王超 陳劉軍 田偉

摘要：高通量測序技術(shù)可用于精確分析土壤微生物群落，從微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的角度闡釋微生物肥料對有機(jī)農(nóng)田根區(qū)土壤微生物群落的影響。在紅壤有機(jī)農(nóng)田輪作種植條件下，施用微生物肥料后利用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)結(jié)合相關(guān)生物信息學(xué)分析土壤細(xì)菌和真菌的多樣性指數(shù)及群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，從6個有機(jī)農(nóng)田根區(qū)土壤樣本中獲得7 729個細(xì)菌分類操作單元（operational taxonomic units，簡稱OTU）和3 271個真菌OTU，細(xì)菌和真菌文庫測序覆蓋率均在99%以上。微生物肥料會顯著降低土壤細(xì)菌和真菌種群多樣性，且可在一定程度上降低細(xì)菌群落豐富度，顯著降低真菌群落豐富度;并減少根區(qū)土壤特有細(xì)菌和真菌物種數(shù)量。放線菌門、變形菌門和酸桿菌門是優(yōu)勢細(xì)菌，子囊菌門是優(yōu)勢真菌;微生物肥料會提高放線菌門、變形菌門、厚壁菌門和擔(dān)子菌門的相對豐度，分別比對照組提高29.46%、9.17%、129.33%、165.73%;但會降低酸桿菌門、綠彎菌門、子囊菌門、接合菌門的相對豐度，分別比對照組降低30.14%、33.50%、17.27%、86.33%。因此，施用微生物肥料可改變紅壤有機(jī)農(nóng)田根區(qū)土壤細(xì)菌和真菌的豐富度和多樣性，有助于控制作物病害發(fā)生。

關(guān)鍵詞：微生物肥料;根區(qū)土壤;Illumina Miseq高通量測序;微生物群落;種群多樣性;相對豐度

中圖分類號： S144 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0272-05

健康的土壤是農(nóng)業(yè)種植生產(chǎn)的基礎(chǔ)，通過施肥培育健康土壤、提升土地質(zhì)量是當(dāng)前我國農(nóng)業(yè)種植生產(chǎn)中提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。與常規(guī)農(nóng)業(yè)中化學(xué)肥料的大量使用相比，施用生物有機(jī)肥及微生物肥料是當(dāng)前有機(jī)種植生產(chǎn)中改良土壤、增加土壤肥力的重要手段。微生物肥料中含有特定功能的微生物，可以調(diào)控農(nóng)作物的生長發(fā)育，減少或降低作物病蟲害的發(fā)生，改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)[1]。近年來，我國微生物肥料產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，截至2016年7月，農(nóng)業(yè)部登記的微生物肥料產(chǎn)品達(dá)到2 780個，年產(chǎn)量已突破1 000萬t，應(yīng)用面積超過1 333萬hm2[2]。與之相對應(yīng)的是我國有機(jī)作物種植面積的快速增長，截至2015年年底，有機(jī)植物生產(chǎn)面積為222.4萬hm2，有機(jī)生產(chǎn)面積已達(dá)全國農(nóng)業(yè)耕地面積的0.77%[3]。隨著我國有機(jī)作物種植面積的不斷增加，微生物肥料的施用量增加，然而微生物肥料在有機(jī)種植耕作層土壤質(zhì)量提升中的作用尚缺乏明確的科學(xué)依據(jù)。微生物肥料可分為根瘤菌肥料、固氮菌肥料、硅酸鹽細(xì)菌肥料、磷細(xì)菌肥料和復(fù)合微生物肥料，有效活菌數(shù)要求≥1億個/mL[1]。田間施用微生物肥料會將大量微生物引入土壤局部區(qū)域，對有機(jī)種植土壤中原有的微生物群落造成影響，甚至?xí)茐耐寥牢⑸鷳B(tài)平衡。因此，須要科學(xué)評測微生物肥料對有機(jī)農(nóng)田土壤微生物群落的影響。

高通量測序技術(shù)是目前應(yīng)用最普遍的新一代測序技術(shù)，與傳統(tǒng)的瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)、Biolog平板法、磷脂脂肪酸、變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，簡稱PCR-DGGE）和限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，簡稱RFLP）等分析方法相比，具有高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性和低運行成本等特點，通過檢測土壤微生物細(xì)胞內(nèi)特定遺傳物質(zhì)（原核微生物16S rRNA、真核微生物18S rRNA）的堿基序列，可以更全面、更準(zhǔn)確地揭示土壤中微生物群落的復(fù)雜性和多樣性，已被廣泛應(yīng)用于土壤微生物群落研究中[4-6]。本研究基于Illumina新一代MiSeq平臺的高通量測序技術(shù)，結(jié)合相關(guān)生物信息學(xué)方法，全面分析土壤細(xì)菌16S rRNA基因V3+V4區(qū)和真菌ITS1區(qū)的多樣性指數(shù)及群落結(jié)構(gòu)，旨在研究云南地區(qū)紅壤有機(jī)農(nóng)田在輪作種植條件下，微生物肥料對有機(jī)農(nóng)田根區(qū)土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響，以期科學(xué)地反映施用微生物肥料對有機(jī)種植土壤健康的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

田間試驗選址在云南蕓嶺鮮生農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司莊科基地有機(jī)蔬菜田（102°52′33.8″E，25°13′53.7″N），土壤類型為紅壤，年平均氣溫為14.9 ℃，年日照時數(shù)為2 205.1 h，無霜期為278 d，年均降水量約為1 000.5 mm。經(jīng)本研究種植前采樣分析測定得出，試驗田0～20 cm土壤基本性質(zhì)：pH值為 6.25，銨態(tài)氮含量為27.27 mg/kg，速效磷含量為 37.53 mg/kg，速效鉀含量為342.06 mg/kg，有機(jī)質(zhì)含量為33.37 g/kg。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2017年5—10月進(jìn)行，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，共設(shè)置2個處理，分別為微生物肥料處理（N）和對照（C），每個處理設(shè)置3次重復(fù)，共6個小區(qū)，每個小區(qū)面積為3 m×10 m=30 m2，保護(hù)行寬為1 m，走道寬及小區(qū)間排水溝寬均為 0.5 m。試驗作物為辣椒（Capsicum annuum L.），前茬作物為青菜（Brassica chinensis L.）。微生物肥料處理組于辣椒定植后和盛花期分別在根部施用微生物肥料的200倍稀釋液，對照組施用等量灌溉水。田間管理及有害生物防治采取有機(jī)種植模式。

微生物肥料由南京農(nóng)大生物源農(nóng)藥創(chuàng)制有限公司提供，已通過南京國環(huán)有機(jī)產(chǎn)品認(rèn)證中心有機(jī)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料評估（證明號：IP-0109-932-1696），被廣泛應(yīng)用于江蘇等地區(qū)的有機(jī)種植;登記證號為微生物肥（2013）準(zhǔn)字（1096）號，有效菌種為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），有效活菌數(shù)≥2.0億個/mL，pH值為3.5～5.0。

1.3 土壤樣品采集

土壤樣品采集于盛果期進(jìn)行，用土壤采樣器鉆取各處理小區(qū)0～20 cm根區(qū)的土壤，按照“S”形多點取樣，每個小區(qū)取6鉆土壤，去除根系、雜草、土壤動物和石塊等雜質(zhì)后充分混勻作為1個根區(qū)土壤樣品，采用四分法將其平均分成2份，低溫保存帶回實驗室，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 土壤濕化性質(zhì)測定

土壤樣品經(jīng)自然風(fēng)干、研磨過篩（孔徑為1 mm）后，參照文獻(xiàn)[7]中的方法測定土壤理化性質(zhì)。其中，pH值使用pH計測定（土水體積比為1 ∶ 5）;土壤樣品經(jīng)濃度為0.5 mol/L的K2SO4溶液浸提1 h后，用連續(xù)流動分析儀測定氨態(tài)氮含量;速效磷含量采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-分光光度法測定;速效鉀含量采用1 mol/L乙酸銨浸提-火焰光度法測定;有機(jī)質(zhì)含量采用油浴外加熱-K2Cr2O7容量法測定。

1.5 土壤微生物總DNA提取和高通量測序

采用E.Z.N.A. Soil DNA Kit（OMEGA，美國）試劑盒提取土壤微生物總DNA，采用NanoDrop-ND1000測定提取的DNA濃度，并經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳對DNA樣品進(jìn)行檢測，合格后用于構(gòu)建文庫;以各土壤樣品微生物總DNA為模板，以細(xì)菌V3+V4區(qū)特異性引物（338F 5′-ACTCCTACGGGAG GCAGCAG-3′;806R 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）[8]和真菌ITS1區(qū)特異性引物（ITS1F 5′-CTTGGTCATTTA GAGGAAGTAA-3′;2043R 5′-GCTGCGTTCTTCATCGATG C-3′）[4]進(jìn)行PCR擴(kuò)增;采用Illumina MiSeq測序平臺對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙端測序分析，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成測序。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

測序數(shù)據(jù)通過FLASH[9]和Trimmomatic[10]軟件進(jìn)行過濾優(yōu)化和雙端序列的連接，優(yōu)質(zhì)序列利用Usearch軟件基于97%的相似水平進(jìn)行分類操作單元（operational taxonomic units，簡稱OTU）聚類，根據(jù)Silva細(xì)菌數(shù)據(jù)庫[11]和Unite真菌數(shù)據(jù)庫利用RDP Classifier進(jìn)行物種注釋和分類[12];基于OTU豐度信息，利用R語言工具進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，簡稱PCA），制作稀釋曲線（rarefaction curve）、Venn圖和群落柱形圖;利用Mothur軟件計算α-多樣性指數(shù)（Shannon、Simpson、Chao、ACE等指數(shù)）[5，13]，并用Excel和DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物文庫測序結(jié)果評價

本研究對6個土壤樣品進(jìn)行了Illumina MiSeq高通量測序，數(shù)據(jù)經(jīng)過濾優(yōu)化，細(xì)菌文庫共得到296 292條有效序列，序列長度分布在256～532 bp之間，在97%相似水平上聚類獲得7 729個OTU;真菌文庫共得到429 870條有效序列，序列長度分布在202～456 bp之間，在97%相似水平上聚類獲得3 271個OTU。細(xì)菌V3+V4區(qū)、真菌ITS1區(qū)的有效序列數(shù)量和OTU數(shù)量如表1所示，處理組和對照組細(xì)菌文庫的有效序列數(shù)量和OTU數(shù)量差異不顯著;處理組真菌文庫的OTU數(shù)量顯著低于對照組，兩者有效序列數(shù)量差異不顯著。

稀釋曲線反映了樣品文庫測序數(shù)據(jù)量的合理性，可用于評價測序數(shù)據(jù)能否覆蓋所有類群。細(xì)菌和真菌多樣性稀釋曲線（圖1）顯示，隨著測序量的不斷增大，各樣品OTU數(shù)目的增加趨勢趨于平緩（基本達(dá)到飽和），說明測序數(shù)據(jù)量合理。在97%相似水平上計算各土壤樣品測序的覆蓋率，由表2可知，細(xì)菌、真菌文庫測序覆蓋率均在99%以上，說明取樣合理，處理組間微生物文庫測序覆蓋率差異不顯著。因此，測序數(shù)據(jù)能夠真實地反映土壤樣品中的微生物群落，但可能仍有少量微生物種類未被發(fā)現(xiàn)。

2.2 微生物肥料對根區(qū)土壤微生物群落豐富度和多樣性的影響

Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)用于反映土壤樣品中微生物的多樣性，前者數(shù)值越大，表明群落多樣性越高;后者數(shù)值越大，表明群落多樣性越低[14]。由表2可知，與對照組相比，施用微生物肥料后，有機(jī)農(nóng)田根區(qū)土壤細(xì)菌Shannon指數(shù)顯著降低，Simpson指數(shù)顯著升高，幅度分別為6.84%、170.31%;土壤真菌Shannon指數(shù)顯著降低，Simpson指數(shù)顯著升高，幅度分別為30.57%、125.08%?？梢?，有機(jī)農(nóng)田根區(qū)土壤施用微生物肥料會顯著降低細(xì)菌和真菌的種群多樣性。

ACE指數(shù)、Chao指數(shù)可反映群落物種豐富度。由表2可知，有機(jī)農(nóng)田根區(qū)土壤細(xì)菌ACE指數(shù)、Chao指數(shù)在施用微生物肥料后均有所降低，幅度分別為2.76%、2.05%，與對照組差異不顯著;與對照組相比，施用微生物肥料可以顯著降低真菌的ACE指數(shù)、Chao指數(shù)，分別降低29.28%、35.57%。結(jié)果表明，有機(jī)農(nóng)田根區(qū)土壤施用微生物肥料可在一定程度上降低細(xì)菌群落豐富度，但顯著降低真菌群落豐富度。

2.3 施用微生物肥料后根區(qū)土壤微生物類群分析

由表1可知，在97%相似度水平上，對照組、處理組土壤樣品分別得到1 309、1 267個細(xì)菌OTU，兩者差異不顯著;分別得到685、405個真菌OTU，對照組顯著高于處理組。可見，微生物肥料可在一定程度上降低根區(qū)土壤微生物類群的特異性。

Venn圖可直觀展現(xiàn)并反映組間或樣品之間OTU數(shù)量組成相似性、重疊情況以及特異性[15]。由圖2-A可知，對照組和處理組之間共有的細(xì)菌OTU數(shù)量為1 300個，代表物種（占比超過1.5%的綱）分別屬于放線菌綱（Actinobacteria）和α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）。對照組、處理組特有的OTU數(shù)量分別為41、26個，說明施用微生物肥料會減少根區(qū)土壤特有細(xì)菌物種。從圖2-B可以看出，對照組和處理組共有的真菌OTU數(shù)量為456個，主要共有物種（占比超過5%的綱）分別屬于銀耳綱（Tremellomycetes）和糞殼菌綱（Sordariomycetes）等。對照組、處理組特有的OTU數(shù)量分別為334、21個，說明施用微生物肥料會減少根區(qū)土壤特有真菌物種。

PCA是一種對數(shù)據(jù)進(jìn)行簡化分析的技術(shù)，通過分析不同樣本群落組成，反映樣本間的差異和距離，如樣本物種組成越相似，反映在PCA圖中的距離越近[16]。在97%相似度水平上，對不同處理組土壤樣品細(xì)菌OTU組成進(jìn)行主成分提取，方差最大化正交旋轉(zhuǎn)后（P=0.05）提取了2個主成分，貢獻(xiàn)率分別為75.51%、10.57%（圖3-A），處理組和對照組的樣本圍繞主成分1軸完全分開，分別分布在主成分1軸的正軸、負(fù)軸，說明處理組和對照組根區(qū)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯。真菌OTU PCA獲得了貢獻(xiàn)率分別為81.59%、8.30%的2個主成分（圖3-B），處理組的3個樣本分布在主成分1軸的正軸，對照組分布在主成分1軸的負(fù)軸，表明處理組和對照組根區(qū)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯。

2.4 微生物肥料對根區(qū)土壤微生物群落分布特征的影響

在門分類水平上的細(xì)菌類群分布及相對豐度如圖4-A所示，有機(jī)農(nóng)田根區(qū)土壤樣品中的細(xì)菌包含放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）等菌群，處理組和對照組細(xì)菌群落組成相似;除未分類的其他菌群外，放線菌門、變形菌門和酸桿菌門的相對豐度較高，屬于優(yōu)勢細(xì)菌;施用微生物肥料可不同程度地提高放線菌門、變形菌門和厚壁菌門的相對豐度，分別比對照組提高29.46%、9.17%、129.33%;降低根區(qū)土壤酸桿菌門、綠彎菌門和芽單胞菌門的相對豐度，分別比對照組降低30.14%、

33.50%、30.41%。從細(xì)菌科的分類水平上（圖 4-B）看，除未確定科類外，有機(jī)農(nóng)田根區(qū)土壤中細(xì)球菌科（Micrococcaceae）、鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）和芽單胞菌科（Gemmatimonadaceae）的相對豐度均較高（相對豐度>3%），屬于優(yōu)勢細(xì)菌;施用微生物肥料可使芽單胞桿菌科的相對豐度降低30.27%，細(xì)球菌科、鞘脂單胞菌科的相對豐度分別升高137.55%、10.88%。

圖4-C為根區(qū)土壤真菌在門分類水平上的類群分布及相對豐度，子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）等在處理組和對照組土壤樣品中均有分布，其中子囊菌門是優(yōu)勢菌群，相對豐度占比超過56%;受限于數(shù)據(jù)庫的原因，相對豐度排名第4的菌群未能分類;施用微生物肥料使子囊菌門、接合菌門的相對豐度分別降低 17.27%、86.33%，擔(dān)子菌門的相對豐度提高165.73%。由圖4-D可知，有機(jī)農(nóng)田根區(qū)土壤真菌在科水平上主要包括叢赤殼科（Nectriaceae）、毛殼菌科（Chaetomiaceae）、被孢霉科（Mortierellaceae）等;施用微生物肥料可提高毛殼菌科的相對豐度，比對照組提高286.45%，降低叢赤殼科和被孢霉科的相對豐度，分別比對照組降低 7.44%、86.61%。

3 討論與結(jié)論

當(dāng)前，高通量測序技術(shù)已被廣泛用于土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)及多樣性研究中[6]。針對外源有益微生物對有機(jī)農(nóng)田土壤微生態(tài)影響的研究鮮有報道，本研究基于Illumina MiSeq平臺，對云南地區(qū)紅壤有機(jī)農(nóng)田根區(qū)土壤細(xì)菌16S rRNA基因V3+V4區(qū)域和真菌ITS1區(qū)域進(jìn)行高通量測序，結(jié)合相關(guān)生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)，處理組和對照組根區(qū)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異明顯，微生物肥料會顯著降低土壤真菌群落多樣性和豐富度，與Zhao等在西瓜種植中應(yīng)用菌肥的研究結(jié)果[17]一致。基于Silva、Unite數(shù)據(jù)庫分析顯示，在有機(jī)農(nóng)田根區(qū)土壤中，放線菌門、變形菌門、酸桿菌門等是主要細(xì)菌類群，與楊亞東等針對不同類型農(nóng)田土壤分析得到的細(xì)菌優(yōu)勢類群相似[18-19]，表明農(nóng)田土壤中細(xì)菌的優(yōu)勢類群相似;子囊菌門、擔(dān)子菌門、接合菌門等是主要真菌類群，與陳丹梅等對云南植煙紅壤土壤微生物群落的研究結(jié)果[20]一致。

α-多樣性指數(shù)是有效評價土壤微生物群落多樣性和物種豐富度的指標(biāo)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，施用微生物肥料顯著降低了有機(jī)農(nóng)田根區(qū)土壤細(xì)菌多樣性Shannon指數(shù)，豐富度ACE指數(shù)、Chao指數(shù)分別比對照組降低2.76%、2.05%，與以往研究得出的植物根際促生細(xì)菌（plant growth-promoting rhizobacterium，簡稱PGPR）能提高土壤細(xì)菌種群多樣性的結(jié)論[22-23]不一致，可能因為微生物肥料中枯草芽孢桿菌的拮抗作用影響了其他土壤細(xì)菌的生存。大多植物病原菌為真菌，康捷等發(fā)現(xiàn)，麻山藥糊頭病和根莖腐病發(fā)病植株土壤真菌多樣性和豐富度均高于健康植株土壤[24];本研究結(jié)果顯示，微生物肥料能顯著降低有機(jī)農(nóng)田根區(qū)土壤真菌多樣性和豐富度，與Luo等的研究結(jié)果[25]一致，表明微生物肥料會在一定程度上減少有機(jī)農(nóng)田作物受病原真菌侵害的幾率?？莶菅挎邨U菌是目前研究較多的生防細(xì)菌之一，對多種植物病原菌具有抑制作用[26]，本研究選用的微生物肥料也已被證實對作物真菌病害具有防治效果[27-28]。

植物對土傳病害的抗性與根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，抗病品種根際土壤放線菌數(shù)量和比例明顯高于感病品種[29]。姜飛等發(fā)現(xiàn)，嫁接辣椒植株根際土壤放線菌比例增加是其根腐病抗性增強(qiáng)的重要原因[30]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，施用微生物肥料后，處理組根區(qū)土壤放線菌門的相對豐度比對照組提高29.46%;同時發(fā)現(xiàn)，施用微生物肥料會提高根區(qū)土壤真菌毛殼菌科的相對豐度。施用玉米秸稈生物炭后，黃瓜結(jié)果期土壤子囊菌門毛殼菌科比例明顯提高[31]，本研究結(jié)果與之一致。毛殼菌對病原菌的拮抗作用主要體現(xiàn)在重寄生和產(chǎn)生毛殼素等抗生素方面，是重要的植物病害生防真菌[32]?？梢姡┯梦⑸锓柿嫌兄诳刂朴袡C(jī)農(nóng)田作物病害的發(fā)生。

土壤微生物類群復(fù)雜，微生物群落特征是微生物種群協(xié)同作用的結(jié)果，不能依照單一或某幾個種群的變化闡釋微生物肥料對有機(jī)農(nóng)田土壤微生物群落的影響，后續(xù)研究將進(jìn)行長期定位連續(xù)觀測，結(jié)合土傳病害嚴(yán)重度進(jìn)一步揭示其影響作用。本研究發(fā)現(xiàn)，根區(qū)土壤微生物中未分類或未確定種屬的物種也受微生物肥料的影響，受限于數(shù)據(jù)庫的原因，未能解釋，有待通過深度測序或利用其他先進(jìn)手段對這些微生物進(jìn)行更細(xì)致、更深入的分類研究。

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