劉曉紅,王菊梅*,閆倫春,單慧明,譚壯忱,楊立波
長(zhǎng)期過(guò)度飲酒會(huì)使肝細(xì)胞反復(fù)發(fā)生脂肪變性甚至壞死,同時(shí)導(dǎo)致酒精性肝損傷,最終導(dǎo)致肝癌[1]。使用保肝藥物可以有效緩解酒精肝,但是大量使用藥物會(huì)對(duì)腎臟等其他器官造成較大的負(fù)擔(dān)。補(bǔ)充維生素、礦物質(zhì)等可以提高自身免疫力達(dá)到緩解酒精性肝損傷功效[2]。茶花粉水提物的成分復(fù)雜,包含有蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類(lèi)、脂類(lèi)、維生素、微量元素及大量的生物活性物質(zhì)[3],服用茶花粉水提物可以補(bǔ)充蛋白質(zhì)、脂肪充維生素、礦物質(zhì)等有效緩解酒精性肝損傷[4]。目前對(duì)茶花粉水提物成分的研究較多,但有關(guān)茶花粉水提物對(duì)酒精肝的影響的研究相對(duì)較少。本文旨在研究茶花粉水提物對(duì)酒精性肝損傷大鼠模型肝臟組織中膠原蛋白Ⅰ(collagen, type I, alpha 1,COL1A1)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)表達(dá)水平的影響,以期了解茶花粉水提物對(duì)酒精性肝損傷大鼠模型肝臟組織中COL1A1、α-SMA表達(dá)水平的作用機(jī)理,從而為酒精性肝損傷的治療提供一定的理論依據(jù)。
選取60只雄性SD大鼠,體重200±30 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2017-0022,分12個(gè)籠子飼養(yǎng),每個(gè)籠子5只。在本院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室,飼養(yǎng)溫度20~25 ℃,相對(duì)濕度50%~65%,無(wú)噪音條件下自由飲水進(jìn)食。
茶花粉水提物購(gòu)自揚(yáng)州同人生物工程有限公司;谷丙轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒購(gòu)自上海恪敏生物科技有限公司、超氧化物歧化酶試劑盒及丙二醛試劑盒均購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司;COL1A1和α-SMA抗體購(gòu)自武漢博士得生物有限公司;中性福爾馬林、酒精、二甲苯購(gòu)自天津科密歐有限公司;紅星二鍋頭購(gòu)自武商量販。
BS-124s 型電子天平購(gòu)自北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司;TDL-5 型臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠;光學(xué)顯微鏡購(gòu)自東莞市同創(chuàng)儀器有限公司;切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司;低溫離心機(jī)購(gòu)自湖南恒諾離心機(jī)有限公司;蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。
大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后,使用 56°紅星二鍋頭灌胃,第一周灌胃計(jì)量為:6 mL/kg;第二周灌胃計(jì)量為:8 mL/kg;第三周灌胃計(jì)量為:10 mL/kg,第四至十周灌胃劑量為:11 mL/kg。具體造模方法和判斷模型是否成功參考梁惠等[5]研究。
60只FPS級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組,每組15只,其中45只大鼠制成酒精性肝損傷模型,建立模型和判斷模型是否建立成功參考梁惠等[5]研究。將制成模型的大鼠分為模型組、低劑量茶花粉水提物組和高劑量茶花粉水提物組,剩下15只作為對(duì)照組;低劑量茶花粉水提物組大鼠使用50 mg/kg·d-1的茶花粉水提物灌胃,高劑量茶花粉水提物組大鼠使用100 mg/kg·d-1的茶花粉水提物灌胃,對(duì)照組和模型組分別以等量的生理鹽水灌胃處理,每天一次,持續(xù)21 d。
2.3 1 測(cè)量大鼠肝臟質(zhì)量并計(jì)算肝指數(shù)
使用脊椎脫臼法處死大鼠后,取大鼠肝臟并準(zhǔn)確稱(chēng)量大鼠肝臟質(zhì)量,計(jì)算大鼠肝指數(shù)。
2.3.2 檢測(cè)大鼠血清ALT、AST水平、肝組織SOD、MAD水平
藥物治療結(jié)束后24 h,給予3%戊巴比妥鈉(生產(chǎn)廠家:上海依赫生物科技有限公司;生產(chǎn)批號(hào):20180212)麻醉,腹主動(dòng)脈取血0.5 mL,使用離心分離血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic pyruvic transaminase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase,AST)試劑盒子檢測(cè)其ALT及AST水平,操作方法嚴(yán)格按照試劑盒子說(shuō)明書(shū)操作。
取大鼠肝組織,在冷生理鹽水中漂洗后濾紙拭干。加入肝組織重量9倍的生理鹽水并置入勻漿器中在冰水中勻漿5 min,使用恒溫離心機(jī)在4℃、3 000 r/min條件下離心10 min。分別吸取0.1 mL上清液,嚴(yán)格按照超氧化物歧化酶(total superoxide disumutase,T-SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒子說(shuō)明書(shū)上的操作方法測(cè)定SOD活性和MDA含量。
2.3.3 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)水平
按照Western blot 檢測(cè)方法操作,使用蛋白質(zhì)條帶用掃描儀進(jìn)行掃描,以β-actin為內(nèi)參,應(yīng)用Imagaquent 5.1軟件對(duì)COL1A1和α-SMA蛋白質(zhì)條帶灰度進(jìn)行相對(duì)定量分析。以目的蛋白條帶與 β-actin 灰度比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次,取平均值為最終結(jié)果。
2.3.4 HE染色觀察大鼠肝組織
使用HE染色,具體步驟為:使用二甲苯浸泡10~15 min,分別使用100%、95%、80%、70%、50%酒精的酒精依次沖洗2~3 min,使用蒸餾水沖洗1 min后使用蘇木精浸泡10~15 min,再使用蒸餾水沖洗20 min。使用鹽酸酒精分化后再次使用水沖洗10~20 min后使用氨水沖洗一次,在此重復(fù)酒精沖洗過(guò)程(100%、95%、80%、70%、50%酒精的酒精依次沖洗2~3 min),完成后使用伊紅染色30s后使用95%酒精Ⅰ和95%酒精Ⅱ浸泡1~2 min后再次使用100%酒精Ⅰ和100%酒精Ⅱ浸泡10~15 min,分別使用二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ浸泡10~15 min最后中性樹(shù)膠封片即可。在電子顯微鏡下使用10×40的倍鏡觀察肝組織情況。
由表1可以看出,相比對(duì)照組,模型組大鼠體質(zhì)量無(wú)顯著差異(T=0.083,P=0.935),模型組大鼠肝質(zhì)量(T=5.748,P=0.000)及肝指數(shù)(T=15.257,P=0.000)顯著升高。相比模型組,低劑量茶花粉水提物組大鼠體質(zhì)量無(wú)顯著差異(T=0.527,P=0.595),大鼠肝質(zhì)量(T=4.156,P=0.000)及肝指數(shù)(T=12.952,P=0.000)顯著降低。相比低劑量茶花粉水提物組,高劑量茶花粉水提物組大鼠體質(zhì)量無(wú)顯著差異(T=0.540,P=0.592),肝質(zhì)量(T=0.614,P=0.534)及肝指數(shù)(T=2.738,P=0.016)顯著降低。
由圖1可以看出,相比對(duì)照組大鼠血清ALT(30.21±2.32)U/L、AST(62.36±2.87)U/L、SOD(138.21±6.32)U/mL、MAD(5.81±1.08)mmol/mL,模型組大鼠血清ALT顯著升高(79.32±2.89)U/L(T=52.105,P=0.000),AST顯著升高(115.35±5.01)U/L(T=35.544,P=0.000),SOD顯著降低(70.21±29.32)U/mL(T=8.780,P=0.000);MAD顯著升高(13.01±1.80)mmol/mL(T=18.25,P=0.000)。相比模型組,低劑量茶花粉水提物組ALT顯著降低(53.21±3.21)U/L(T=23.414,P=0.000),AST顯著降低(80.37±4.01)U/L(T=21.11,P=0.000),SOD顯著升高(120.32±12.39)U/mL(T=6.097,P=0.000),MAD顯著降低(9.85±1.70)mmol/mL(T=6.076,P=0.000)。相比低劑量茶花粉水提物組,高劑量茶花粉水提物組ALT顯著降低(44.87±2.49)U/L(T=7.950,P=0.000),AST顯著降低(74.36±4.65)U/L(T=3.790,P=0.007),SOD顯著升高(135.28±8.23)(T=3.895,P=0.006),MAD顯著降低(7.72±2.31)mmol/mL(T=2.876,P=0.007)。
表1 大鼠肝臟質(zhì)量及肝指數(shù)
注:與對(duì)照組相比,**P<0.01;與模型組相比##P<0.01
圖1大鼠血清ALT、AST水平及肝組織SOD、MAD水平 與對(duì)照組相比**P<0.01;與模型組相比##P<0.01;A為各組大鼠ALT含量水平;B為各組大鼠AST含量水平;C為各組大鼠SOD含量水平;D為各組大鼠MAD含量水平
由圖2可以看出,相比對(duì)照組COL1A1和α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量(0.40±0.11)、(0.51±0.12),模型組COL1A1蛋白表達(dá)量(1.49±0.17)顯著升高(T=20.184,P=0.000),α-SMA蛋白表達(dá)量(1.50±0.16)顯著升高(T=19.171,P=0.000)。相比模型組,低劑量茶花粉水提物組COL1A1蛋白表達(dá)量(0.85±0.15)顯著降低(T=10.933,P=0.000),α-SMA蛋白表達(dá)量(1.15±0.14)顯著降低(T=6.375,P=0.000)。相比低劑量茶花粉水提物組,高劑量茶花粉水提物組COL1A1蛋白表達(dá)量(0.65±0.12)顯著降低 (T=4.032,P=0.004),α-SMA蛋白表達(dá)量(0.84±0.14)顯著降低(T=6.064,P=0.000)。
圖2大鼠肝組織COL1A1和α-SMA蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組相比**P<0.01;與模型組相比##P<0.01;A為蛋白質(zhì)印記觀察COL1A1和α-SMA蛋白表達(dá)情況;B為COL1A1和α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)情況
對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞較為完整,且細(xì)胞核清晰可見(jiàn),細(xì)胞核與細(xì)胞漿呈鮮明對(duì)比;模型組大鼠細(xì)胞出現(xiàn)較多的細(xì)胞核壞死,且細(xì)胞出現(xiàn)纖維化狀態(tài),部分細(xì)胞質(zhì)間出現(xiàn)空隙,低劑量茶花粉水提物組大鼠,細(xì)胞核出現(xiàn)壞死的數(shù)目降低,且細(xì)胞纖維化顯著降低;高劑量茶花粉水提物組大鼠肝細(xì)胞無(wú)顯著纖維化,且細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)呈鮮明對(duì)比。
近年來(lái),對(duì)花粉水提物的研究越來(lái)越多,其中茶花粉水提物因其含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和抗氧化等性質(zhì)受到廣泛的關(guān)注[6]。研究表明:花粉水提物具有降血脂、降血糖、抗動(dòng)脈粥樣硬化、治療前列腺等功效[7-8]。茶花粉水提物中含有多酚和黃酮類(lèi)化合物,這兩類(lèi)化合物是天然的抗氧化劑,可以降低人體內(nèi)的過(guò)氧化反應(yīng),對(duì)人體健康有著非常重要的作用[9]。
酒精在肝臟中的分解代謝會(huì)促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生,使得ROS在人體內(nèi)大量累積,引發(fā)肝細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化而損傷肝細(xì)胞。夏婷研究表明:氧應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化是酒精引起肝臟損傷的重要原因之一[10]??寡趸w系主要包括酶系和非酶系兩大類(lèi),酶體系中,最主要的是SOD,其含量多少可以直接反應(yīng)氧化應(yīng)激的程度[11]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),模型組大鼠體內(nèi)SOD含量顯著減少,說(shuō)明其肝臟內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)顯著增強(qiáng),使用茶花粉水提物處理后,SOD含量顯著增加,說(shuō)明其氧化應(yīng)激受到了抑制,且隨著茶花粉水提物處理濃度增加,SOD含量顯著升高,說(shuō)明茶花粉水提物可以降低大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)且隨著使用濃度增加,大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)抑制程度增加。趙高遠(yuǎn)[12]研究表明:SOD可以反映體內(nèi)氧化應(yīng)激能力的強(qiáng)弱,且升高SOD濃度可以有效抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),保護(hù)肝臟組織,與本研究得出的結(jié)論相一致。吳志剛等[13]研究表明:MAD含量增加會(huì)使得肝內(nèi)大量脂質(zhì)沉積并且會(huì)使得機(jī)體的抗氧化能力減弱。肝細(xì)胞膜和線(xiàn)粒體膜受損,引起血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶升高,同時(shí)也會(huì)使得大鼠的肝組織游離脂肪酸水平明顯升高,誘發(fā)肝細(xì)胞死亡導(dǎo)致肝臟炎癥反應(yīng)和細(xì)胞功能障礙[14]。MAD的含量可以反映機(jī)體內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化的程度,使自由基與生物膜中的多不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)并使得氧化產(chǎn)物分解,由此可以得知MAD的含量可間接反映出細(xì)胞損傷的程度[15]。本實(shí)驗(yàn)中可以看出,模型組大鼠MAD含量顯著升高,說(shuō)明肝臟內(nèi)脂質(zhì)增加,且脂質(zhì)氧化程度較高。使用茶花粉水提物處理后大鼠肝組織中MAD含量顯著降低,說(shuō)明大鼠肝臟組織中的脂質(zhì)水平降低、脂質(zhì)氧化程度也較低,肝臟得到了有效的保護(hù),且隨著茶花粉水提物處理劑量的增加,脂質(zhì)的氧化反應(yīng)逐漸降低。彭國(guó)霞等[16]研究表明:花粉具有較強(qiáng)的抗氧化活性可以明顯改善酒精引起的肝細(xì)胞損傷,與本研究得出的結(jié)論相一致。
圖3HE染色觀察大鼠肝組織(×400) A為對(duì)照組(較為完整);B為模型組(嚴(yán)重纖維化);C為低劑量茶花粉水提物組(較輕纖維化);D為高劑量茶花粉水提物組(無(wú)顯著纖維化)
血清ALT、AST活力的大小是檢驗(yàn)肝臟損傷的重要指標(biāo)之一。劉鑫等[17]研究表明:血清ALT、AST活力的大小,直接反映了肝細(xì)胞受損的程度。本實(shí)驗(yàn)中可以看出,模型組大鼠血清ALT、AST活力顯著增加,說(shuō)明大鼠肝臟受損程度顯著增加。使用茶花粉水提物處理后大鼠血清ALT、AST活力顯著降低,說(shuō)明茶花粉水提物處理可以有效降低ALT、AST活力保護(hù)肝臟,且隨著茶花粉水提物使用劑量增加,ALT、AST活力進(jìn)一步降低,說(shuō)明茶花粉水提物可以抑制ALT、AST活力且在一定濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴(lài)性。趙燕平等[18]通過(guò)探討破壁靈芝孢子粉對(duì)大鼠肝臟損傷研究表明:血清ALT、AST活力肝組織炎癥程度關(guān)系密切,與本研究得出的結(jié)論相一致。
酒精還會(huì)損傷產(chǎn)生的細(xì)胞因子或炎性因子刺激肝星狀細(xì)胞的活化[19],肝星狀細(xì)胞活化后會(huì)伴有NF-kB等轉(zhuǎn)錄因子的激活及c-myb基因表達(dá)的增強(qiáng),而c-myb蛋白可結(jié)合α-SMA基因調(diào)控區(qū),表達(dá)平滑肌激動(dòng)細(xì)胞骨架蛋白α-SMA,且α-SMA的表達(dá)程度與肝星狀細(xì)胞活化的程度及數(shù)量呈正相關(guān)[20-21]。α-SMA陽(yáng)性的肝星狀細(xì)胞出現(xiàn)的NF-kB核轉(zhuǎn)位活性同時(shí)有靶基因的表達(dá),產(chǎn)生急性期蛋白、黏附因子、生長(zhǎng)因子等,加速肝纖維化進(jìn)程[22-23]。肝纖維化發(fā)生的主要變化是星狀細(xì)胞的活化增殖,當(dāng)肝星狀細(xì)胞活化后,儲(chǔ)存的維生素A脂滴含量明顯減少,同時(shí)維甲酸及其受體含量也下降?;罨母涡菭罴?xì)胞增殖,并分泌大量膠原和一系列促纖維化細(xì)胞因子,使 COL1A1生成明顯增加,同時(shí)抑制膠原降解因子生成,使膠原降解下降,最終導(dǎo)致膠原沉積,誘發(fā)肝臟纖維化。本研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠COL1A1和α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著增加,使用茶花粉水提物處理后COL1A1和α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著降低,說(shuō)明茶花粉水提物處理可以有效抑制COL1A1和α-SMA蛋白表達(dá),同時(shí)防止肝臟的纖維化。畢曉娟等[24]研究表明:肝臟內(nèi)的COL1A1和α-SMA蛋白表達(dá)與肝臟纖維化密切相關(guān),與本研究得出的結(jié)論相一致。
綜上所述,茶花粉水提物可以降低酒精性肝損傷,同時(shí)降低大鼠肝臟組織中COL1A1、α-SMA表達(dá),有效緩解酒精性肝損傷,其作用機(jī)制可能與茶花粉水提物可以抑制肝臟組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。