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(秦皇島市撫寧區(qū)第一中學)

一、基因工程概述

基因工程：基因工程又叫基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)，它是指在生物體外，用分離純化或人工合成的外源基因插入到載體分子中，成為重組DNA，再導入宿主細胞內(nèi)，進行擴增和表達，產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物或定向地創(chuàng)造生物的新性狀，使之穩(wěn)定地遺傳給子代的一種現(xiàn)代生物技術(shù)。

基因工程的操作程序包括：(1)目的基因的獲取：通過一定的方法得到需要進行操作的目的DNA，常用的方法有化學合成法，基因組文庫法和cDNA文庫法?；蚪M文庫是指某種生物全部基因組的信息，以DNA片段的形式與載體連接起來導入受體細胞中貯存。cDNA文庫只包含了某種生物的部分基因，用生物某一特定發(fā)育時期的mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的DNA片段與載體連接后貯存到受體細胞中。(2)基因表達載體的構(gòu)建：目的基因與載體分子在體外進行連接反應(yīng)，形成重組體，通過限制性內(nèi)切酶對含有目標片段的DNA和載體進行切割后，通過DNA連接酶進行連接，完成基因重組過程。另外，一個基因表達載體的組成，除了目的基因外，還必須有啟動子、終止子和標記基因。啟動子和終止子都是基因的非編碼區(qū)的一段特殊的DNA序列，分別位于編碼區(qū)的上游和下游，負責調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。(3)將目的基因?qū)胧荏w細胞：將人工重組后的DNA分子導入能進行正常復制的宿主細胞，從而隨著宿主細胞的分裂而進行復制。而并不是所有的細胞都可以作為受體細胞，受體細胞必須是能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細胞，受體細胞大致應(yīng)符合以下幾個基本條件：便于重組DNA分子的導入和穩(wěn)定存在、便于重組體的篩選、易于擴大培養(yǎng)或發(fā)酵生長，遺傳穩(wěn)定性高、安全性高和無致病性等。常用的受體細胞有大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌細胞、植物細胞還有動物細胞，尤其是小鼠L細胞、HeLa細胞等。(4)目的基因的檢測與鑒定：在目的基因?qū)胧荏w細胞后，并非所有的受體細胞都能被導入重組DNA分子，一般僅有很少重組子能進入受體細胞，并且導入后的目的基因是否可以穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性，這就需要對重組子也就是目的基因進行檢測與鑒定。根據(jù)載體類型、受體細胞種類等不同，重組子的篩選一般包括以下幾種方法：遺傳表型直接篩選法、依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析篩選法、核酸分子雜交檢測法、免疫化學檢測法等。

二、基因工程中幾組重要的基本概念

1.限制性核酸內(nèi)切酶

限制性核酸內(nèi)切酶：限制酶是一類能識別雙鏈DNA分子中某種特定核苷酸序列的DNA水解酶，以內(nèi)切方式水解DNA產(chǎn)生5’-P和3’-OH末端。根據(jù)限制酶在它識別序列的中心軸線處的切割位置不同，切割后的DNA分子產(chǎn)生的DNA片段末端有兩種形式——黏性末端或平末端。

2.DNA連接酶

DNA連接酶：DNA連接酶可以將兩種被同種限制酶切割的不同來源的DNA片段“縫合”起來，催化DNA中相鄰的5’-P和3’-OH間形成磷酸二酯鍵，形成重組DNA分子。根據(jù)酶的來源不同，DNA連接酶可分為兩類：一類是大腸桿菌DNA連接酶，一類是噬菌體T4DNA連接酶。這兩類酶除了來源不同，在功能上也有區(qū)別，大腸桿菌DNA連接酶一般只能連接黏性末端，而噬菌體T4 DNA連接酶既可連接黏性末端也可連接平末端。另外，大腸桿菌DNA連接酶利用NAD+作能源，而噬菌體T4 DNA連接酶利用ATP作能源。

3.運載體

運載體：將外源基因送入細胞中的“分子運輸車”就是載體，在基因工程中最常用的載體就是質(zhì)粒，另外還有λ噬菌體、動植物病毒等。作為基因工程操作的運載體有兩個作用：一是作為運載工具，將目的基因?qū)胨拗骷毎?；二是目的基因，通過載體在宿主細胞內(nèi)進行大量復制。因此，運載體一般都要具有以下4個特點：(1)有多種限制性內(nèi)切酶酶切位點，以便外源基因可以插入其中；(2)載體上要有遺傳標記基因，以指示載體或重組DNA分子是否進入宿主細胞，如四環(huán)素抗性基因等；(3)所用載體要能在宿主細胞內(nèi)復制并穩(wěn)定存在；(4)最好具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)，以便于制備。

4.PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))技術(shù)

PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))技術(shù)：PCR反應(yīng)是模仿細胞內(nèi)發(fā)生的DNA復制過程，在體外由酶催化合成特異性DNA片段，以DNA互補鏈聚合反應(yīng)為基礎(chǔ)。PCR反應(yīng)由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：(1)模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準備；(2)模板DNA與引物的退火(復性) ：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；(3)引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環(huán)以上這三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴增的目的基因擴增放大幾百萬倍。

5.轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化：是指重組DNA分子進入受體細胞，并且在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達的過程。根據(jù)受體細胞的不同，可以選擇不同的轉(zhuǎn)化方法。各種轉(zhuǎn)化方法的比較見表1。

6.蛋白質(zhì)工程

蛋白質(zhì)工程：蛋白質(zhì)工程就是根據(jù)蛋白質(zhì)的精細結(jié)構(gòu)和生物活力的作用機制之間的關(guān)系，利用基因工程的手段，按照人類自身的需要，對現(xiàn)有的蛋白質(zhì)進行改造，甚至于創(chuàng)造新的、自然界本不存在的、具有優(yōu)良特性的蛋白質(zhì)分子。

另外，在人教版高中生物必修2中包含一些基因工程的相關(guān)內(nèi)容，因此，學習選修中的相關(guān)內(nèi)容時，專業(yè)概念術(shù)語就比較多，學生在一些相近概念容易混淆，如限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶和DNA聚合酶，基因組文庫和cDNA文庫，磷酸二酯鍵和氫鍵、PCR技術(shù)與DNA復制，等等。

下面筆者以DNA連接酶和DNA聚合酶的區(qū)別進行一下列表對比如下(表2)。

由于基因工程相關(guān)內(nèi)容抽象難懂，并且基因工程的操作技術(shù)又比較微觀，因此，即使學生們喜歡學習基因工程的內(nèi)容，在真正學習起來也會覺得晦澀難懂，所以廣大一線教師要想教好這一專題內(nèi)容，第一步就是讓學生掌握好以上這些核心概念。