王孟筱， 曹幫華， 崔田田， 陳海燕2， 趙文軒， 毛培利

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)黃河下游森林培育國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 泰安 271018；2.泰安市徂徠山林場(chǎng)， 山東 泰安 271027)

高質(zhì)量的種子具有更好的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)和生產(chǎn)潛力，而確定種子最佳成熟期是實(shí)際生產(chǎn)實(shí)踐中豐產(chǎn)的基礎(chǔ)[1]。采收過(guò)早，容易造成種子成熟度差、活力低、質(zhì)量差；而采收過(guò)晚，則會(huì)導(dǎo)致種子收獲減少以及成熟后劣變引起活力降低。在成熟過(guò)程中，伴隨母體植株不斷提供營(yíng)養(yǎng)，種子本身也發(fā)生著一系列生理變化，體現(xiàn)在外觀形態(tài)和顏色變化、千粒重增加、含水量降低、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(可溶性糖、淀粉和蛋白質(zhì)等)積累、內(nèi)源激素(GA、ABA和乙烯等)含量等變化[2]。王文章等研究表明，成熟度對(duì)紅松種子萌發(fā)的影響，除了與成熟過(guò)程中的生理生化變化有關(guān)外，也與種子內(nèi)部發(fā)芽抑制物質(zhì)有關(guān)[3]。周健等研究表明，紫荊種子隨著成熟度提高，種皮表面氣孔消失，蠟質(zhì)開(kāi)始形成并逐漸加厚，角質(zhì)層和柵欄層可能是影響種皮透性進(jìn)而引起休眠的原因之一[4]。楊玲等研究表明，種皮機(jī)械障礙作用是限制調(diào)制干燥前發(fā)育中的花楸種子萌發(fā)的重要因素[5]。由于不同植物有著不同的種子形成規(guī)律，因此其成熟特征也不盡相同[6]。種子成熟度不僅影響種子發(fā)芽能力和出苗整齊度，還進(jìn)一步影響幼苗的品質(zhì)[7]。賈然然等研究表明，毛葉山桐子種子在深紅果階段播種最佳，在黑褐果階段果實(shí)霉變，影響種子活力和發(fā)芽整齊度[8]。目前種子成熟度對(duì)小麥[9-11]、玉米[12-13]等農(nóng)作物研究較多，對(duì)木本植物研究較少。近年來(lái)，有研究表明種子成熟度還影響其在逆境條件下的萌發(fā)進(jìn)程。王淑英等研究表明，灌漿前期的玉米種子具有一定的發(fā)芽率，但種子抗低溫冷害能力差，隨著灌漿時(shí)期的延后，種子成熟度提高，抗逆能力逐漸增強(qiáng)[13]。藺吉祥等研究表明，羊草種子是具有一定耐鹽性的淺播種子，不同成熟度的羊草種子同樣表現(xiàn)出不同的耐鹽性和不同的抗深埋特性，成熟度越高，種子活力越大，種子抗鹽性和抗深埋性越強(qiáng)[14-15]。

在種子萌發(fā)過(guò)程中，鹽脅迫首先通過(guò)滲透脅迫阻礙種子水分的吸收，從而影響其萌發(fā)；其次，鹽進(jìn)入種子會(huì)因離子毒害打破種子細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)，產(chǎn)生活性氧自由基。活性氧自由基誘發(fā)氧化脅迫造成生物大分子結(jié)構(gòu)的損傷，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞的代謝造成有害的影響，導(dǎo)致種子內(nèi)細(xì)胞水平的損傷，進(jìn)一步抑制種子的萌發(fā)。大量的研究表明，不同植物種子在鹽脅迫下的萌發(fā)有著顯著差別。對(duì)于鹽生植物，其種子在鹽脅迫下有著高的發(fā)芽能力，可以耐受很高的土壤鹽含量，一定的鹽分會(huì)促進(jìn)鹽生植物種子的萌發(fā)。藺吉祥等研究表明，相對(duì)較低的鹽濃度有利于羊草種子的萌發(fā)，而羊草種子在低濃度鹽脅迫下的復(fù)萌率較低，隨鹽脅迫濃度不斷增加，其發(fā)芽能力受到刺激，復(fù)萌率也隨之增加[13]。而對(duì)于非鹽生植物，其種子在鹽脅迫下發(fā)芽能力顯著降低，只能耐受很低的土壤含鹽量。因此，闡明植物種子耐鹽萌發(fā)能力對(duì)鹽堿地育苗及播種造林具有重要的實(shí)踐意義。

泡桐(PaulowniaSieb.et Zucc)是玄參科(Scorphulariaceae)泡桐屬(Paulownia)植物，落葉喬木，原產(chǎn)我國(guó)。泡桐實(shí)生苗的耐鹽極限為0.2%～0.3%[16]，具有一定的耐鹽能力，是鹽堿地造林重要樹(shù)種之一[17]。前人對(duì)泡桐種子在鹽脅迫條件下的育苗工作研究不多，關(guān)于不同成熟度的泡桐種子耐鹽性研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，通過(guò)采集不同成熟時(shí)期的泡桐種子研究其在鹽脅迫下的發(fā)芽能力，研究種子成熟度與耐鹽能力的關(guān)系，可為泡桐在鹽堿地區(qū)的推廣應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試泡桐種子采自泰安市泰山區(qū)8年生泡桐人工林。采種母樹(shù)平均胸徑為25 cm，平均樹(shù)高為15 m。9月初泡桐蒴果已逐漸飽滿，果皮呈綠色；至9月底10月初，蒴果顏色變深綠至深棕并逐漸開(kāi)裂；10月中旬到10月底，泡桐蒴果顏色進(jìn)一步變深至棕黑色，果莢開(kāi)裂數(shù)增加?；诖?，分別于2017年9月10日(記作Ⅰ)、9月30日(記作Ⅱ)、10月20日(記作Ⅲ)分3次用高枝剪采集果實(shí)飽滿、大小均勻且成熟狀態(tài)一致的泡桐蒴果。帶回實(shí)驗(yàn)室后，剖開(kāi)果莢，取出種子，去掉雜質(zhì)，測(cè)定種子的千粒重和相對(duì)含水量。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

前人所作泡桐種子在鹽脅迫下萌發(fā)能力的研究中試驗(yàn)設(shè)置鹽濃度最大為3‰，為進(jìn)一步探究泡桐種子耐鹽極限，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組鹽濃度為1‰、3‰和5‰，將3個(gè)采種期的種子分別在該3種濃度的NaCl溶液下進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，清水作為對(duì)照。將種子先用清水在室溫下浸泡24 h，然后用3‰ KMnO4溶液浸泡30 min消毒。無(wú)菌水沖洗3次，將種子擺入90 mm口徑的培養(yǎng)皿內(nèi)。培養(yǎng)皿底部鋪消毒海綿，上覆一層吸水濾紙做發(fā)芽床。每個(gè)培養(yǎng)皿擺100粒種子，4次重復(fù)。每個(gè)培養(yǎng)皿加入配好的等量不同濃度的鹽溶液。按照《GB 2722-1999林木種子檢驗(yàn)規(guī)程》[19]的規(guī)定，將培養(yǎng)皿放置在光照和黑暗各12 h，光照強(qiáng)度12 000 lx，相對(duì)濕度85%，溫度25 ℃的恒溫生化培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，觀察22 d。萌發(fā)過(guò)程中每24 h觀測(cè)1次。當(dāng)胚根突破種皮接近種子等長(zhǎng)時(shí)，即認(rèn)為種子萌發(fā)，記錄種子萌發(fā)起始時(shí)間和每日萌發(fā)種子數(shù)量。在萌發(fā)過(guò)程中，根據(jù)培養(yǎng)皿中水分的消耗情況每天補(bǔ)充水分至原刻度。

試驗(yàn)結(jié)束后，把幼苗取出清洗干凈，用濾紙把表面水分吸干，稱重幼苗的鮮重(g)，測(cè)量胚軸長(zhǎng)度(mm)，然后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽指標(biāo)及幼苗生長(zhǎng)狀況。

1.3 指標(biāo)及測(cè)定方法

發(fā)芽指標(biāo)包括發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、平均發(fā)芽時(shí)間、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。

發(fā)芽率(%)=(G1/N)×100%，式中：G1為萌發(fā)數(shù)，N為供試種子總數(shù)。

發(fā)芽勢(shì)(%)=(發(fā)芽高峰期發(fā)芽的種子數(shù)/N)×100%。

發(fā)芽時(shí)間=∑(D×n)/∑n，式中：n為對(duì)應(yīng)各日正常發(fā)芽的粒數(shù)，D為種子置床起的天數(shù)。

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)，式中：Gt為各日凈發(fā)芽數(shù)；Dt為相應(yīng)發(fā)芽日。

活力指數(shù)=S×GI，式中：S為幼苗鮮重；GI為發(fā)芽指數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件(SPSS，Chicago，IL，USA)進(jìn)行分析。用單因素方差分析法(One-Way ANOVA)分析了種子成熟時(shí)期對(duì)千粒重、相對(duì)含水量的影響；用雙因子方差分析法(Two-Way ANOVA)比較種子成熟時(shí)期和鹽濃度對(duì)種子萌發(fā)各指標(biāo)的影響。若差異顯著，再用最小顯著差異法(LSD)進(jìn)行多重比較。顯著性差異檢驗(yàn)水平是p<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同采種期泡桐種子千粒重及含水量差異

隨著采種期的推遲，泡桐種子的千粒重逐漸增加，千粒重平均值分別為0.16 g、0.20 g、0.24 g(圖1)；泡桐種子的相對(duì)含水量逐漸降低，相對(duì)含水量分別為52.18%、43.74%、34.60%(圖2)。方差分析結(jié)果表明，采種期對(duì)泡桐種子含水量有著顯著影響(F=6.020，p<0.05)，Ⅰ<Ⅱ<Ⅲ(p<0.05)；但對(duì)千粒重影響不顯著(F=1.257，p>0.05)。

圖1 隨種子采摘日期增加種子千粒重的變化

圖2 隨種子采摘日期增加種子含水量的變化

2.2 不同采種期泡桐種子鹽脅迫下的萌發(fā)特性

2.2.1發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)

隨著采種期的推遲，種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)呈低-高-低的變化趨勢(shì)。Ⅱ的種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)最高；隨鹽脅迫濃度的增加，發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均逐漸降低(圖3、圖4)。雙因素方差分析結(jié)果表明，采種期對(duì)發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)有著極顯著的影響；鹽脅迫對(duì)發(fā)芽率有顯著影響，對(duì)發(fā)芽勢(shì)有極顯著影響；二者的交互作用對(duì)發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)影響不顯著(表1)。不同采種期間，Ⅰ與Ⅲ的種子發(fā)芽率差異不顯著(p>0.05)，極顯著低于Ⅱ(p<0.01)。不同采種期間，Ⅰ與Ⅲ的種子發(fā)芽勢(shì)差異不顯著(p>0.05)，顯著低于Ⅱ(p<0.05)。不同鹽分脅迫梯度之間，對(duì)照的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)都顯著高于鹽濃度為3‰和5‰(p<0.05)。

2.2.2平均發(fā)芽時(shí)間

隨鹽濃度的增加，不同采種期的泡桐種子平均發(fā)芽時(shí)間呈上升趨勢(shì)(圖5)。雙因素方差分析結(jié)果表明，采種期對(duì)平均發(fā)芽時(shí)間影響不顯著；鹽脅迫對(duì)平均發(fā)芽時(shí)間影響極顯著；而二者的交互作用不顯著(表1)。不同鹽分脅迫梯度之間，對(duì)照種子的平均發(fā)芽時(shí)間顯著低于3‰(p<0.05)，極顯著低于5‰(p<0.01)，1‰平均發(fā)芽時(shí)間極顯著低于5‰(p<0.01)。

圖3 不同采種期種子在鹽脅迫下的發(fā)芽率

圖4 不同采種期種子在鹽脅迫下的發(fā)芽勢(shì)

圖5 不同時(shí)期采集的泡桐種子在不同鹽濃度下的平均發(fā)芽時(shí)間

2.2.3發(fā)芽指數(shù)

在不同采種期之間，Ⅱ的泡桐種子發(fā)芽指數(shù)最高(圖6)；隨鹽濃度的增加，泡桐種子發(fā)芽指數(shù)呈逐漸降低的趨勢(shì)。雙因素方差分析結(jié)果表明，采種期和鹽脅迫對(duì)發(fā)芽指數(shù)有著極顯著的影響，二者的交互作用不顯著(表1)。不同采種期之間，Ⅱ的種子發(fā)芽指數(shù)極顯著高于Ⅰ和Ⅲ的種子(p<0.01)。不同鹽脅迫濃度梯度之間，對(duì)照種子的發(fā)芽指數(shù)最高，并且極顯著高于3‰和5‰(p<0.01),1‰發(fā)芽指數(shù)極顯著高于5‰(p<0.01)。

2.2.4活力指數(shù)

在不同采種期之間，Ⅱ的種子活力指數(shù)最高；隨鹽濃度的增加，泡桐種子活力指數(shù)呈逐漸降低的趨勢(shì)(圖7)。雙因素方差分析結(jié)果表明，采種期和鹽脅迫對(duì)發(fā)芽指數(shù)有著極顯著的影響，二者的交互作用不顯著(表1)。不同采種期之間，Ⅱ的種子發(fā)芽指數(shù)極顯著高于Ⅰ和Ⅲ的種子(p<0.01)。不同鹽脅迫濃度梯度之間，對(duì)照種子的活力指數(shù)最高，并且極顯著高于鹽濃度為3‰和5‰(p<0.01)。

圖6 不同時(shí)期采集的泡桐種子在不同鹽濃度下的發(fā)芽指數(shù)

圖7 不同時(shí)期采集的泡桐種子在不同鹽濃度下的活力指數(shù)

表1 種子活力指標(biāo)在采種期和鹽濃度下的顯著性

指標(biāo) 采種期 鹽濃度 采種期×鹽濃度f(wàn)pfpfp發(fā)芽率23.20<0.013.24<0.050.4300.85發(fā)芽勢(shì)5.36<0.017.18<0.011.820.12平均發(fā)芽時(shí)間1.860.174.97<0.011.180.34發(fā)芽指數(shù)12.30<0.016.48<0.011.240.31活力指數(shù)18.02<0.018.60<0.012.120.08

2.3 不同采種期的種子鹽脅迫下萌發(fā)幼苗的生長(zhǎng)比較

隨采種期的推移，泡桐幼苗的鮮重和下胚軸長(zhǎng)度呈先增加再降低的趨勢(shì)；隨著鹽濃度的升高，泡桐幼苗鮮重和下胚軸長(zhǎng)度呈逐漸下降趨勢(shì)(圖6)。雙因素方差分析結(jié)果表明，采種期和鹽濃度對(duì)泡桐種子幼苗平均鮮重和下胚軸生長(zhǎng)量有著極顯著的影響(表2)。在不同采種期之間，Ⅱ的種子有著最大的幼苗鮮重和下胚軸長(zhǎng)度，顯著高于其它2個(gè)采種時(shí)間(p<0.05)。在不同鹽濃度之間，泡桐種子下胚軸生長(zhǎng)量在鹽濃度為0和1‰之間差異不顯著(p>0.05)，極顯著大于3‰和5‰(p<0.01)，幼苗平均鮮重在鹽濃度為1‰下顯著大于3‰和5‰(p<0.05)。

圖8 不同采種期種子在鹽脅迫下的幼苗平均鮮重

表2 幼苗生物量指標(biāo)與采種期和鹽濃度的顯著性

指標(biāo) 采種期 鹽濃度 采種期×鹽濃度f(wàn)pfpfp幼苗鮮重8.530<0.015.273<0.011.7410.140胚根生長(zhǎng)量15.520<0.0123.097<0.012.7070.028

3 討 論

3.1 采種期對(duì)泡桐種子質(zhì)量的影響

隨著種子不斷成熟，含水量逐漸降低，可溶性碳水化合物逐漸變?yōu)槟虘B(tài)的蛋白質(zhì)和脂肪，果實(shí)顏色變深，千粒重增加[20-21]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著采集時(shí)間的推遲，泡桐種子含水量逐漸降低，這與喬孝祿等[22]、鄭昀曄等[23]和姚辰等[24]的研究結(jié)果一致。但含水量的降低與種子活力的關(guān)系比較復(fù)雜。喬孝祿等研究表明，沼生櫟種子隨含水量的降低，種子發(fā)芽率逐漸下降，當(dāng)含水量降低至9.0%時(shí)，發(fā)芽率迅速下降為0%[22]。鄭昀曄等指出，煙草種子成熟早期種子含水量迅速下降，當(dāng)含水量低于30%時(shí)下降趨勢(shì)減緩，同時(shí)萌發(fā)能力出現(xiàn)峰值[23]。姚辰等研究表明，隨著水稻種子的逐步發(fā)育，含水量不斷降低，發(fā)芽率不斷提高[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著泡桐種子含水量降低，種子發(fā)芽率呈先增后降趨勢(shì)。表明種子活力與含水量的關(guān)系與樹(shù)種密切相關(guān)。泡桐種子含水量為43.74%、果莢顏色由深綠轉(zhuǎn)為棕黑色時(shí)發(fā)芽率最高，這可以作為在山東地區(qū)采集泡桐種子日期的重要依據(jù)。

采種期對(duì)種子活力和萌發(fā)幼苗生長(zhǎng)有著顯著的影響。一些針葉樹(shù)后期脫落的種子質(zhì)量比早期和中期的差。羅成榮等發(fā)現(xiàn)，柏木種子生理成熟期較其球果形態(tài)成熟期提前10～20 d，而形態(tài)成熟期的種子活力顯著降低，建議在生理成熟期進(jìn)行采種[25]。姚辰等研究表明，水稻授粉9 d后的種子已經(jīng)具備了發(fā)芽能力，17～21 d的種子發(fā)芽率最高，過(guò)熟的種子發(fā)芽率下降[24]。張鵬深入研究了水曲柳種子發(fā)育至成熟過(guò)程中的ABA含量、抑制物質(zhì)活性和胚的離體萌發(fā)能力，發(fā)現(xiàn)種子發(fā)芽能力顯著受到內(nèi)部抑制物質(zhì)活性和ABA含量動(dòng)態(tài)變化的影響[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，泡桐種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均是在第2次采種的9月30日數(shù)值最大，其活力的變化可能與其內(nèi)部抑制物質(zhì)和內(nèi)源激素的變化有關(guān)。同時(shí)，合理的采種還可以顯著提高幼苗的質(zhì)量，這在柏木種子[25]、日本三椏種子[26]都有相似結(jié)果。本研究也發(fā)現(xiàn)，此時(shí)采集的泡桐種子形成的幼苗有著最高的鮮重和下胚軸生長(zhǎng)量。因此，建議山東地區(qū)在9月底左右開(kāi)始觀察，當(dāng)泡桐蒴果顏色變深并逐漸開(kāi)裂時(shí)開(kāi)始試采泡桐種子，測(cè)得種子平均含水量到達(dá)40%左右時(shí)即為最佳采種期，可進(jìn)行大量采收。

3.2 鹽脅迫對(duì)種子萌發(fā)的影響

鹽脅迫是鹽堿地區(qū)種子萌發(fā)成苗最重要的限制因素。大量的研究表明，非鹽生植物的種子隨鹽濃度的不斷增加發(fā)芽率逐漸降低，這在青檀[27]、黑松[28]、羊草[14]、廣布野豌豆[18]上都有相似發(fā)現(xiàn)。對(duì)于泡桐，倪善慶[29]發(fā)現(xiàn)隨著鹽濃度的增加其發(fā)芽率逐漸降低，在單鹽濃度為5‰時(shí)發(fā)芽率為對(duì)照的60%。本研究發(fā)現(xiàn)，不同采種期的泡桐種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)都是隨鹽濃度的增加而降低，在5‰時(shí)發(fā)芽率分別為對(duì)照的25%、71%、35%，與倪善慶[29]的研究結(jié)果相似。鹽脅迫下，黑松種子萌發(fā)形成的幼苗的根長(zhǎng)和根干重顯著降低[28]。王丹[18]發(fā)現(xiàn)廣布野豌豆胚根長(zhǎng)和胚芽長(zhǎng)均隨鹽濃度增加而逐漸降低。本研究發(fā)現(xiàn)，泡桐種子的幼苗鮮重和下胚軸生長(zhǎng)量也是隨鹽濃度增加而顯著降低。對(duì)于羊草，其種子萌發(fā)指標(biāo)均受種子成熟度和鹽脅迫交互作用的影響[14]。而泡桐只有下胚軸生長(zhǎng)量顯著受到種子成熟度和鹽脅迫交互作用的影響，這表明不同植物的適應(yīng)性不同。而植物種子成熟度對(duì)其抗逆能力的影響目前研究較少，需要進(jìn)一步研究。

種子萌發(fā)是實(shí)生苗生產(chǎn)中幼苗建立的關(guān)鍵過(guò)程，其對(duì)抗鹽脅迫的能力與鹽堿地育苗造林成活率密切相關(guān)。而種子采收時(shí)的成熟度是影響種子質(zhì)量的直接因素之一。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著采種期的推移，泡桐種子含水量逐漸降低，種子活力先增加后降低。當(dāng)采種期為9月底左右時(shí)，泡桐蒴果果皮顏色變深、部分開(kāi)裂，種子含水量為40%左右，此時(shí)泡桐種子萌發(fā)能力和抗鹽能力最強(qiáng)。隨鹽脅迫濃度的增加，泡桐種子的發(fā)芽率逐漸降低。在鹽濃度為5‰時(shí)，其發(fā)芽率為對(duì)照的71%，具有一定的耐鹽能力。因此，在泡桐種子成熟后，結(jié)合種子的含水量及果實(shí)外觀，應(yīng)及時(shí)采收，以獲取高活力的種子。