程雨飛，朱向濤，季 雯，洪爾蔓，林 芯，范 貞，張俊麗

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)暨陽學(xué)院，浙江 諸暨 311899；2.臨沂市園林局，山東 臨沂 276037；3.濰坊職業(yè)學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，山東 濰坊 262737）

【研究意義】牡丹（Paeonia suffruticosa L.）為芍藥科芍藥屬亞灌木，是名貴的觀賞和藥用植物。其花大色艷，觀賞價值高，是我國傳統(tǒng)十大名花之一。然而，傳統(tǒng)的牡丹育種方法周期長、選擇效率低，無法滿足日益增長的牡丹市場需求。組織培養(yǎng)作為高效的繁殖方法，可以提高繁殖效率，具有較好的應(yīng)用前景［1］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前牡丹組織培養(yǎng)研究主要集中在體細(xì)胞胚發(fā)生和器官發(fā)生兩大方面。關(guān)于牡丹體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展，通過改變添加物［2］、植物生長調(diào)節(jié)劑［3］、外植體成熟度［4］來提高體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)率。器官發(fā)生途徑在牡丹組織培養(yǎng)中研究較多也較早，以牡丹莖段［5］、葉柄、莖尖［6］為外植體通過試驗(yàn)建立牡丹離體快繁體系，雖已有一定基礎(chǔ)，但愈傷組織增殖和分化困難、增殖過程中褐化嚴(yán)重［7］以及生根難［8］等問題仍然存在，也是制約牡丹離體快繁體系建立的主要問題。通過組織培養(yǎng)建立高效牡丹繁殖體系是目前研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，而兩種組織培養(yǎng)途徑都需要大量愈傷組織作為材料，因此獲得大量愈傷組織是牡丹組織培養(yǎng)體系建立的基礎(chǔ)。而愈傷組織的繼代增殖是愈傷組織大量繁殖與分化成功與否的關(guān)鍵［9］?，F(xiàn)階段，牡丹愈傷組織增殖過程存在的主要問題是增殖系數(shù)低［10］、褐化率高。有研究表明，在不同質(zhì)量濃度的PIC處理下，鳳丹牡丹的增殖系數(shù)存在顯著差異［11］。而光源CCFLs（冷陰極熒光燈）［12］、KT（呋喃甲氨基嘌呤）［13］可一定程度上促進(jìn)牡丹愈傷組織生長。關(guān)于牡丹增殖過程中易褐化的現(xiàn)象，有研究發(fā)現(xiàn)低溫培養(yǎng)［11］、添加適宜濃度硝酸銀［14］、PVP（聚乙烯吡咯烷酮）［15］、活性炭、去除培養(yǎng)基中Cu2+［16］、添加不同糖源或不同質(zhì)量濃度蔗糖培養(yǎng)基［17］進(jìn)行增殖培養(yǎng)等措施，都可有效降低褐化率。但關(guān)于預(yù)培養(yǎng)時間和赤霉素（GA3）對牡丹愈傷組織增殖及增殖過程中褐化情況的影響，尚未見報道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】以牡丹胚軸、子葉愈傷組織為材料，研究了不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合及濃度、不同外植體預(yù)培養(yǎng)時間以及GA3對牡丹愈傷組織增殖的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】確定牡丹胚軸、子葉愈傷組織適合的增殖培養(yǎng)基以及預(yù)培養(yǎng)時間，有效抑制增殖過程中的褐化現(xiàn)象，以期通過愈傷組織大量增殖、分化奠定基礎(chǔ)，進(jìn)一步建立牡丹離體再生體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以不同生長階段的胚軸愈傷組織和子葉愈傷組織為材料，供試牡丹品種為‘鳳丹白’，種子采自浙江農(nóng)林大學(xué)暨陽學(xué)院的牡丹圃。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理 試驗(yàn)在浙江農(nóng)林大學(xué)暨陽學(xué)院組培室進(jìn)行，晴天上午，取生長狀況良好的成熟牡丹種子，裝入樣品袋，帶回組培室進(jìn)行表面滅菌：用軟刷刷去表面污垢，2% NaClO浸泡20 min。然后置于超凈工作臺內(nèi)，用無菌水沖洗3～5遍，70%酒精消毒10 s后，無菌水沖洗3～5遍，將表面水分用無菌濾紙吸干，在超凈工作臺將種胚取出接于培養(yǎng)基 NAA 3.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+TDZ 1.0 mg/L中進(jìn)行暗培養(yǎng)。種胚暗培養(yǎng)30 d后，切取胚軸與子葉部分，分別接種于上述相同培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)，得到牡丹胚軸愈傷組織和子葉愈傷組織。

1.2.2 不同培養(yǎng)基對愈傷組織增殖的影響 以MS為基本培養(yǎng)基，采用L9（34）設(shè)計4因素3水平的正交試驗(yàn)（表1），共9個處理。將牡丹胚軸、子葉愈傷組織轉(zhuǎn)接至試驗(yàn)培養(yǎng)基（蔗糖30.0 g/L、瓊脂7.0 g/L，pH 5.8）中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度24（±1）℃、光照時間10 h/L、光照強(qiáng)度30～50 μmol/m2·s，每個處理3次重復(fù)。每隔15 d記錄愈傷組織的增重量、褐化情況，30 d為一個繼代周期。愈傷組織質(zhì)量用電子天平測量，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計愈傷組織在增殖過程中的褐化情況，統(tǒng)計愈傷組織的增殖倍數(shù)，方法如下：

愈傷組織增殖倍數(shù)=愈傷組織繼代30 d增長質(zhì)量/繼代初質(zhì)量

愈傷組織褐化情況：將愈傷組織褐化情況分為4個等級：0級，無褐化；1級，輕微褐化，褐化部分占愈傷組織總體積1/10以下；2級，中度褐化，褐化部分占愈傷組織總體積的1/10～1/3；3級，重度褐化，褐化部分占愈傷組織總體積1/3以上（圖1）。

數(shù)據(jù)用Excel統(tǒng)計，運(yùn)用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVE）和鄧肯多重比較（Duncan）。

表1 L9（34）愈傷增殖試驗(yàn)因素水平Table1 Factors in L9 (34) callus proliferation test

圖1 牡丹愈傷組織增殖過程中的褐化等級Fig.1 Browning level during peony callus proliferation

1.2.3 不同預(yù)培養(yǎng)時間對愈傷組織增殖的影響把誘導(dǎo)出的牡丹胚軸、子葉愈傷組織接入相同培養(yǎng)基NAA 3.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+TDZ 1.0 mg/L中，在黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)時間分別為30、60、90 d，在空白培養(yǎng)基上進(jìn)行3 d過渡培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接至篩選出的最佳增殖培養(yǎng)基（蔗糖30.0 g/L、瓊脂7.0 g/L，pH 5.8）。培養(yǎng)條件為溫度24（±1）℃、光照時間 10 h/L、光照強(qiáng)度 30～50 μmol/m2·s，每個處理3次重復(fù)。每隔15 d記錄愈傷組織的增重量、褐化情況，統(tǒng)計方法如1.2.2。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹愈傷組織繼代增殖最佳培養(yǎng)基篩選

2.2.1 牡丹胚軸愈傷組織繼代增殖最佳培養(yǎng)基表2顯示，牡丹胚軸愈傷組織在不同培養(yǎng)基組合上的增殖效果差異顯著。其中增殖倍數(shù)最高的是4號培養(yǎng)基、為5.75，最低的是1號培養(yǎng)基、為2.69。胚軸愈傷組織在3、4、9號培養(yǎng)基中褐化程度最輕。綜合來看，4號培養(yǎng)基（PVP 1.0 g/L+IAA 0.2 mg/L+TDZ 1.0 mg/L+GA31.0 mg/L）是牡丹胚軸愈傷組織增殖繼代的最佳組合。

表2 不同培養(yǎng)基對牡丹胚軸愈傷組織繼代增殖的影響Table2 Effects of different media on subculture mulitiplication of peony hypocotyl callus

2.2.2 牡丹子葉愈傷組織繼代增殖最佳培養(yǎng)基由表3可知，牡丹子葉愈傷組織在不同培養(yǎng)基組合上的增殖效果差異顯著。其中增殖倍數(shù)最高的是8號培養(yǎng)基、為5.50，最低的是1號培養(yǎng)基、為3.13。子葉愈傷組織在3、4、8號培養(yǎng)基中褐化程度最輕。綜合來看，8號培養(yǎng)基（PVP 2.0 g/L+IAA 0.5 mg/L+TDZ 0.5 mg/L+GA31.0 mg/L）是牡丹子葉愈傷組織增殖繼代的最佳組合。

表3 不同培養(yǎng)基對牡丹子葉愈傷組織繼代增殖的影響Table3 Effects of different media on subculture mulitiplication of peony cotyledon callus

2.2 赤霉素對牡丹愈傷組織繼代增殖的影響

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牡丹胚軸愈傷組織3、4、9號處理組（表2）以及子葉愈傷組織3、4、8號處理組（表3）增殖培養(yǎng)30 d后未出現(xiàn)明顯褐化現(xiàn)象。以上6個處理中，GA3濃度均為1.0 mg/L。牡丹胚軸愈傷組織培養(yǎng)基中GA3濃度為1.0 mg/L的處理組，增殖倍數(shù)為5.28、5.75、4.14，增殖倍數(shù)較高，分別為第1、2、3位；牡丹子葉愈傷組織培養(yǎng)基中，GA3濃度為1.0 mg/L的處理組，增殖倍數(shù)為4.25、5.50、5.41，增殖倍數(shù)也處于較高水平，分別為第1、2、4位。可見，1.0 mg/L GA3有利于抑制愈傷組織增殖過程中的褐化現(xiàn)象，并促進(jìn)愈傷組織增殖。

圖2 牡丹愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)30 d后未出現(xiàn)明顯褐化組別Fig.2 Groups without obvious browning after 30d of subculture mulitiplication of peony callus

2.3 不同外植體預(yù)培養(yǎng)時間對牡丹愈傷組織繼代增殖的影響

從圖3和表4可以看出，預(yù)培養(yǎng)不同時間的外植體其增殖情況不同。預(yù)培養(yǎng)30 d的愈傷組織相較于預(yù)培養(yǎng)60、90 d的愈傷組織，增殖倍數(shù)最高，褐化程度最輕，隨著預(yù)培養(yǎng)時間的增長，愈傷組織的增殖倍數(shù)呈降低后升高的變化趨勢，差異明顯，褐化程度則更嚴(yán)重。綜合來看，不同外植體預(yù)培養(yǎng)時間影響愈傷組織增殖和褐化情況，在增殖繼代中利用預(yù)培養(yǎng)30 d的愈傷組織，有利于提高增殖倍數(shù)、減輕褐化現(xiàn)象。

圖3 預(yù)培養(yǎng)30 d愈傷組織繼代增殖Fig.3 Multiplication of callus precultured for 30 d

表4 不同外植體預(yù)培養(yǎng)時間對牡丹愈傷組織繼代增殖的影響Table4 Effects of different explant preculture time on multiplication of peony callus

2.4 不同愈傷組織狀態(tài)對牡丹愈傷組織繼代增殖的影響

研究過程中發(fā)現(xiàn)，愈傷組織在繼代增殖過程中，狀態(tài)大致可以分為3種情況：（1）表面附著一層絮狀物，與愈傷組織一起增大，愈傷整體呈淡黃綠色，略為松軟（圖4A）；（2）頂部呈顆粒狀的愈傷組織不再增長，基部密實(shí)的愈傷組織不斷增大，愈傷組織軟硬適中（圖4B）；（3）新舊愈傷組織呈相同活性，愈傷組織整體增殖變大，顏色逐漸翠綠，硬度逐漸增大（圖4C）。呈現(xiàn)第1種狀態(tài)的愈傷組織，在整個增殖培養(yǎng)過程中的狀態(tài)比較穩(wěn)定，不易褐化且中后期體積增殖變化明顯；呈現(xiàn)第2種狀態(tài)的愈傷組織，在增殖過程中存在一定的褐化現(xiàn)象，不嚴(yán)重，體積增長情況則穩(wěn)定且緩慢；呈現(xiàn)第3種狀態(tài)的愈傷組織，在增殖培養(yǎng)前期表現(xiàn)十分突出，體積增大較快，但到中后期往往不再增長，且極易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。

圖4 牡丹愈傷組織繼代增殖狀態(tài)Fig.4 Status of subculture multiplication of peony callus

3 討論

褐化問題是木本植物組培試驗(yàn)中常見的問題［18］，而增殖系數(shù)不高則是現(xiàn)階段牡丹愈傷組織增殖過程存在的主要難題。本試驗(yàn)通過研究不同添加物組合及濃度、不同預(yù)培養(yǎng)時間，對影響褐化情況和增殖倍數(shù)的因素進(jìn)行了系統(tǒng)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)增殖過程中添加1.0 mg/L GA3時，牡丹愈傷組織增殖倍數(shù)提高且不易褐化，添加其他濃度或未添加GA3的處理組則發(fā)生了不同程度的褐變。GA3是一種植物生長調(diào)節(jié)劑，在牡丹領(lǐng)域常用于解除種子休眠［19］、促進(jìn)種子生根和發(fā)芽［20］、延緩葉片衰老［21］，但在愈傷組織增殖方面應(yīng)用較少。有研究表明，GA3可影響黃冠梨［22］和紅葉石楠［23］的增殖率，并對渝茶1號的增殖和生長都有很好的促進(jìn)作用［24］，這與本試驗(yàn)的結(jié)果相一致。在組培試驗(yàn)中，添加抗褐化劑可減輕外植體褐化情況，且不同抗褐化劑對不同種類植物的抗褐化效果及作用機(jī)理存在差異。例如，Vc作為一種抗氧化劑對總酚的形成和積累有一定的抑制作用、AC能吸附植物在組織培養(yǎng)中分泌的酚類物質(zhì)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1.0 mg/L GA3可有效抑制牡丹愈傷組織增殖過程中的褐化現(xiàn)象，有研究表明GA3也能有效抑制冬凌草褐化［25］，可能是適量的GA3可阻止組織中多酚氧化酶被激活或酚類化合物被氧化，但具體作用機(jī)理還需進(jìn)一步研究。與以往GA3在植物方面多應(yīng)用于打破種子休眠、調(diào)控花期不同，可以考慮將其作為一種新型抗褐化劑應(yīng)用于組培試驗(yàn)。

本研究結(jié)果表明，增殖過程中采用預(yù)培養(yǎng)30 d的愈傷組織相較于采用預(yù)培養(yǎng)60 d和90 d的愈傷組織，可以獲得更高的增殖倍數(shù)，且褐化程度差異明顯。在繼代增殖中，預(yù)培養(yǎng)30 d的愈傷組織增長最快、體積變化最為明顯、且褐化程度最輕，預(yù)培養(yǎng)60 d的愈傷組織次之，預(yù)培養(yǎng)90 d的愈傷組織增殖情況最差且極易出現(xiàn)褐化情況，這可能是由于體內(nèi)積累太多代謝產(chǎn)物，從而促進(jìn)酚類化合物的合成［26］。有研究表明，經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的油菜子葉和下胚軸愈傷組織分化效果較好［27］，這為牡丹分化研究提供了思路。與前人研究不同的是，本試驗(yàn)中采用的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基，與愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同，不同預(yù)培養(yǎng)時間改變的可能是愈傷組織成熟度，在今后的增殖試驗(yàn)中，可通過調(diào)整預(yù)培養(yǎng)階段培養(yǎng)基中的生長調(diào)節(jié)劑及外源添加物種類來進(jìn)行優(yōu)化，以期得到更好的增殖效果。

研究中還發(fā)現(xiàn)，愈傷組織的狀態(tài)很大程度上影響愈傷組織的增殖情況，呈現(xiàn)淡黃綠色且質(zhì)地松軟的愈傷組織在增殖過程中生長迅速，不易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，可以穩(wěn)定增殖。而呈現(xiàn)翠綠色且質(zhì)地堅(jiān)硬的愈傷組織，在增殖前期體積變化較為明顯，但中后期生長十分緩慢，且狀態(tài)極不穩(wěn)定、易褐化。在本試驗(yàn)中，前者多為預(yù)培養(yǎng)30 d的愈傷組織，而顏色較深硬度較大的后者則多為預(yù)培養(yǎng)90 d的愈傷組織。有關(guān)研究表明，黃綠色較疏松的華北八寶愈傷組織［28］、淡黃顆粒疏松的苧麻愈傷組織［29］、淡黃色至黃褐色的蓮藕愈傷組織［30］、淡黃色的水稻愈傷組織［31］狀態(tài)良好、生長旺盛，這與本研究結(jié)果一致。當(dāng)愈傷組織處于上述狀態(tài)時即可進(jìn)行增殖，并可考慮將這兩種愈傷組織進(jìn)行電鏡觀察，柔軟與堅(jiān)硬的區(qū)別可能是生理結(jié)構(gòu)層面出現(xiàn)了變化，有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

1.0 mg/L GA3有利于促進(jìn)牡丹愈傷組織的增殖并抑制愈傷組織增殖過程中的褐化現(xiàn)象，30 d是繼代增殖最適宜的外植體預(yù)培養(yǎng)時間，呈淡黃綠色且質(zhì)地松軟的愈傷組織在增殖過程中生長量大且不易褐化。但褐化仍是牡丹組織培養(yǎng)中較為重要的難題，因此對牡丹外植體培養(yǎng)過程中的生長調(diào)節(jié)劑種類選擇與濃度配比、抗褐化劑的選取等，仍然需要進(jìn)一步深入研究。