmmp9鑒定

2.4 重組蛋白擴(kuò)增培養(yǎng)及純化

將含有重組載體pET28α（+）-Δmmp9的BL21（DE3）菌液擴(kuò)增培養(yǎng)，按照同樣誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體沉淀，重懸后冰浴超聲破碎，離心取沉淀，溶解后離心取上清液，過0.22 μm膜后用Ni柱純化，保留流穿樣品、純化樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳驗證，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)在流穿樣品中含有很少的重組蛋白，300 μmol/L咪唑洗滌液洗脫重組蛋白效果最好，可見15 kD處有明顯條帶，純化成功。

2.5 單克隆雜抗體交瘤細(xì)胞株建立

取免疫后小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，通過PEG1500融合獲得雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過HAT培養(yǎng)基初步篩選培養(yǎng)，對陽性孔采取有限稀釋法挑選單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，最終獲得7株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為C3B3B11、D10D8、B4-4、D6G7、5-9、B8C5G10 及 A6A10。

2.6 腹水制備及效價檢測

BALB/c小鼠依次標(biāo)記并接種7株雜交瘤細(xì)胞株后，收集腹水，經(jīng)過親和柱層析法對抗體進(jìn)行純化，通過間接ELISA法對收集的7種純化抗體進(jìn)行效價檢測，結(jié)果（圖5）顯示7種單克隆抗體效價均在1∶240 000以上，符合要求。

圖3 重組蛋白Δmmp9的誘導(dǎo)表達(dá)

圖4 重組蛋白純化

2.7 配對單抗的篩選

采用雙抗夾心ELISA法篩選配對抗體。首先選擇C3B3B11作為捕獲抗體，分別以1∶5 000和1∶10 000的稀釋度包板，標(biāo)記抗體為HRP標(biāo)記后的7種單抗，標(biāo)記抗體以1∶10 000和1∶50 000稀釋，其他抗體對以此類推。初步配對實驗結(jié)果為：B4-4與其他6種單抗都有配對可能，可作為捕獲抗體，其他抗體作為其標(biāo)記抗體；D6G7與C3B3B11、5-9、A6A10有配對可能，D6G7可作為捕獲抗體，C3B3B11、5-9、A6A10可作為其標(biāo)記抗體；B8C5G10與C3B3B11、5-9、A6A10有配對可能，B8C5G10可作為捕獲抗體，C3B3B11、5-9、A6A10可作為其標(biāo)記抗體。

后續(xù)調(diào)整配對實驗條件，對3種捕獲抗體及其配對標(biāo)記抗體的工作濃度進(jìn)一步調(diào)整，結(jié)果見圖6。圖6-A顯示，B4-4以1∶2 000作為捕獲抗體包板效果較好，其配對的標(biāo)記抗體稀釋度依次為 ：C3B3B11-HRP 為 1∶5 000-1∶10 000；5-9-HRP為 1∶5 000-1∶10 000；A6A10-HRP為 1∶5 000；B8C5G10-HRP為1∶5 000；D10D8-HRP為1∶5 000-1∶10 000。圖6-B顯示，D6G7以1∶1 000-1∶2 000包板效果較好，其配對的標(biāo)記抗體稀釋度依次為：C3B3B11-HRP為1∶5 000-1∶10 000；5-9-HRP為1∶1 000-1∶5 000；A6A10-HRP為1∶1 000-1∶5 000。圖6-C顯示，B5C5G10以1∶5 000包板效果較好，其配對的標(biāo)記抗體稀釋度依次為：C3B3B11-HRP為 1∶5 000-1∶10 000；5-9-HRP為1∶5 000-1∶10 000；A6A10-HRP 為 1∶5 000。

圖5 7種純化單克隆抗體效價

3 討論

近年來的臨床研究表明，MMP-9可以作為部分癌癥發(fā)展和轉(zhuǎn)移的指標(biāo)，甚至對一些癌癥和疾病具有預(yù)后診斷參考價值。王璐、王小俠等［22-23］對胃癌的臨床研究表明MMP-9高表達(dá)對腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移都具有促進(jìn)作用。高晨［24］的研究也指出MMP-9基因表達(dá)水平有作為原發(fā)性肝癌復(fù)發(fā)、侵襲和轉(zhuǎn)移指標(biāo)的可能，同時部分臨床研究表明MMP-9有可能成為監(jiān)測慢性阻塞性肺疾病嚴(yán)重程度及惡化的更精確的指標(biāo)［25］。有研究證明通過監(jiān)測血清中MMP-9和TIMP-1的表達(dá)不止有助于確定乳腺癌的轉(zhuǎn)移情況［26］，對結(jié)直腸癌的預(yù)后診斷也有一定價值［27］。單體臻等［28］的臨床研究表明血清中MMP-2、MMP-9水平可成為阿爾茨海默病診斷的參考因子。在子宮內(nèi)膜癌的研究中，尿激酶型纖溶酶原激活劑（UPA）與MMP-9在子宮內(nèi)膜癌組織的陽性表達(dá)率顯著高于正常子宮內(nèi)膜組織（P＜0.05），且兩者表達(dá)水平正相關(guān)，提示臨床聯(lián)合檢測二者有可能為評估子宮內(nèi)膜癌病變程度提供參考［29］。在膀胱移行細(xì)胞癌研究中，骨橋蛋白（OPN）和MMP-9在膀胱組織中表達(dá)升高與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，檢測OPN和MMP-9對膀胱移行細(xì)胞癌的診斷和預(yù)后判斷具有重要參考價值［30］。因此，在臨床上MMP-9有作為新型腫瘤診斷標(biāo)記的潛能。

圖6 配對抗體稀釋度判定結(jié)果

本研究通過uniport數(shù)據(jù)庫獲取MMP-9基因序列，運用生物信息學(xué)的方法通過DNAstar-Protean、PBD分析其跨膜區(qū)、親水性、表面可及性、抗原指數(shù)［31-32］，預(yù)測出其抗原表位區(qū)。構(gòu)建原核重組表達(dá)載體，經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)得到符合預(yù)期的重組蛋白Δmmp9，并獲得能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的7株雜交瘤細(xì)胞株，效價均能達(dá)到1∶240 000，效價優(yōu)于abcam公司的MMP-9單克隆抗體（https：//www.abcam. cn/mmp9-antibody-5g3-ab119906-references.html#active-tab.）。運用雙抗夾心ELISA法將所得7種單抗進(jìn)行配對抗體篩選，篩選出能與重組蛋白Δmmp9同時結(jié)合的配對抗體，下一步研究工作將采用醫(yī)院臨床樣本驗證優(yōu)化篩選出的配對抗體。本研究中的Δmmp9抗體可采用雙抗夾心法對不同類型樣本中MMP-9進(jìn)行定性或定量檢測，為研發(fā)MMP-9的臨床檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測MMP-9的抗原表位區(qū)，構(gòu)建原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌BL21（DE3）中實現(xiàn)高效表達(dá)。通過純化其重組蛋白，免疫動物、單克隆篩選獲得7株穩(wěn)定分泌單抗的雜交瘤細(xì)胞株，檢測其單抗效價均達(dá)到1∶240 000。通過抗體配對實驗，得到3種捕獲抗體及其對應(yīng)的標(biāo)記抗體，且確定了其有效工作濃度。