王涵，薛彬，史建峰，韓倩倩，王春仁中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京市，102629

0 引言

皮膚是人體面積最大的器官，具有復(fù)雜的多層結(jié)構(gòu)，是抵御外部刺激的第一道防線。皮膚非常容易受到創(chuàng)傷、燒傷、炎癥等因素的損害，而皮膚創(chuàng)傷修復(fù)、尤其是慢性創(chuàng)傷修復(fù)的過(guò)程及其潛在的病理生理學(xué)變化是非常復(fù)雜的，如何進(jìn)行皮膚快速而可靠的再生也一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。

皮膚替代物可起到對(duì)創(chuàng)面臨時(shí)性封閉、保護(hù)創(chuàng)面，阻擋異物和病原體入侵，防止組織液丟失的作用，同時(shí)一些皮膚替代物中還含有生物活性物質(zhì)，可促進(jìn)機(jī)體創(chuàng)面周圍的細(xì)胞增殖，加速創(chuàng)面愈合。目前的皮膚替代物種類較多，組織工程皮膚及新型的皮膚替代物發(fā)展迅速，在其應(yīng)用于臨床前選擇恰當(dāng)方法對(duì)其有效性進(jìn)行合理評(píng)價(jià)是必要的。

1 皮膚替代物的發(fā)展概況

1.1 傳統(tǒng)皮膚替代物

傳統(tǒng)皮膚替代物在傷口愈合過(guò)程中起到暫時(shí)性屏障作用，主要包括同種人工合成膜、同種異體皮、異種皮等幾大類。人工合成膜主要是由生物材料制成的各種薄膜、涂膜、噴霧膜等，常用材料有膠原、聚乳酸、透明質(zhì)酸、海藻酸鹽等；同種異體皮常來(lái)源于遺體捐獻(xiàn)者的皮膚，也可用小兒包皮環(huán)切所棄皮膚，是僅次于自體皮的暫時(shí)性皮膚替代物；異種皮多為豬來(lái)源，制備過(guò)程復(fù)雜，有一定的免疫原性，且與同種異體皮一樣在使用過(guò)程中均存在傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)[1]。

1.2 組織工程皮膚

目前公認(rèn)的組織工程皮膚是指由種子細(xì)胞和支架材料體外三維構(gòu)建培養(yǎng)成的皮膚替代物，但廣義上還包括僅由細(xì)胞或僅由支架組成的組織工程化皮膚產(chǎn)品。現(xiàn)今臨床上用于移植的組織工程皮膚主要分為3類：真皮替代物、表皮替代物和全皮替代物，市場(chǎng)上針對(duì)這3類都已有成熟的產(chǎn)品出現(xiàn)。如Dermagraft,TransCyte等真皮替代物；Epicel等表皮替代物；Apligraf 等全皮替代物。中國(guó)對(duì)組織工程皮膚的研究，近年來(lái)也已取得了一定成果。安體膚作為國(guó)內(nèi)首例組織工程皮膚，已順利實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。組織工程皮膚不僅是一種活性敷料，且由于包含細(xì)胞、天然細(xì)胞外基質(zhì)、生長(zhǎng)因子等生物活性物質(zhì)，可促進(jìn)機(jī)體創(chuàng)周及創(chuàng)基的細(xì)胞增殖與血管新生，縮短愈合時(shí)間。

1.3 創(chuàng)面愈合治療的新方法

1.3.1 理想皮膚替代物的要求

目前應(yīng)用的傳統(tǒng)皮膚替代物或組織工程皮膚，僅含有表皮、真皮兩個(gè)層次或之一，不包含正常皮膚的毛囊、血管、汗腺以及黑色素細(xì)胞等皮下組織結(jié)構(gòu)。因此移植的皮膚愈合較慢，耗時(shí)較長(zhǎng)，有移植失敗的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，含細(xì)胞的組織工程皮膚產(chǎn)品保質(zhì)期短，生產(chǎn)和運(yùn)輸成本較高，產(chǎn)品型號(hào)較單一，也并非最理想的皮膚替代物。

理想的皮膚替代物應(yīng)該有如下特征：能抵抗感染；能防止皮膚脫水；能抵抗?fàn)坷蛡谌毖?；價(jià)格合理；制備、使用及儲(chǔ)存方便；適用范圍廣且儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)；無(wú)免疫原性；有靈活的厚度；能與不規(guī)則傷口緊貼；能長(zhǎng)期貼合于愈合時(shí)間較長(zhǎng)的創(chuàng)面；能長(zhǎng)時(shí)間覆蓋于創(chuàng)口表面；能再造表皮、真皮及附屬器官[2]。

1.3.2 新技術(shù)在皮膚替代物中的應(yīng)用

新的生物材料、干細(xì)胞及3D打印技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了皮膚替代物的發(fā)展。干細(xì)胞可通過(guò)釋放生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)、蛋白酶等來(lái)參與創(chuàng)面修復(fù)，提高創(chuàng)面修復(fù)的質(zhì)量；組織誘導(dǎo)材料、干細(xì)胞及3D打印技術(shù)的結(jié)合是3D打印皮膚的研究熱點(diǎn)[3-6]。利用NIKS細(xì)胞進(jìn)行增殖制備而成的StrataGraft已被美國(guó)FDA認(rèn)定為再生醫(yī)學(xué)先進(jìn)療法領(lǐng)域的首個(gè)產(chǎn)品，在臨床上也被證明有較好的療效[7-9]。

2 皮膚替代物的有效性評(píng)價(jià)

2.1 體外試驗(yàn)

在進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)前對(duì)皮膚替代物進(jìn)行體外試驗(yàn)研究可以幫助我們理解傷口愈合的機(jī)制及傷口愈合中的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。體外試驗(yàn)可針對(duì)產(chǎn)品的具體用途進(jìn)行設(shè)計(jì)，相對(duì)經(jīng)濟(jì)、快速。

細(xì)胞劃痕試驗(yàn)、Transwell細(xì)胞遷移試驗(yàn)、體外成血管試驗(yàn)等均是目前比較常用的體外試驗(yàn)，可定量評(píng)價(jià)體外創(chuàng)傷愈合。3D器官模型，如3D表皮模型、3D全層皮膚模型更能準(zhǔn)確反映受試物作用于人體后的功效，實(shí)現(xiàn)多維數(shù)據(jù)的檢測(cè)，目前也已經(jīng)有多種商業(yè)化的3D皮膚模型出現(xiàn)，為相關(guān)的研究提供了便利。在進(jìn)行體外試驗(yàn)過(guò)程中結(jié)合相關(guān)生物標(biāo)記物（如IL-1，IL-6，MMPs等）的識(shí)別及測(cè)定，對(duì)評(píng)價(jià)創(chuàng)面愈合的效果也有重要的意義。通過(guò)計(jì)算機(jī)模型結(jié)合組織再生過(guò)程中涉及的生物化學(xué)和生物物理過(guò)程也可對(duì)支架和組織替代物的設(shè)計(jì)進(jìn)行指導(dǎo)。體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ捅M管可提供關(guān)于皮膚的一部分或者多組成部分的相關(guān)信息，但是未必與體內(nèi)試驗(yàn)的結(jié)果相關(guān)，傷口愈合研究的理想模型不僅要模擬人體皮膚傷口類型的結(jié)構(gòu)，而且要模擬細(xì)胞和分子間的相互作用[11-13]。

2.2 體內(nèi)試驗(yàn)

由于人創(chuàng)面標(biāo)本在臨床上取材受限制，在對(duì)皮膚替代物創(chuàng)面修復(fù)的有效性進(jìn)行臨床前研究時(shí)常需建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

2.2.1 動(dòng)物種屬的選擇

杜洛克豬是公認(rèn)的研究人皮膚病理及創(chuàng)傷愈合的理想動(dòng)物模型，它與人的表皮結(jié)構(gòu)、神經(jīng)密度、基質(zhì)厚度和其它生物學(xué)指標(biāo)相似。但作為動(dòng)物模型來(lái)說(shuō)成本較高，且很多分子生物學(xué)試劑對(duì)豬也是不適用的，用其進(jìn)行科學(xué)研究工作相對(duì)來(lái)說(shuō)難度較大。

鼠相對(duì)來(lái)說(shuō)是更具有可行性的模型[14]。但需注意的是，雖然人和鼠的皮膚都由表皮層、真皮層及皮下組織三層構(gòu)成，但是每層的解剖學(xué)及生理學(xué)均有差異。同時(shí)，鼠具有廣泛的薄肌肉層（只在人的頸闊肌中發(fā)現(xiàn)），能使傷口在創(chuàng)傷后迅速收縮，傷口收縮的程度與人皮膚間存在較大的差異。另外，以鼠為試驗(yàn)動(dòng)物時(shí)也需考慮不同性別鼠皮膚的解剖及生理差異。

斑馬魚、非洲爪蟾、蠑螈等作為研究皮膚創(chuàng)面愈合的新型動(dòng)物，其創(chuàng)面是以無(wú)瘢痕方式愈合的，也在近年來(lái)用于創(chuàng)面修復(fù)的研究[15]。

2.2.2 研究創(chuàng)面修復(fù)有效性的常用模型

目前常用于皮膚替代物有效性研究的模型主要分三類：急性傷口愈合模型，包括切開性傷口模型、切除性傷口模型、燒燙傷模型等；慢性創(chuàng)傷模型、包括感染傷口模型、局部缺血性傷口模型、糖尿病潰瘍模型等；病理性瘢痕模型，包括裸鼠瘢痕移植模型、兔耳增生性瘢痕模型等。其中切開性急性創(chuàng)口模型因?yàn)闃?gòu)建所需要的材料和技術(shù)簡(jiǎn)單、可重復(fù)性強(qiáng)，目前最常用[16-19]。

將人皮膚移植到裸鼠背部，在生物環(huán)境下進(jìn)行人皮膚移植物的研究也是體內(nèi)研究皮膚創(chuàng)傷愈合的方法之一。當(dāng)然，人體創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中必要的炎癥及免疫反應(yīng)在免疫缺陷小鼠體內(nèi)必然減弱，這些因素也會(huì)限制用其得到的結(jié)果與人的相關(guān)性。

2.2.3 有效性評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇

創(chuàng)傷愈合可通過(guò)大體和組織學(xué)聯(lián)合觀察，生物化學(xué)和生物機(jī)械學(xué)測(cè)量，創(chuàng)傷愈合標(biāo)志物的分析，常將細(xì)胞學(xué)反應(yīng)和免疫學(xué)反應(yīng)結(jié)合來(lái)分析創(chuàng)傷修復(fù)的過(guò)程[20-21]。常用指標(biāo)有創(chuàng)面愈合率、創(chuàng)面愈合時(shí)間及組織組織病理學(xué)分析等。創(chuàng)面愈合率可對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行拍照后應(yīng)用Image J等圖像分析軟件對(duì)愈合面積進(jìn)行測(cè)定；創(chuàng)面愈合時(shí)間是創(chuàng)面完全上皮化所需要的時(shí)間，而上皮化依靠肉眼觀察；用組織學(xué)病理學(xué)方法評(píng)價(jià)創(chuàng)面愈合客觀有效的指標(biāo)，對(duì)生物組織切片進(jìn)行HE染色后可通過(guò)顯微鏡觀察上皮再生和分布情況，也可對(duì)表皮結(jié)構(gòu)、表皮-真皮鄰接處和微水皰、膠原束和皮膚結(jié)構(gòu)、表皮再生和粒細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量進(jìn)行半定量打分。

3 相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)

皮膚替代物多與創(chuàng)傷組織、血液循環(huán)接觸，按照《醫(yī)療器械分類規(guī)則》多屬于II類或III類醫(yī)療器械。醫(yī)療器械行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 1570—2017 《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品皮膚替代品（物）的術(shù)語(yǔ)和分類》中也給出了皮膚替代物的術(shù)語(yǔ)、分類和命名。

在進(jìn)行皮膚替代物有效性評(píng)價(jià)之前，要保證其安全性。皮膚替代物需無(wú)有刺激性和致敏性，無(wú)免疫原性，對(duì)預(yù)期用于慢性潰瘍的皮膚替代物來(lái)說(shuō)還需保證其無(wú)致癌性；預(yù)期用于生育婦女的需要進(jìn)行生殖發(fā)育毒性；對(duì)所有非生物降解的材料也需進(jìn)行遺傳毒性研究。具體需進(jìn)行的安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)方法可參照醫(yī)療器械國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16886系列。

針對(duì)皮膚替代物的有效性評(píng)價(jià)， FDA的指導(dǎo)原則Guidence for Industry Chronic Cutaneous Ulcer and Burn Wounds-deνeloping Products for Treatment和醫(yī)療器械行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 1477.1—2016《接觸性創(chuàng)面敷料性能評(píng)價(jià)用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)?zāi)Ｐ?第1部分：評(píng)價(jià)抗菌活性的體外創(chuàng)面模型》，YY/T 1477.2—2016《接觸性創(chuàng)面敷料性能評(píng)價(jià)用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)?zāi)Ｐ?第2部分：評(píng)價(jià)促創(chuàng)面愈合性能的動(dòng)物燙傷模型》，YY/T 1477.3—2016《接觸性創(chuàng)面敷料性能評(píng)價(jià)用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)?zāi)Ｐ?第3部分：評(píng)價(jià)液體控制性能的體外創(chuàng)面模型》，YY/T 1477.4—2017《接觸性創(chuàng)面敷料性能評(píng)價(jià)用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)?zāi)Ｐ?第4部分：評(píng)價(jià)創(chuàng)面敷料潛在粘連性的體外模型》等也為我們合理進(jìn)行皮膚替代物的有效性評(píng)價(jià)提供了依據(jù)。