文_趙昕燕 北京節(jié)能環(huán)保中心

與全程硝化相比,短程硝化可減少硝化過程25%的需氧量和反硝化過程中40%的碳源消耗量,同時具有較低的污泥產(chǎn)量,并且可減少反硝化池容積,成為近幾年新型生物脫氮工藝的研究熱點。短程硝化是通過控制各種影響因素的方式促進AOB的生長繁殖同時抑制NOB的生長,達到縮短反應(yīng)時間,節(jié)約能源的目的。但作為自養(yǎng)型細(xì)菌，AOB生長緩慢,容易從反應(yīng)器中流失,在連續(xù)流條件下NO2--N積累不穩(wěn)定,限制了短程硝化技術(shù)的應(yīng)用。

包埋固定化微生物技術(shù)是現(xiàn)代生物工程領(lǐng)域中的一項新興技術(shù),它以高分子材料為載體,將游離細(xì)胞或者酶定位于限定的區(qū)域,使其保持活性并可反復(fù)利用,具有良好的微生物截留效果。

通過包埋固定化技術(shù)制作短程硝化包埋菌顆粒能有效防止菌體流失,提高細(xì)菌生物量,同時加強系統(tǒng)的抗負(fù)荷沖擊能力,有利于短程硝化的穩(wěn)定運行，活性污泥成本較低,且容易獲得,適合進行包埋固定化。近來各國對包埋短程硝化的研究興趣逐漸向微觀方面轉(zhuǎn)移，由原來探索水利條件來獲取最佳的處理效果轉(zhuǎn)為對微觀結(jié)構(gòu)等方面的研究探討。應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)(PCR-DGGE)對環(huán)境微生物進行研究,可以不經(jīng)過培養(yǎng)直接從環(huán)境樣品中提取細(xì)菌的DNA或RNA,利用DNA或RNA的微生物遺傳特性進行表征,這樣不但避免了傳統(tǒng)上耗時的菌種分離,更可進而鑒定出無法用傳統(tǒng)方法分離出來的菌種,克服了傳統(tǒng)微生物分類鑒定方法的不足。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

連續(xù)流試驗采用2L有機玻璃反應(yīng)器,如圖1所示,實驗采用人工配水培養(yǎng)包埋污泥,進水水質(zhì)指標(biāo)如表1所示。

表1 人工模擬廢水成分組成

試驗用包埋污泥取自北京某污水處理廠二沉池,取出的污泥經(jīng)4000r/min轉(zhuǎn)速離心濃縮10min,棄清液,得濃縮污泥。以質(zhì)量百分比計,取10%的水性聚氨酯(WPU)溶液與等體積濃縮污泥混合,加入0.24%N,N-亞甲基雙丙烯酰胺和1.5%過硫酸鉀(KPS),并迅速攪拌,約30min后混合液凝膠成固態(tài),將固態(tài)膠體切割成3×3×3mm立方體,既得包埋固定化顆粒,將制得的包埋顆粒活化培養(yǎng)一周后備用.包埋劑(WPU)和交聯(lián)劑/引發(fā)劑(N,N-亞甲基雙丙烯酰胺、KPS)均為分析純。

在連續(xù)流試驗條件下,進水NH4+-N質(zhì)量濃度為60mg/L,通過縮短反應(yīng)器水力停留時間(HRT)的方式,反應(yīng)器中逐漸出現(xiàn)NO2--N的積累,至第26天,反應(yīng)器中的NO2--N積累率達到65.1%,氨氮去除率達到95.7%,之后NO2--N積累率和氨氮去除率都呈緩慢上升趨勢,至第60天,反應(yīng)器中的NO2--N積累率達到79.3%,出水NH4+-N質(zhì)量濃度為1.86mg/L,氨氮去除率達到96.9%,基本所有NH4+-N都轉(zhuǎn)化為NO2

--N,反應(yīng)器達到穩(wěn)定的短程硝化。本研究中充分曝氣,水中DO一直維持在4mg/L以上, 并通過水浴控制反應(yīng)器內(nèi)溫度,保持在室溫21℃左右,進水氨氮濃度較低,只有60mg/L,游離氨(FA)不會成為主要的NOB抑制因素,在以往活性污泥法的研究中,這些條件都不是利于形成短程硝化的因素。但在本研究中,控制反應(yīng)器HRT在2h,之后逐漸降升高至4h,同樣形成了穩(wěn)定的短程硝化,因此分別在連續(xù)流試驗各個階段取樣,進行分子生物學(xué)分析,研究包埋菌形成穩(wěn)定短程硝化的內(nèi)在原因。

分子生物學(xué)取樣,第一個樣取自包埋前活性污泥,第二個樣取自連續(xù)馴化第26天,第3個樣取自連續(xù)馴化第60天。分別編號為樣品R1(接種污泥)、R2(馴化中的短程包埋硝化污泥)和R3(穩(wěn)定短程包埋硝化污泥)，樣品采集后在-20℃下保存。

1.2 樣品總DNA提取

采用上海生工提供的“Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(土壤)”提取DNA后,取5μL提取的DNA用1.2%瓊脂糖凝膠檢測。

1.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

針對總細(xì)菌的PCR擴增,以提取的總DNA作為模板,采用對大多數(shù)細(xì)菌16S rRNA基因V3區(qū)都具有特異性的引物對F357-GC(5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCG CCGCCCCCGCCCCCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和R518(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')。

1.4 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

采用DCodeTM基因突變檢測系統(tǒng)(Bio-Rad,USA)對PCR擴增產(chǎn)物進行分離。

1.5 克隆與測序

對DGGE電泳后圖譜上的優(yōu)勢條帶進行切膠回收。對于選定的每個條帶,只選擇其中間部分進行切割。

1.6 樣品的生物多樣性分析

采用凝膠分析軟件Quantity One對掃描所得的DGGE圖譜進行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 污泥樣品總DNA提取和PCR擴增結(jié)果

污泥樣品提取的DNA經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,得到的總DNA片段大小約為23kbp,屬于比較完整的細(xì)菌總DNA,適合做下一步PCR擴增。針對總細(xì)菌16S rRNA基因的PCR擴增結(jié)果大約為240bp,符合預(yù)期的長度,適合做下一步DGGE.針對AOB 16S rRNA基因的PCR擴增結(jié)果大約為500bp(第一輪)和250bp(第二輪),符合預(yù)期的長度,適合做下一步DGGE。

2.2 DGGE指紋圖譜結(jié)果

根據(jù)DGGE技術(shù)原理,圖譜中分離出來的條帶都是不同種類的微生物的特定區(qū)的DNA片段,每個條帶原理上可以代表一個微生物種屬,條帶信號強度越大表示該細(xì)菌在污泥中的優(yōu)勢地位越大,且相同位置電泳條帶較多,表明優(yōu)勢的微生物數(shù)量很多且相似性很高。圖2和圖3分別代表了針對總細(xì)菌和AOB的16S rRNA基因所得DGGE圖譜。

2.3 細(xì)菌種群多樣性

總細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)多樣性特性如圖4所示。可以看出：三個樣品中穩(wěn)定短程硝化污泥對應(yīng)的樣品R3的SDI和EI均最高,分別為1.69和0.70,表明穩(wěn)定短程硝化污泥中微生物種群相對豐富并且分布均勻；馴化期的短程硝化污泥對應(yīng)的樣品R2的SDI和EI均最低,分別為0.62和0.32,包埋顆粒在固定化過程中由于包埋試劑的毒性、聚合反應(yīng)的熱效應(yīng)等因素會導(dǎo)致剛包埋完成的顆?；钚暂^低,表明短程包埋硝化污泥的馴化過程會淘汰部分種群從而降低污泥中微生物種群的多樣性。

AOB種群結(jié)構(gòu)多樣性特性如圖5所示。可以看出：三個樣品中接種污泥多樣性指數(shù)、均勻性指數(shù)均最低,表明接種污泥AOB種群多樣性低,分布集中。馴化中的短程硝化污泥和穩(wěn)定短程硝化污泥均較接種污泥多樣性指數(shù)、均勻性指數(shù)高,表明穩(wěn)定短程硝化污泥可以富集AOB,這為包埋污泥能夠維持穩(wěn)定的短程硝化提供了微生物學(xué)基礎(chǔ)。

2.4 特征條帶的回收測序和系統(tǒng)發(fā)育分析

將總細(xì)菌和AOB的DGGE圖譜中部分優(yōu)勢條帶進行切膠測序,在Genbank中進行比對,獲得各條序列的同源性信息，從總細(xì)菌部分條帶16S rDNA序列比對結(jié)果可以看出,本次試驗3個樣品中的微生物群落主要分布于變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和未培養(yǎng)菌(uncultured bacterium)。3個樣品的共有條帶中,條帶1和條帶3分別與Nitrosomonas europaea(KF618624.1)和 Nitrosomonas sp. (KP074927.1)同源性達到94%和96%,亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)在反應(yīng)器內(nèi)將氨氧化為亞硝酸鹽,作為短程硝化系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌群已經(jīng)見諸多報道；條帶2和條帶5分別與Uncultured bacterium(HQ015447.1)和Uncultured bacterium(GQ421116.1)同源性達到99%和94%,表明短程硝化系統(tǒng)中的細(xì)菌多樣性豐富,并潛藏著許多未被人們認(rèn)識的微生物新資源,有待于進一步深入研究；條帶6與Alcaligenes sp. (LN864598.1)的同源性達到了98%,多項研究表明產(chǎn)堿桿菌屬細(xì)菌Alcaligenes sp.具有聚磷能力；條帶9與Flavobacterium sp. (KT284905.1)的同源性達到92%, Flavobacterium被報道具有廣泛的溶藻能力。這幾種細(xì)菌存在于接種污泥、馴化中的短程硝化污泥和穩(wěn)定短程硝化污泥中,表明其具有較強的環(huán)境適應(yīng)能力,而他們具有的脫氮功能、聚磷功能和溶藻功能都是水處理中功能菌的生化特性。條帶10存在于樣品R1和樣品R3中,與Thiobacillus(NR_074417.1)的同源性達到90%,該菌是一類硫自養(yǎng)反硝化菌,它具有不需要投放有機物作為碳源和產(chǎn)生極少量的污泥等優(yōu)點。

從AOB部分條帶16S rDNA序列比對結(jié)果和圖7的AOB系統(tǒng)發(fā)育樹可以得到本研究中分離到的亞硝化細(xì)菌(AOB)均與β-Proteobacteria的亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)有著較高的相似性(90%～99%),而沒有與亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)有一定相似性的序列,已有研究證實絕大多數(shù)的生物反應(yīng)器里Nitrosomonas是AOB中的優(yōu)勢菌屬,而Nitrosospira只出現(xiàn)在個別反應(yīng)器里。

3 結(jié)論

（1）短程硝化逐漸穩(wěn)定的過程會增加微生物種群多樣性,影響污泥穩(wěn)定性的細(xì)菌被淘汰,而脫氮菌、聚磷菌、溶藻菌和硫自養(yǎng)反硝化菌等污水處理功能微生物都在反應(yīng)過程中得到保留。經(jīng)包埋固定化穩(wěn)定短程硝化污泥比活性污泥更能有效防止菌體流失,提高細(xì)菌生物量。不同階段培養(yǎng)的污泥相比,穩(wěn)定短程硝化污泥微生物種群多樣性豐富、分布均勻,而馴化中的短程硝化污泥微生物種群多樣性較低、分布集中。3個樣品中的優(yōu)勢菌群主要分布于變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和未培養(yǎng)菌(uncultured bacterium)。

（2）短程硝化過程實現(xiàn)了對AOB一定程度的富集,與接種污泥相比,馴化中的短程硝化污泥和穩(wěn)定短程硝化污泥中AOB的多樣性指數(shù)、均勻性指數(shù)均有提高,其中穩(wěn)定短程硝化污泥中的AOB多樣性指數(shù)和均勻性指數(shù)最高、接種污泥中AOB的多樣性指數(shù)和均勻性指數(shù)最低。包埋材料具有良好的截留微生物的能力,對于那些世代周期較長的微生物如亞硝酸菌提供了較好的環(huán)境。AOB種群分析表明優(yōu)勢AOB均屬于亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas),且出現(xiàn)在短程硝化不同階段的不同菌種,表明該反應(yīng)器污泥內(nèi)部形成的不同環(huán)境條件能夠為多種AOB提供生存環(huán)境。