陳 競，謝玉清，代金平，古麗·艾合買提，張慧濤，

王志方，楊新平，秦新政，王小武，馮 蕾

(新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物應用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物重點實驗室， 烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】糞肥腐熟是在一系列微生物作用下，將其降解轉化為穩(wěn)定的腐殖質的生物化學過程[1]。腐熟過程中微生物的種類和數(shù)量與腐熟周期以及腐熟產(chǎn)品的質量都息息相關[2]，添加功能菌劑不僅可以改善功能微生物菌群數(shù)量和結構，同時可以加快堆肥反應進程，提高堆料分解率[3-4]。所以，分析評價糞肥腐熟過程中的菌群結構和數(shù)量及其肥效，對功能菌劑的添加和腐熟工藝的控制具有重要的指導意義?！厩叭搜芯窟M展】李杰等[5-8]的]研究表明,添加外源菌劑可使牛糞腐熟提前5 d達到最高溫度，同時堆料pH值降低，總有機碳降解速度加快，種子發(fā)芽指數(shù)提前20 d符合堆肥標準( GI>80%)。李敬波等[9-10]研究發(fā)現(xiàn)，添加腐熟菌劑可使牛糞便堆肥細菌數(shù)量和放線菌數(shù)量提高，而真菌數(shù)量則降低，微生物總數(shù)提高。已有的研究結果充分證明功能菌劑與糞肥腐熟過程中菌群變化和有機肥的品質緊密相關?！颈狙芯壳腥朦c】目前，將高通量測序技術結合熒光定量PCR技術應用于有機肥的研究較少?；诠δ芫鷦┑奶砑佑绊懠S肥腐熟的菌群結構和數(shù)量以及品質，研究利用不同來源的糞肥配方進行發(fā)酵處理，應用高通量測序技術和熒光定量PCR技術快速、靈敏、準確、特異性強和重復性好的優(yōu)點[11-14]。對腐熟過程中微生物群落變化進行動態(tài)研究。【擬解決的關鍵問題】研究不同配方糞肥腐熟微生物群落的結構和豐度變化規(guī)律,分析品質和肥效，為功能菌劑添加和腐熟工藝優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

牛糞、羊糞、雞糞取自新疆農(nóng)業(yè)科學院安寧渠養(yǎng)殖場，自然晾干，分別稱取1 kg混勻備用。菌劑為自篩菌劑，活菌數(shù)為109cfu/mL，主要由釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)及布氏乳桿菌(Lactobacillusparabuchneri)復配而成，菌劑添加量為1‰。配料為添加1%麩皮，物料和菌劑拌勻后裝于塑料袋中，室溫下(25～30℃)半密封發(fā)酵30 d，其中NA、YA、JA、為牛糞、羊糞、雞糞各處理腐熟后樣本，N5為牛糞對照組(不加菌劑)，NAP、YAP、JAP、N5P、為樣品在穴盤完成番茄育苗試驗后除去番茄根須后的混合物，CKP為蛭石育苗后的混合物。表1

表1 堆肥樣品編號及處理
Table 1 Compost sample ID and its processing table

編號Number原料Raw material配方Formula菌劑Bacteria agent水Water(mL)時間Time(d)NA(YJF1.2)牛糞1 000 g1%麩皮1‰1 000 30YA(YJF1.3)羊糞1 000 g1%麩皮1‰1 00030JA(YJF1.1)雞糞1 000 g1%麩皮1‰1 00030N5(YJF3.1)牛糞1 000 g1%麩皮-1 00030NAP(YJF2.1)NA 蛭石--30 YAP(YJF2.2)YA 蛭石--30JAP(YJF2.3)JA 蛭石--30N5P(YJF3.2)N5 蛭石--30CKP(YJF4.1)蛭石---30

1.2 方 法

1.2.1 樣品總DNA提取及高通量測序

NA、YA、JA、N5發(fā)酵滿30 d后翻料拌勻取樣，NAP、YAP、JAP、N5P、CKP完成番茄育苗試驗后除去番茄根須后混勻取樣，參考陳競等[15]的方法提取樣品總DNA。將DNA送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行16S rDNA V4高通量測序。

根據(jù)物種注釋結果，選取每個樣品在門水平(Phylum)上最大豐度排名前10的物種，生成物種相對豐度柱形累加圖，以便直觀查看各樣品在門水平上，相對豐度較高的物種及其比例。

1.2.2 糞肥樣品實時熒光定量PCR

分別以甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)及類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)16S rDNA序列為模板，設計熒光定量PCR引物，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的引物為M1 ：GAGAACAGATTTGTGGGATTGG，M2：CGTGTCGTGAGATGTTGGGT；類球紅細菌的引物為GH3(F): GCCTCGGCCAAGACCAACC，GH4(R): GCTCGCCGGTGATGAAGATGGG，由上海生物工程技術服務有限公司合成。熒光定量PCR由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.2.3 糞肥理化指標

取樣方法同上，各取三份，樣品理化性質由新疆農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)節(jié)水與土壤肥料研究所完成，采用國標方法，檢測項目有pH、有機質、EC值、總氮、總磷、總鉀。

1.2.4 番茄育苗試驗

將各自翻料拌勻的糞肥樣品分別以1%添加量點樣用于番茄的苗期肥效試驗。以蛭石為基質，加水至濕潤狀態(tài)，放入浸泡后的番茄種子，再覆蓋一層蛭石。室內(nèi)光照條件培養(yǎng)，一周后幼苗長出2片子葉后，將有機肥分別施入基質中，距離幼苗根部1 cm左右。每天澆水，對照苗不施肥，同等澆水管理，記錄其長勢情況，觀察各處理間幼苗的生長差異。

番茄育苗共做6個處理，其中4個添加糞肥處理樣品，一個空白對照，一個營養(yǎng)液對照，30 d后每個處理隨機抽樣選取10株幼苗進行測量，錄入數(shù)據(jù)均為平均數(shù)。

2 結果與分析

2.1 高通量測序

2.1.1 不同處理樣品細菌門水平優(yōu)勢類群和相對豐度

研究表明，門水平物種相對豐度柱形圖顯示厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Cemmatimonadetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、綠彎菌門(Chloroflexi)、 藍藻細菌門(Cyanobacteria)的微生物總量的比例大于97%。其中厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)占有絕對優(yōu)勢。其中，以牛糞樣品的處理為例，添加菌劑的處理YJF1.2(NA)比不添加菌劑的處理YJF3.1(N5)功能菌群優(yōu)勢明顯。育苗前后相比，未加菌劑的處理N5和YJF3.2(N5P)菌群結構變化不明顯，而其余添加菌劑的處理菌群結構有明顯變化，添加菌劑可改變育苗基質中微生物群落的結構。圖1

圖1 門水平上的物種相對豐度
Fig. 1 The relative abundance of the top bacteria at the Phylum level

2.1.2 不同處理樣品豐度聚類熱圖

根據(jù)所有樣品在屬水平的物種注釋及豐度信息，選取豐度排名前35的屬，根據(jù)其在每個樣品中的豐度信息，從物種和樣品兩個層面進行聚類，繪制成熱圖，便于發(fā)現(xiàn)哪些物種在哪些樣品中聚集較多或含量較低?？v向為樣品信息，橫向為物種注釋信息，圖中左側的聚類樹為物種聚類樹；上方的聚類樹為樣品組間的聚類樹。 圖2

圖2 物種豐度聚類熱圖
Fig. 2 Clustering analysis heatmap of bacteria based on the genus level

2.2 甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)RT-PCR

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)和類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)樣品DNA Real-Time PCR擴增，每個樣品DNA做三個重復，Cp值相近，重復性較好。溶解曲線均為單峰，進一步證明標準曲線的準確可靠。圖3～6

圖3 甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)基因擴增曲線
Fig.3 the amplification curve ofBacillusmethylotrophicusgene

研究表明，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)和類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)在不同處理有機肥中的豐度均有所不同，在添加菌劑的糞肥處理樣NA和JA中以及育苗后期樣品NAP和JAP中均有很高的拷貝數(shù)，分別達到268×105、150×105、135×105和170×105。以牛糞和雞糞為原料的糞便肥有利于腐熟菌劑中的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌和類球紅細菌的增殖。圖7、圖8

圖4 甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)基因熔解曲線
Fig.4 the Melting curve ofBacillusmethylotrophicusgene

圖5 類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)基因擴增曲線
Fig.5 the amplification curve ofRhodobactersphaeroidesgene

圖6 類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)基因熔解曲線
Fig.6 the Melting curve ofRhodobactersphaeroidesgene

圖7 各處理中甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)CP值及拷貝數(shù)
Fig. 7 The CP value and number ofcopiesofBacillusmethylotrophicusgene

圖8 各處理中類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)CP值及拷貝數(shù)Fig. 8TheCPvalueandnumberofcopiesofRhodobacter sphaeroidesgene

2.3 樣品理化指標

研究表明，牛糞添加輔料和菌劑NA發(fā)酵最終pH降至5.74，有機質達到56.74%，全氮5.23%，而對照N5的pH為8.93，有機質16.6%，全氮1.02%，添加輔料和菌劑能使肥料加快腐熟并酸化，大幅提升有機質和全氮含量，酸性有利于肥料保存和堿性土壤的改良，有機質和全氮是肥效的關鍵指標。表2

表2 主要理化指標分析結果Table2Mainphysiochemicalindexes

樣品SamplepH值pH電導率EC(ms/cm)有機質(%)Organic matter全氮(%)Total nitrogen全磷(%)Total phosphorus全鉀(%)Total potassiumYA4.789.0856.4705.122.021.82NA5.7410.2356.7405.231.612.27JA5.9010.3257.0305.702.882.13N58.395.9016.6001.021.202.18NAp9.850.971.2400.121.274.62JAp9.670.821.3900.111.804.50CKp10.200.671.2500.061.374.86

2.4 番茄育苗

研究表明，不同原料的處理優(yōu)勢菌群各有所不同，NA優(yōu)勢菌群為德沃斯氏菌屬(Devosia)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、乳酸菌(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)，YJF1.3(YA)優(yōu)勢菌群為不動桿菌屬(Acinetobacter)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、Turicibacter屬，YJF1.1(JA)優(yōu)勢菌群是浮霉狀菌屬(Planctomyces)、亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)；育苗前后的處理相比，育苗前添加菌劑處理的糞肥樣品NA、YA和JA其豐富度低而優(yōu)勢菌群種類單一，育苗后 YJF2.1(NAP)、YJF2.3(JAP)、YJF4.1(CKP)的優(yōu)勢菌群豐富度明顯提高，表明腐熟糞肥的添加有助于番茄生長過程基質中菌群的多樣化，其中NAP 中的叢毛單胞菌屬(Comamonas)，NAP和JAP中的短波單胞菌屬(Brevundmonas)和變形桿菌(Dyadobacter)，NAP、JAP和CKP中的鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)和假單胞菌(Pseudpmonas)均有較高的豐度，而N5和N5P的腐熟樣品和穴盤樣品菌群變化則不明顯。

研究表明，不同的處理方法對植株的4個指標影響各不相同，牛糞NA處理平均株高比對照組高47.16%；羊糞YA處理平均株高比對照組高46.28%；雞糞處理JA平均株高比對照組高47.65%；牛糞不加菌劑處理的N5處理株高比對照組高3.62%。NA、YA、JA各項指標均顯著高于對照組，表觀性狀葉色深綠且莖粗剛毛發(fā)達，肥效非常顯著；而牛糞不加輔料和菌劑直接發(fā)酵的肥效不明顯。營養(yǎng)液組葉色表現(xiàn)為嫩綠，莖粗相對較細，剛毛不發(fā)達。由于受到育苗人造光源等環(huán)境條件的限制，番茄苗整體長勢較弱，但株高差異明顯，只對比了株高數(shù)據(jù)。表3

表3 不同處理糞肥下番茄幼苗生長變化
Table 3 Effects of different treatments on the growth of Tomato Seedlings

編號Number株高Plant height葉數(shù)Number of blades子葉長Cotyledon length子葉寬Cotyledon lengthYA(YJF1.3)14.954.452.380.83NA(YJF1.2)15.045.452.620.75JA(YJF1.1)15.094.632.290.77N5(YJF3.1)10.593.092.110.79CK10.222.092.080.69營養(yǎng)液(Nutrient solution)12.092.722.230.74

3 討 論

堆肥是由群落結構演替非常迅速的多個微生物群體共同作用而實現(xiàn)固體廢物資源化、無害化的一個動態(tài)過程，微生物在其中發(fā)揮了主要作用，是決定堆肥發(fā)酵周期和品質的關鍵因素[16-17]。利用高通量測序手段得到所要研究的微生物群落中包含的所有DNA信息，通過這些序列信息可以從群落結構水平上全面認識微生物的特征和功能，高通量測序技術作為一種微生物免培養(yǎng)的快速檢測技術，能夠對糞肥樣品中的大部分微生物進行種類和豐度鑒定，對于準確分析添加菌劑對糞肥腐熟過程菌群的影響具有重要的意義[18-19]。而RT-PCR技術可對糞肥腐熟中特定的功能微生物進行準確的定量分析，進而研究其生長和增殖規(guī)律[20]。研究結合這兩種技術對糞肥腐熟過程中優(yōu)勢微生物群落結構和豐度、功能微生物的數(shù)量進行分析，探明了添加自篩腐熟菌劑對糞肥腐熟中菌群結構及其肥效的影響。結果表明，在牛、羊、雞糞中添加自篩腐熟菌劑進行處理，可有效增加了糞肥中功能菌群數(shù)量、優(yōu)化優(yōu)勢菌群結構、并促進肥料酸化、顯著提高肥料有機質和全氮含量，腐熟后的糞肥對番茄苗期生長肥效顯著。

4 結 論

在所有處理樣品中，厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)占有絕對優(yōu)勢。其中，在牛糞樣品的處理中，添加菌劑的處理NA比不添加菌劑的處理N5功能菌群優(yōu)勢變化明顯；育苗前后相比，育苗前添加菌劑處理的糞肥樣品NA、YA和JA其豐富度低但優(yōu)勢菌群卻非常明顯，育苗后NAP、JAP的優(yōu)勢菌群的豐富度明顯增高，其中叢毛單胞菌屬(Comamonas)、短波單胞菌屬(Brevundmonas)、變形桿菌(Dyadobacter)、鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)和假單胞菌(Pseudpmonas)均表現(xiàn)較高的豐度，而未加菌劑處理的腐熟樣品和穴盤樣品N5和N5P菌群變化不明顯。添加腐熟菌劑可明顯促進糞肥中優(yōu)勢功能菌群的增殖，加快腐熟速度，菌劑處理的糞肥可明顯改變育苗基質中微生物群落的結構，增加菌群豐富度和功能菌數(shù)量。添加菌劑能促進肥料酸化，提升有機質和全氮含量，酸性有利于肥料保存和堿性土壤的改良，有機質和全氮是肥效的關鍵指標。以牛糞和雞糞為原料的糞肥有利于腐熟菌劑中的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌和類球紅細菌的增殖，同番茄育苗試驗結果一致。NA、YA、JA處理的育苗各項指標均顯著高于對照組，番茄平均株高分別比對照組高47.16%、46.28%和47.65%。