盧春化 馬艷梅 王紅霞 薛 凌

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，錦州121000)

流感病毒感染所致的“細(xì)胞因子風(fēng)暴”是高發(fā)病率和病死率的主要原因，機(jī)體感染后可產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子，如TNF-α、IFN-α、IFN-β、IL-6、IL-1、MCP-1等[1-2]。炎癥介質(zhì)失衡的同時(shí)產(chǎn)生過量的氧自由基，引起脂質(zhì)過氧化，直接誘導(dǎo)組織損傷。MDA、GSH-Px及SOD水平是監(jiān)測(cè)脂質(zhì)過氧化的代表性指標(biāo)。MDA是脂質(zhì)過氧化作用的終產(chǎn)物，反映脂質(zhì)過氧化程度[3]。而SOD、GSH及GSH-Px是維持機(jī)體氧化系統(tǒng)平衡的關(guān)鍵酶。當(dāng)損傷性刺激破壞內(nèi)膜氧化呼吸鏈，激發(fā)氧化應(yīng)激時(shí)，產(chǎn)生的活性氧、脂類、氧化蛋白質(zhì)等激活Caspase-3、Caspase-8，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4]。

近來研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖具有抗癌、抗病毒、抗凋亡、抗氧化等多種生物活性[5]。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建小鼠流感肺損傷模型，應(yīng)用黃芪多糖干預(yù)，探討其對(duì)PR8所致小鼠肺損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6小鼠40只，6周齡，雌性，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自北京維通利華有限公司。

1.1.2主要試劑 黃芪多糖(C10H7ClN2O2S，分子量254.69)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；SOD、MDA、GSH試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；RNA提取及qPCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自QIAGEN；Caspase-3、8、9及β-actin抗體購(gòu)自Abcam。

1.2方法

1.2.1小鼠模型的建立及給藥 分為正常對(duì)照組、PR8模型組、黃芪多糖治療組、黃芪多糖預(yù)防組、利巴韋林對(duì)照組，每組8只。黃芪多糖預(yù)防組:于感染流感病毒PR8前7 d，給予黃芪多糖200 mg/(kg·d)，灌胃給藥，連續(xù)給藥7 d。之后用乙醚將各組小鼠麻醉，正常對(duì)照組滴鼻30 μl無菌PBS，其余各組滴鼻30 μl PR8稀釋液(滴度:103pfu/鼠)[6]。除預(yù)防組外，各組小鼠在PR8感染24 h 后灌胃，1次/d，連續(xù)4 d。正常對(duì)照組和PR8模型組:灌胃100 μl無菌PBS；黃芪多糖治療組灌胃100 μl 黃芪多糖(2 000 mg/kg),利巴韋林對(duì)照組灌胃利巴韋林(100 mg/kg)。

1.2.2標(biāo)本采集 PR8感染后第5天進(jìn)行眼球采血，加入含EDTA-Na2的采血管中，3 000 r/min離心10 min，吸上清于EP管，-20℃保存。打開胸腔無菌取肺。

1.2.3小鼠肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率 肺組織用無菌PBS洗凈、吸干，稱重。肺指數(shù)=(肺重/體質(zhì)量)×100%，肺指數(shù)抑制率=(模型組平均肺指數(shù)-實(shí)驗(yàn)組平均肺指數(shù))/模型組平均肺指數(shù)×100%。

1.2.4肺組織HE染色 肺左葉用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色。

1.2.5SOD、GSH-Px、MDA水平 檢測(cè)血清和肺組織中MDA、SOD、GSH-Px水平，按試劑說明書進(jìn)行。

1.2.6qPCR檢測(cè)TNF-α、IFN-α、IL-6、IL-1β mRNA水平 用QIAGEN組織勻漿器將小鼠肺組織勻漿，提取總RNA。引物由TaKaRa公司合成，見表1。反應(yīng)條件95℃ 5 min；95℃ 25 s，60℃ 25 s，72℃ 30 s 40 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7Western blot檢測(cè)凋亡蛋白表達(dá) 肺組織剪碎，液氮研磨，將研好組織轉(zhuǎn)至1.5 ml EP管中，加入800 μl Lysis buffer與PMSF的混合液，4℃ 12 000 r/min 離心10 min，吸上清液至EP管中，進(jìn)行BSA定量。100℃ 10 min變性，進(jìn)行SDS-PAGE。加樣10 μl，電壓調(diào)至80 V，電泳約20 min，調(diào)電壓至110 V，待所檢測(cè)條帶跑至適合的位置停止電泳。120 mA恒流120 min轉(zhuǎn)膜，5%BSA室溫封閉1 h。加1∶1 000 Caspase-3/1∶1 000 Caspase-8/1∶1 000 Caspase-9/1∶5 000 actin一抗稀釋液后，自封袋壓膜，4℃搖床過夜。加1∶5 000羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h。ECL發(fā)光，8 bit存圖。Scion Image 4.03軟件分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用單因素方差分析、兩兩比較法(LSD法)分析結(jié)果。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1黃芪多糖對(duì)肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率的影響 PR8模型組與正常對(duì)照組肺指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；黃芪多糖治療組、預(yù)防組、利巴韋林對(duì)照組與PR8模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01；P<0.05；P<0.01)，見表2。

2.2HE染色 PR8模型組肺組織出現(xiàn)彌漫性肺水腫及出血，肺組織實(shí)變及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡間隔破損斷裂。黃芪多糖治療組和利巴韋林對(duì)照組較PR8模型組病變減輕，形態(tài)較完整，有少量炎性細(xì)胞滲出。黃芪多糖預(yù)防組肺泡壁呈輕度增厚，伴肺泡損傷出血，有中度炎性細(xì)胞滲出，見圖1。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequence

Primer nameDirectionSequenceTNF-αF5′-TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAA-3′R5′-TGGCTCTGCAGGATTTTCATG-3′IFN-αF5′-GTCACTACGAATCGCACCTGATCAC-3′R5′-CCGATGTATAGACATTCCTCTGG-3′IL-6F5′-TGATGCACTTGCAGAAAACAA-3′R5′-GGTCTTGGTCCTTAGCCACTC-3′IL-1βF5′-AAGGAGAACCAAGCACGACAAAA-3′R5′-TGGGGAACTCTGCAGACTCAAACT-3′GAPDHF5′-TGCACCACCAACTGCTTAG-3′R5′-GGATGCAGGGATGATGTTC-3′

GroupsLung indexInhibition rate(%)Normal control group0.73±0.07-PR8 group1.42±0.111)-Post-APS group0.98±0.133)30.99Pre-APS group1.25±0.142)11.97Ribavirin control group0.85±0.093)40.14

Note：Compared to group A,1)P<0.01;compared to group B,2)P<0.05,3)P<0.01.

2.3血清及肺組織中MDA、GSH-Px、SOD水平 PR8模型組與正常對(duì)照組相比，MDA顯著升高(P<0.01)，GSH-Px、SOD活性顯著降低(P<0.01)；與PR8模型組比較，黃芪多糖治療組和利巴韋林對(duì)照組MDA含量顯著降低(P<0.01)，GSH-Px、SOD活性顯著升高(P<0.01)；與PR8模型組比較，黃芪多糖預(yù)防組MDA水平在一定程度上降低(P<0.05)，GSH-Px、SOD活性呈上升趨勢(shì) (P<0.05)。見表3、4 。

圖1 肺組織病理變化(A～E，×100；F～H，×400)Fig.1 Pathological changes of lung tissue(A-E，×100；F-H，×400)Note: A.Normal control group;B.PR8 group;C.Astragalus polysaccharide treatment group;D.Astragalus polysaccharide prevention group;E.Ribavirin control group;F.Infiltration of inflammatory cell (PR8 group);G.Diffuse hyperplasia of the surrounding tissues of the trachea (PR8 group);H.Inflammatory exudate of the trachea (PR8 group).

GroupsMDA(nmol/ml)GSH-Px(U/ml)SOD(U/ml)Normal control group5.54±0.76312.54±16.11 438.74±10.65 PR8 group26.37±3.241)75.07±4.371)274.23±6.231)Post-APS group11.49±1.073)223.38±14.083)388.34±8.543)Pre-APS group23.90±0.792)98.14±5.642)294.45±7.062)Ribavirin control group8.16±1.133)278.80±13.043)403.34±9.853)

Note：Compared to group A,1)P<0.01;compared to group B,2)P<0.05,3)P<0.01.

GroupsMDA(nmol/mg prot)GSH-Px(U/mg prot)SOD(U/mg prot)Normal control group0.87±0.0834.50±1.4042.07±2.03PR8 group3.88±0.111)19.08±0.561)26.86±1.691)Post-APS group1.95±0.143)25.43±1.073)34.86±2.323)Pre-APS group3.27±0.162)21.72±1.382)29.53±2.172)Ribavirin control group1.36±0.073)29.98±1.233)35.87±2.013)

Note：Compared to group A,1)P<0.01;compared to group B,2)P<0.05,3)P<0.01.

2.4TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-α mRNA表達(dá)水平 PR8模型組肺組織中TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-α mRNA表達(dá)量較正常對(duì)照組明顯減少(P<0.01)，黃芪多糖治療組、預(yù)防組和利巴韋林對(duì)照組TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-α 表達(dá)與PR8模型組比較顯著降低(P<0.01)。見圖2 。

2.5凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況 PR8模型組肺組織中Caspase-3、8、9蛋白表達(dá)量較正常對(duì)照組明顯增加(P<0.01)；黃芪多糖治療組、預(yù)防組和利巴韋林對(duì)照組Caspase-3、8、9蛋白表達(dá)量較PR8模型組明顯減少(P<0.01)。見圖3、4。

圖2 肺組織TNF-α、IL-6、IL-1、IFN-α mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression levels of TNF-α,IL-6,IL-1 and IFN-α mRNA of lung tissueNote: Compared to normal control group,▲.P<0.01;compared to PR8 group,△.P<0.01.

圖3 肺組織凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、8、9的表達(dá)Fig.3 Expression of apoptosis-associated protein Caspase-3,8,and 9 in lung tissueNote: 1.Normal control group;2.PR8 group;3.Astragalus polysaccharide treatment group;4.Astragalus polysaccharide prevention group;5.Ribavirin control group.

圖4 肺組織凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、8、9的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression levels of apoptosis-related proteins Caspase-3,8,and 9 of lung tissueNote: Compared to normal contrl group,▲.P<0.01;compared to PR8 group,△.P<0.01.

3 討論

流感病毒所致機(jī)體急性肺損傷主要機(jī)制“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，流感病毒感染機(jī)體后通過級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞因子如TNF-α、IFN-α、IL-6、IL-1β的大量產(chǎn)生。炎癥介質(zhì)失衡誘發(fā)脂質(zhì)過氧化，最終導(dǎo)致組織損傷?？寡趸锕入赘孰?GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)等所維持的氧化還原平衡失調(diào)，導(dǎo)致外源性或內(nèi)源性氧化物堆積，激發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)。大量研究結(jié)果表明，氧化損傷是病毒誘發(fā)細(xì)胞損傷或凋亡的主要途徑，通過啟動(dòng)JNK對(duì)轉(zhuǎn)錄因子磷酸化修飾并調(diào)節(jié)下游靶基因轉(zhuǎn)錄，激活Caspase蛋白家族，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。

實(shí)踐證明，黃芪多糖是中醫(yī)治療肺熱咳嗽，高熱煩渴的有效藥物，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和抗炎以及抗癌等多種功效[8]。Abdullahi等[9]報(bào)道黃芪多糖和人參多糖能提高血清IgG抗體水平和細(xì)胞因子(IL-2、IL-10和IFN-γ)表達(dá)，具備改善免疫應(yīng)答的潛力，可用作H5N1疫苗制劑的佐劑。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芪多糖治療和預(yù)防性給藥均顯著改善PR8小鼠肺病理損傷，對(duì)小鼠急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用，可見，黃芪多糖不僅可應(yīng)用于治療流感感染，還可作為流感的預(yù)防性用藥。而黃芪多糖是否可以用于甲型H1N1疫苗的佐劑以提高疫苗的預(yù)防效果仍需要進(jìn)一步的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖治療和預(yù)防給藥降低細(xì)胞因子TNF-α、IFN-α、IL-6、IL-1β表達(dá)，緩解因炎癥介質(zhì)失衡而引起的脂質(zhì)過氧化，并能顯著上調(diào)抗氧化物GSH-Px、SOD活性以改善機(jī)體的氧化還原狀態(tài)，提高機(jī)體的抗氧化水平。Zhang等[10]實(shí)驗(yàn)表明黃芪多糖下調(diào)炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α mRNA水平，抑制禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)在雞胚腎細(xì)胞中復(fù)制。Xue等[11]研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖降低氧化應(yīng)激反應(yīng)以抑制豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)復(fù)制，降低細(xì)胞中MDA水平，提高GSH-Px和SOD活性。由此可見，炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激與病毒感染緊密相關(guān)，黃芪多糖能下調(diào)流感病毒引發(fā)的過度炎癥損傷和氧化應(yīng)激水平。

PR8組凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、8、9顯著上升，提示PR8通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡引發(fā)肺損傷。應(yīng)用黃芪多糖干預(yù)后，機(jī)體通過下調(diào)Caspase-3、8、9表達(dá)，發(fā)揮對(duì)肺組織的保護(hù)作用。由此可見，黃芪多糖在緩解流感急性肺損傷進(jìn)程中具有積極作用。Xie等[12]在對(duì)黃芪多糖干預(yù)人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HCMEC)缺氧/復(fù)氧(HR)損傷機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖通過降低ROS、MDA和Bax水平，抑制Caspase-3的活性，提高NO、SOD、Bcl-2、PI3K水平，以保護(hù)HCMEC免受缺氧/復(fù)氧損傷。Liu等[13]研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖下調(diào)Caspase-3、Bax及上調(diào)Bcl-2蛋白水平，減少細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，逆轉(zhuǎn)心肌缺血再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。結(jié)合MDA、GSH-Px、SOD指標(biāo)，分析可見PR8所致的脂質(zhì)超氧化產(chǎn)物堆積及細(xì)胞抗氧化水平降低，這兩方面共同促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而黃芪多糖通過提高胞內(nèi)過氧化物分解酶活性，緩解脂質(zhì)過氧化進(jìn)程，提高機(jī)體抗氧化水平，緩解細(xì)胞凋亡進(jìn)程。最新研究顯示，細(xì)胞凋亡在甲型流感病毒感染的早期階段增加，在感染的晚期細(xì)胞焦亡占主體。提示在H1N1感染的早期階段病毒誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生細(xì)胞凋亡，但細(xì)胞死亡途徑在感染的晚期向細(xì)胞焦亡轉(zhuǎn)變[14]。下一步本課題組將研究黃芪多糖對(duì)PR8感染小鼠晚期細(xì)胞焦亡的影響，以期探索H1N1感染過程中細(xì)胞焦亡的發(fā)生及黃芪多糖的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

綜上所述，黃芪多糖通過下調(diào)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，有效減少PR8所致急性肺損傷氧自由基的產(chǎn)生，提高對(duì)氧自由基的清除力，下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、8、9的表達(dá)，從而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡及保護(hù)肺組織的作用，為臨床應(yīng)用中藥黃芪多糖治療流感提供依據(jù)，為中醫(yī)藥治療流感提供新思路。