王宗鑫 張永軍 陳維明 徐勇 周廣東

藥物緩釋系統(tǒng)能更好地保持藥物活性，延長(zhǎng)藥物有效作用時(shí)間，使藥物緩慢、規(guī)律地釋放，減少了大劑量多頻次用藥造成的副作用，用藥更加便捷安全[1]。藻酸鈣凝膠是目前藥物緩釋研究的熱點(diǎn)之一，是由藻酸鈉溶液與Ca2+反應(yīng)形成的單網(wǎng)絡(luò)水凝膠，有較好的生物相容性，可負(fù)載細(xì)胞或藥物[2]。因具有較好的可塑性，藻酸鈣凝膠被用作藥物緩釋系統(tǒng)時(shí)，多被制作成微球。然而，目前制作藻酸鈣微球采用乳化方法，有機(jī)溶劑易破壞藥物的活性并存在溶劑殘留風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。另外，藻酸鈣微球直徑較大，且大小不均勻，嚴(yán)重阻礙了這種藥物緩釋系統(tǒng)的臨床應(yīng)用。高壓靜電場(chǎng)技術(shù)通過高壓靜電使針頭內(nèi)的液體帶電，由于靜電斥力使液滴分裂成細(xì)小的微滴，接觸Ca2+后被交聯(lián)成微球，高效、可控、簡(jiǎn)便[5]。本研究嘗試采用高壓靜電場(chǎng)技術(shù)，從電壓、藻酸鈉濃度、CaCl2濃度、離心轉(zhuǎn)速和針頭直徑等5個(gè)方面，探索最佳參數(shù)組合，并采用牛血清白蛋白（BSA）為模型藥物，探索這類微球的體外緩釋行為。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

無水CaCl2（美國(guó)Sigma），藻酸鈉 （分子量67 KD，美國(guó) Sigma），磷酸鹽緩沖溶液（PBS，美國(guó) Sigma）,牛血清白蛋白（BSA，純度＞98%，上海阿拉丁），BCA微量蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天），直流高壓發(fā)生器（美國(guó)Spellman），10 ml注射器（上?？档氯R），磁力攪拌器（德國(guó)IKA），場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡JEOL-6380LV（日本電子株式會(huì)社），光學(xué)顯微鏡（日本 Nikon），恒溫?fù)u床（德國(guó) IKA），酶標(biāo)儀（美國(guó) Thermo）。

1.2 藻酸鈣載藥微球的制備

取一定質(zhì)量的藻酸鈉粉末加入去離子水中，置于50℃水浴中攪拌，徹底溶解，靜置過夜去除氣泡后用注射器抽取，將針頭與高壓直流電源連接；另將CaCl2溶液放置于磁力攪拌器上，接收距離10 cm，打開電源，液滴受到重力和電勢(shì)差驅(qū)動(dòng)力形成射流，進(jìn)入CaCl2溶液，形成載藥微球。繼續(xù)交聯(lián)30 min后，去離子水洗去表面的CaCl2溶液（圖1）。

圖1 藻酸鈣微球制作模式圖Fig.1 Pattern diagram of calcium alginate microspheres

1.3 微球直徑和表面形態(tài)觀察

隨機(jī)選取約100粒微球，40倍視野下用光學(xué)顯微鏡拍照，使用Image J軟件進(jìn)行微球直徑測(cè)量。微球凍干后，隨機(jī)取約100粒微球黏附于電鏡載物臺(tái)上，抽取真空，噴金后觀察微球表面形態(tài)。

1.4 最佳電壓

我們綜合大量已有的制作參數(shù)，采用1 M CaCl2、1%藻酸鈉、200 r/min和30 G針頭。電壓分別采用2 KV、10 KV和16 KV。篩選最佳電壓方法：使用光學(xué)顯微鏡和電鏡對(duì)微球直徑和表面形態(tài)進(jìn)行觀察。篩選標(biāo)準(zhǔn)：直徑最小，標(biāo)準(zhǔn)差最小，形態(tài)規(guī)整。

1.5 最佳藻酸鈉濃度

在 16 KV、1 M CaCl2、200 r/min、30 G 針頭基礎(chǔ)上，分別測(cè)試0.5%、1%、1.5%藻酸鈉，篩選方法和標(biāo)準(zhǔn)同1.3。

1.6 最佳CaCl2濃度

在 16 KV、0.5%藻酸鈉、200 r/min、30 G 針頭基礎(chǔ)上，分別測(cè)試 0.5 M、1 M、1.5 M CaCl2，篩選方法和標(biāo)準(zhǔn)同1.3。

1.7 離心機(jī)最佳轉(zhuǎn)速

在 16 KV、1 M CaCl2、0.5%藻酸鈉、30 G 針頭基礎(chǔ)上，分別測(cè)試 200 r/min、600 r/min、1 000 r/min，篩選方法和標(biāo)準(zhǔn)同1.3。

1.8 最佳針頭大小

在 16 KV、1 M CaCl2、0.5%藻酸鈉、200 r/min 基礎(chǔ)上，分別測(cè)試27 G、30 G、32 G針頭，篩選方法和標(biāo)準(zhǔn)同1.3。

1.9 3種載藥微球的藥物包封率和載藥率

采用最佳參數(shù)組合，制作1%、3%、5%BSA濃度的藻酸鈉BSA混合液，分別設(shè)為L(zhǎng)組、M組和H組。微球制作完畢后，收集燒杯內(nèi)剩余液體和微球洗滌液，使用BCA微量蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定其未包封的BSA含量（最大吸收峰在280 nm），同時(shí)用微量天平秤量微球總重量。包封率=（BSA總量-未包封BSA含量）/BSA總量×100%，載藥率=（BSA總量-未包封BSA 含量）/微球總重量×100%[6]。

1.10 3種載藥微球的體外釋放實(shí)驗(yàn)

各組分別秤取100 mg的載藥微球，放入15 mL離心管中，加入10 mL PBS液（pH 7.4），擰緊蓋子，將其置于37℃恒溫?fù)u床上，轉(zhuǎn)速100 r/min，分別在第 2、4、8、24小時(shí)和第 3、7、14、28 天離心后，吸走全部緩釋液，添加10 mL新鮮PBS液。以BCA微量蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定緩釋液中BSA含量，即此時(shí)間段微球藥物釋放量。累積釋放量=BSA釋放量/微球中BSA總量×100%。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用 SAS 9.4（SAS Institute Inc.，美國(guó)）統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，所有計(jì)量數(shù)據(jù)以（±s）表示，對(duì)各組間的數(shù)據(jù)比較使用Student-Newman-Keuls法或Dunnett法行方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 微球形態(tài)學(xué)觀察

當(dāng)電壓為16 KV，藻酸鈉濃度為0.5%，氯化鈣濃度為1 M，轉(zhuǎn)速為200 r/min，針頭為30 G時(shí)，成球效果較好，具有較小的平均直徑且大小均一。使用其他參數(shù)時(shí)，有時(shí)雖能成球形，但平均直徑大，或大小不均一，或形狀不規(guī)則（甚至不能成球形）。根據(jù)制作載藥微球的原則，考慮選取電壓16 KV、藻酸鈉濃度0.5%、氯化鈣濃度 1 M、轉(zhuǎn)速 200 r/min、針頭 30 G，作為最佳參數(shù)組合來制備微球。掃描電鏡結(jié)果與光鏡結(jié)果一致，微球凍干后形態(tài)雖有變化，但大小較均勻，適合下一步制作載藥微球（圖2～6）。

圖2 不同電壓組的微球形態(tài)Fig.2 Morphology of microspheres in different voltage groups

圖3 不同藻酸鈉濃度組的微球形態(tài)Fig.3 Morphology of microspheres in different alginate concentration groups

圖4 不同CaCl2濃度組的微球形態(tài)Fig.4 Morphology of microspheres in different CaCl2 concentration groups

圖5 不同轉(zhuǎn)速下的微球形態(tài)Fig.5 Morphology of microspheres at different rotational speeds

圖6 不同型號(hào)針頭下的微球形態(tài)Fig.6 Microsphere morphology under different types of needles

2.2 載藥微球包封率及載藥率

BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：Y=1.5038X+0.1095，R2=0.9981（圖 7）。 以此線性方程為基礎(chǔ)，計(jì)算得到L、M、H組微球的包封率分別為 （91±1.46）%、（85±1.63）%、（79±3.29）%，載藥率分別為（0.89±0.04）%、（2.56±0.57）%、（4.10±1.21）%?？梢婋S著初始給藥量的增加，包封率逐漸減小，載藥率逐漸增加。

圖7 BSA溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curve of BSA solution

2.3 載藥微球體外釋藥

不同載藥濃度微球的粒徑分析，加藥后3組微球的直徑?jīng)]有明顯變化，在一定載藥濃度范圍下，藥物不會(huì)影響微球的直徑。藥物累計(jì)釋放率檢測(cè)顯示，使用最佳參數(shù)組合制備出的3組微球緩釋持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)（＞28 d），并都具有典型的三相釋放規(guī)律。載藥微球放入PBS釋放介質(zhì)后的24 h內(nèi)，藥物釋放速度較快，3組累積釋放率在25%～40%之間，24 h后釋藥曲線逐漸變緩，后期釋放逐漸加速。另外，隨著載藥量的增加，各時(shí)間點(diǎn)的釋放速率也在增加，因此可以根據(jù)載藥量調(diào)節(jié)釋放速率（圖8）。

圖8 各組BSA-藻酸鈣微球粒徑分析及體外緩釋曲線Fig.8 Particle diameter analysis and sustained release curve of BSA-calcium alginate in each group

3 討論

藻酸鈉是從藻類植物中提取的一種天然生物活性大分子，來源廣泛，降解產(chǎn)物為CO2、H2O和Na+，生物安全性高，被廣泛應(yīng)用于食品和藥品行業(yè)[7]。藻酸鹽敷料被美國(guó)FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于皮膚創(chuàng)面的修復(fù)[8]。藻酸鈉分子由G單元和M單元組成，其中的Na+可以與某些金屬離子進(jìn)行交換，后者可與G單元交聯(lián)形成“蛋盒結(jié)構(gòu)”，由溶液向凝膠轉(zhuǎn)變[4]。金屬離子（如 Cu2+、Pb2+、Co2+和 Mn2+）可作為交聯(lián)劑，但具有一定的毒性，Ca2+的生物相容性更高，一般使用CaCl2作為交聯(lián)溶液[2，8]。藻酸鈣凝膠也具有很高的生物相容性，在組織工程領(lǐng)域被用于干細(xì)胞或終末細(xì)胞的3D培養(yǎng)，可以較好地促進(jìn)干細(xì)胞分化，保持終末細(xì)胞的表型[2]。藻酸鈣微球緩釋體系制作方便，藥物包封率高，與用人工合成化合物制作的微球（如PLGA微球）相比，生物相容性更佳，具有很好的應(yīng)用前景。制作藻酸鈣微球一般采用乳化方法，多采用二氯甲烷等有機(jī)溶劑作為油相，可能破壞藥物的活性，且存在溶劑殘留的風(fēng)險(xiǎn)。我們采用高壓靜電場(chǎng)技術(shù)制作微球，制作過程不使用有機(jī)溶劑，更加安全。

目前該技術(shù)制備的載藥微球直徑較大且形狀不均勻，還未探索出最佳參數(shù)組合，微球緩釋行為也未深入研究，故本研究擬探索制備的最佳參數(shù)組合，以制備出直徑更小更均勻的微球，并在此基礎(chǔ)上研究載藥后的緩釋行為。

高壓靜電場(chǎng)技術(shù)需使用4個(gè)裝置，即高壓電源、注射器、微球接收容器和磁力攪拌器[5]。高壓電源與注射器針頭連接使針頭內(nèi)的藻酸鈉液體帶電，接收容器內(nèi)液體與針頭之間的電勢(shì)差是驅(qū)動(dòng)射流的動(dòng)力。藻酸鈉液體帶電后由于靜電斥力液滴分裂成微小液滴，集聚成高速射流進(jìn)入Ca2+溶液被交聯(lián)固化[9]。磁力攪拌器的適當(dāng)攪拌可使藻酸鈣液滴被快速、充分地交聯(lián)，并避免局部凝膠微球的聚集。

藻酸鈣微球的直徑大小與電壓、CaCl2濃度、藻酸鈉濃度，以及磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速和針頭直徑等因素有關(guān)。以往的研究未綜合考慮這5個(gè)參數(shù)的有機(jī)整合。我們首先綜合了其他既有研究的參數(shù)，設(shè)置合理的藻酸鈉濃度、CaCl2濃度，以及轉(zhuǎn)速和針頭規(guī)格，探索電壓對(duì)直徑大小的影響。隨著電壓的增加（達(dá)到16 KV），微球直徑降低，這可能是由于電壓的增加使得液滴的分裂更加充分，液滴更小造成的[5]。藻酸鈉溶液濃度越?。?.5%），黏性越小，在施加電壓后液滴更容易分裂，液滴越小[5，10-11]。CaCl2的濃度越大（1.5 M），雖然制作出的微球平均直徑變小，但是大小不一，標(biāo)準(zhǔn)差變大，不宜采用。平均直徑變小是因?yàn)镃aCl2的濃度越大，導(dǎo)電性越高，針頭與CaCl2液體之間的電勢(shì)差就越大，加載到針頭上的電壓相對(duì)變大[10]。標(biāo)準(zhǔn)差變大的原因可能是CaCl2的濃度越大，液滴更快地被交聯(lián)固化，液體剪切力打散部分微滴，一部分未打散。1 M CaCl2濃度制作出的微球大小適中，形態(tài)規(guī)整，可采用。轉(zhuǎn)速越大（1 000 r/min），液體剪切力越大，會(huì)使形成的微球撕裂變形，因此轉(zhuǎn)速不宜過大，200 r/min較為合適。由于藻酸鹽黏度較大，針頭直徑過?。?7 G），液體不易流出，影響了液滴的分裂，針頭直徑過大（32 G），液體流出過快，不能充分分裂，所以30 G的針頭比較適合。以上參數(shù)組合，制作成的微球比其他文獻(xiàn)報(bào)道的直徑更小[5]，釋藥的比表面積更大，藥物釋放更加高效[12]。同時(shí)，更容易注射[6]，或與其他凝膠介質(zhì)混合[7]。微球大小均勻，標(biāo)準(zhǔn)差更小，生產(chǎn)過程中易于質(zhì)控，實(shí)際使用時(shí)，劑量更精準(zhǔn)。因此，16 KV電壓、1 M CaCl2濃度、0.5%藻酸鈉濃度、200 r/min和30 G的針頭是最佳參數(shù)組合。

我們對(duì)藻酸鈣微球的緩釋行為的研究采用了BSA作為模型藥物，設(shè)置了低、中、高3個(gè)藥物濃度，研究了藥物包封率、載藥率和體外緩釋規(guī)律。3組的藥物包封率都很高，說明該方法制作的藻酸鈣微球有很好的藥物包封能力，可有效阻止微球制備過程中藥物向外部的滲漏，減少藥物浪費(fèi)。結(jié)果表明，初始給藥量越少，緩釋載體（藻酸鈣凝膠）和藥物的比例就越高，緩釋載體就把藥物包封得更加充分，從而獲得更高的包封率，但載藥率相應(yīng)減少[11]。3組藥物濃度的緩釋微球都能夠保持較長(zhǎng)的藥物釋放時(shí)間（至少28 d），緩釋效果明顯。原因可能是：藻酸鹽分子中只有G單元被Ca2+交聯(lián)，所以本研究采用G/M比值高的藻酸鈉作為原料，交聯(lián)程度更高，降解更慢，藥物包封更加充分，所以緩釋時(shí)間更長(zhǎng)[4，8]。

通過分析3組的體外累計(jì)緩釋曲線（pH 7.4）可見：3組曲線都分為3個(gè)階段，即突釋期、緩慢釋放區(qū)和加速釋放區(qū)[6]；另外，載藥濃度越高，各階段的累計(jì)釋放比例越高。微球緩釋系統(tǒng)中藥物釋放的主要機(jī)制為：突釋、擴(kuò)散和降解[1]。突釋現(xiàn)象的產(chǎn)生是因?yàn)轲じ皆谖⑶虮砻婕芭R近表面的藥物，在短期內(nèi)快速溶解造成的[13]。然而，藻酸鈣微球突釋現(xiàn)象的產(chǎn)生又有著特殊之處，是由于藻酸鹽在CaCl2溶液中被交聯(lián)，交聯(lián)后為了進(jìn)一步增加機(jī)械性能，浸泡了一段時(shí)間，而后用水洗去了微球表面的CaCl2溶液，這一系列操作會(huì)造成微球表面黏附的藥物大部分損失，因此在研究緩釋行為時(shí)，突釋的產(chǎn)生主要是臨近微球表面的藥物起主導(dǎo)作用，最外面的藥物很少，起次要作用。載藥量大，表面的藥物顆粒就越多，溶解后留下的通道就越多，溶液更容易進(jìn)入微球內(nèi)部，臨近表面的藥物溶解越快，所以載藥量多的分組突釋現(xiàn)象更加明顯[13]。雖然3組都可觀察到突釋現(xiàn)象，但是突釋并不劇烈，即使高載藥組也未超過40%。起始階段釋放一定的藥量可作為基礎(chǔ)藥量，隨著藥物的代謝，后面階段藥物的釋放可以補(bǔ)充藥物的損失，以維持局部有效藥物濃度。

突釋現(xiàn)象后，擴(kuò)散行為起主要作用，進(jìn)入慢速緩釋階段。擴(kuò)散與微粒直徑、溶液進(jìn)入微球的通道數(shù)量、濃度梯度有關(guān)。因?yàn)?組直徑差別不大，擴(kuò)散距離基本一致，所以通道數(shù)量、濃度梯度起主要作用[13]。如前述，高載藥組的通道數(shù)量更多，溶液進(jìn)入微球內(nèi)部更多，藥物的溶解擴(kuò)散更多。另外，高載藥組微球內(nèi)外的藥物濃度梯度差更大，化學(xué)驅(qū)動(dòng)力更高，更容易擴(kuò)散出來。所以，此階段高載藥組的釋放比例更高。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，藻酸鈣緩釋支架逐漸降解，內(nèi)部凝膠網(wǎng)絡(luò)崩塌，藥物快速釋出，因此進(jìn)入快速釋藥階段。本研究所采用的緩釋溶液是在pH 7.4的PBS液中進(jìn)行的，PBS液中存在著大量金屬離子，會(huì)和凝膠中的交聯(lián)劑Ca2+進(jìn)行緩慢的離子交換，藻酸鈣微球支架發(fā)生解聚降解。如前所述，高載藥組由于藥物/支架比增加，藻酸鹽比例較少，分解更快，加之溶液進(jìn)入微球內(nèi)部的通道更多，水分子和其他金屬離子大量進(jìn)入加劇了凝膠分子鏈的解聚，包封的藥物大量溶解釋出。可見，藻酸鈣微球的直徑、載藥量都可以影響其藥物緩釋行為。我們經(jīng)過最佳參數(shù)組合的摸索，制備出的微球具有較高的包封率，緩釋持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，并且具有典型的三相釋放規(guī)律，是一種良好的藥物緩釋系統(tǒng)。

4 結(jié)論

本研究采用高壓靜電場(chǎng)流技術(shù)成功制備出藻酸鈣微球，該方法簡(jiǎn)便，易于調(diào)控參數(shù)，無有機(jī)溶劑，生物相容性更高。通過光鏡和電鏡觀察微球的形態(tài)和直徑，確定了最佳參數(shù)組合。本方法制備的微球具有更小的直徑，且更為均勻，形狀規(guī)則，性狀穩(wěn)定。這種微球負(fù)載模型藥物BSA時(shí)，具有很好的藥物包封率，體外緩釋時(shí)間較長(zhǎng)，釋放行為穩(wěn)定、規(guī)律。在將來的研究中可以此注射或復(fù)合其他生物材料進(jìn)行藥物緩釋，臨床應(yīng)用前景廣泛，潛力巨大。