李亞平　郎凱楠　賈東珂　劉玉玲

【摘要】 目的：探討人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）E6/E7mRNA檢測用于宮頸錐切術(shù)后隨訪的應(yīng)用價值。方法：對因高級別宮頸上皮內(nèi)瘤變行宮頸錐切術(shù)、隨訪資料完整的216例患者進(jìn)行隨訪，所有患者均于術(shù)后3、9、12、18個月進(jìn)行HPV-DNA、E6/E7mRNA檢測及液基細(xì)胞學(xué)檢查，若細(xì)胞學(xué)≥ASCUS或HPV-DNA陽性或E6/E7mRNA陽性者均應(yīng)行陰道鏡檢查并行宮頸活檢術(shù)，若活檢病理提示宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）則定義為復(fù)發(fā)，并終止繼續(xù)隨訪。結(jié)果：隨訪18個月，累計(jì)復(fù)發(fā)23例，復(fù)發(fā)率為10.6%（23/216）。HPV E6/E7mRNA和HPV-DNA診斷宮頸錐切術(shù)后病變復(fù)發(fā)的ROC曲線下面積分別為0.899[95%CI（0.810，0.987）]、0.872[95%CI（0.801，0.943）]。HPV-DNA與HPV E6/E7mRNA兩種檢測方法預(yù)測錐切術(shù)后病變復(fù)發(fā)的敏感度及陰性預(yù)測值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但HPV E6/E7mRNA檢測預(yù)測錐切術(shù)后病變復(fù)發(fā)的特異度及陽性預(yù)測值均高于HPV-DNA檢測，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：HPV E6/E7mRNA檢測在宮頸錐切術(shù)后隨訪中具有一定的應(yīng)用價值，可降低HPV一過性感染檢出率，提高高級別上內(nèi)病變的檢出率，可有效指導(dǎo)進(jìn)一步陰道鏡檢查，避免過渡轉(zhuǎn)診陰道鏡。

【關(guān)鍵詞】 HPV-DNA; E6/E7mRNA; 宮頸錐切術(shù); 隨訪

【Abstract】 Objective：To explore the application value of HPV E6/E7mRNA detection for follow-up after cervical conization.Method：216 patients who have undergone cervical conization due to high-grade cervical intraepithelial neoplasia and have complete follow-up data were followed up.All patients were tested for HPV-DNA and E6/E7mRNA and liquid-based cytology at 3，9，12，and 18 months after surgery.If the cytology was≥ASCUS or HPV-DNA was positive，thus colposcope and cervical biopsy should be operated.If biopsy pathology indicates CIN was defined as recurrence，and stopped continuing follow-up.Result：After 18 months of follow-up，23 patients had a cumulative recurrence，with a recurrence rate of 10.6%（23/216）.The area under the ROC curve of HPV E6/E7mRNA and HPV-DNA in diagnosing the recurrence of cervical conus resection was 0.899[95%CI（0.810，0.987）]，0.872[95%CI（0.801，0.943）]respectively.The sensitivity and negative predictive value of HPV-DNA and HPV E6/E7mRNA to predict the recurrence of lesions after conical resection were compared，the difference was not statistically significant（P>0.05）.However，the specificity and positive predictive value of HPV E6/E7mRNA detection in predicting the recurrence of lesions after cone resection were higher than that of HPV-DNA detection，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：HPV E6/E7mRNA detection has certain application value in the follow-up after cervical conical resection，which can reduce the detection rate of HPV transient infection，improve the detection rate of high-grade internal lesions，and effectively guide further colposcopy to avoid the transition to colposcopy.

【Key words】 HPV-DNA; E6/E7mRNA; Cervical conization; Follow up

First-authors address：The Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.02.032

宮頸環(huán)形電切術(shù)（loop electrosurgical excision procedure，LEEP）和冷刀錐切術(shù)（cold knife conization，CKC）是臨床上治療宮頸高級別上皮內(nèi)瘤變的常用治療手段，其可在保留子宮的同時切除病變的宮頸組織，但術(shù)后仍存在病變復(fù)發(fā)的可能[1]。因此如何在術(shù)后的長期隨訪中及時發(fā)現(xiàn)病變復(fù)發(fā)并尋找一種可靠、準(zhǔn)確的隨訪方案是臨床醫(yī)生面臨的重要難題。近年來，HPV E6/E7mRNA檢測作為新型的檢測方法，在預(yù)測宮頸病變復(fù)發(fā)或進(jìn)展有較大價值[2]。本研究通過與HPV-DNA檢測進(jìn)行比較，探討HPV E6/E7mRNA檢測在宮頸錐切術(shù)后隨訪的應(yīng)用價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以2015年6月-2016年9月在鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科因?qū)m頸高級別上皮內(nèi)瘤變行宮頸錐切術(shù)、隨訪資料完整的患者216例為研究對象進(jìn)行臨床資料回顧性分析?；颊吣挲g24～65歲，中位年齡42歲，隨訪時間9～18個月，復(fù)發(fā)例數(shù)23例，復(fù)發(fā)率為10.6%。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前、術(shù)后均經(jīng)本院病理科證實(shí)為CIN2或CIN3，術(shù)后無病理升級為浸潤癌;（2）術(shù)后病理提示切緣均為陰性;（3）臨床資料完整;（4）既往無宮頸手術(shù)史;（5）宮頸錐切術(shù)在本院進(jìn)行;（6）簽署知情同意書，同意自愿參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）妊娠女性;（2）合并其他部位惡性腫瘤患者;（3）陰道局部使用抗病毒藥物;（4）子宮切除術(shù)后;（5）陰道及宮頸急性炎癥;（6）24 h內(nèi)有陰道灌洗上藥。

1.2 手術(shù)方法 LEEP術(shù)在門診局麻下進(jìn)行，冷刀錐切術(shù)在手術(shù)室全麻下進(jìn)行，術(shù)前常規(guī)行白帶常規(guī)檢查排除陰道急性炎癥，完善心電圖、血常規(guī)、凝血功能、傳染病等相關(guān)檢查，告知患者手術(shù)可能出現(xiàn)的風(fēng)險及并發(fā)癥并簽署手術(shù)知情同意書。

1.3 隨訪 所有患者均于術(shù)后3、9、12、18個月進(jìn)行HPV-DNA、E6/E7mRNA檢測及液基細(xì)胞學(xué)檢查，若細(xì)胞學(xué)≥ASCUS或HPV-DNA陽性或E6/E7mRNA陽性者均應(yīng)行陰道鏡檢查并行宮頸活檢術(shù)，若活檢病理提示宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）則定義為復(fù)發(fā)，并終止繼續(xù)隨訪。

1.3.1 細(xì)胞學(xué)檢查 取材前24 h內(nèi)無陰道沖洗、放藥及性生活，采用新柏氏薄層液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)（thinprepcytotogic tes，TCT）對宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行檢測。采用TBS（the bethesda system）報告系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果判讀。（1）未見上皮內(nèi)病變細(xì)胞或惡性細(xì)胞（NILM）：包括正常范圍和良性反應(yīng)性細(xì)胞改變（輕、中、重度炎癥反應(yīng)）。（2）鱗狀上皮內(nèi)病變包括：①未明確診斷意義的不典型鱗狀細(xì)胞（atypical squamous cell of undetermined signification，ASCUS）和不除外高級別上皮內(nèi)病變的不典型鱗狀細(xì)胞（atypical squamous cell cannot exclude HSIL，ASC-H）;②低級別鱗狀上皮內(nèi)病變（low grade squamous intraepithelial lesions，LSIL）;③高級別鱗狀上皮內(nèi)病變（high grade squamous intraepithelial lesions，HSIL）;④鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）。（3）腺細(xì)胞病變包括：①不典型腺細(xì)胞（atypical glandularcell，AGC）;②傾向于瘤變的不典型腺細(xì)胞;③宮頸管原位腺癌;④腺癌。

1.3.2 HPV-DNA檢測 采用凱杰生物公司提供的宮頸取樣器進(jìn)行宮頸管取樣，將取樣器置于宮頸口順時針旋轉(zhuǎn)5圈，應(yīng)用第二代捕獲雜交技術(shù)（HC-Ⅱ），可檢測出13種高危型HPV病毒（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型），其正常負(fù)荷量范圍為0～1 pg/mL，若超過1 pg/mL則為陽性。

1.3.3 HPV E6/E7mRNA檢測 采用由豪洛斯公司提供的AptimaTM HPV檢測試劑及取樣器進(jìn)行宮頸取樣，將取樣器置于宮頸后順時針旋轉(zhuǎn)5圈?？蓹z測出高危型HPV E6/E7mRNA的表達(dá)，拷貝數(shù)≥1 copies/mL為陽性。

1.3.4 陰道鏡及活組織病理檢查 細(xì)胞學(xué)≥ASCUS或者高危型HPV陽性或者HPV E6/E7mRNA陽性者需轉(zhuǎn)診陰道鏡。陰道鏡檢查前需24 h內(nèi)無陰道藥物放置及陰道沖洗且需排除陰道炎癥，由本院專門陰道鏡醫(yī)生使用電子陰道鏡，通過醋酸試驗(yàn)及碘試驗(yàn)進(jìn)行宮頸多點(diǎn)活檢，若陰道鏡檢查不滿意，則同時行宮頸管搔刮術(shù)，病理報告方式為：慢性宮頸炎、鱗狀上皮內(nèi)低級別病變（CIN1）、鱗狀上皮內(nèi)高級別病變（CIN2）、鱗狀上皮內(nèi)高級別病變（CIN3）、宮頸鱗狀細(xì)胞癌。若病理提示CIN則定義為復(fù)發(fā)，并終止隨訪。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，單因素分析采用字2檢驗(yàn)，診斷價值采用受試者工作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行宮頸錐切術(shù)患者的基本情況 年齡≥45歲和年齡<45歲患者的病變復(fù)發(fā)率分別為11.4%（14/123）和9.7%（9/93），兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;患者病變級別CIN2和CIN3的復(fù)發(fā)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;術(shù)后病理累及腺體和未累及腺的復(fù)發(fā)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;手術(shù)方式LEEP和CKC的復(fù)發(fā)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.2 錐切術(shù)后隨訪及病變復(fù)發(fā)情況 術(shù)后隨訪18個月，HPV-DNA檢測陽性者累計(jì)80例，復(fù)發(fā)者中陽性20例;HPV E6/E7mRNA陽性者累計(jì)46例，其中復(fù)發(fā)者中陽性19例。其中術(shù)后3個月隨訪時未發(fā)現(xiàn)病變復(fù)發(fā)者，術(shù)后9個月隨訪復(fù)發(fā)者5例，術(shù)后12個月復(fù)發(fā)10例，術(shù)后18個月復(fù)發(fā)8例，共隨訪18個月累及復(fù)發(fā)23例，其中CIN1者7例，CIN2者8例，CIN3者8例，復(fù)發(fā)率為10.6%（23/216）。術(shù)后3、9、12、18個月HPV陽性率分別為25.9%（56/216）、19.9%（43/216）、15.2%（32/211）、12.9%（26/201）。見表2。

2.3 HPV-DNA檢測與HPV E6/E7mRNA檢測的診斷價值 術(shù)后隨訪18個月，病變復(fù)發(fā)者23例，其中CIN1者7例，CIN2者8例，CIN3者8例。由圖1可見，HPV E6/E7mRNA和HPV-DNA診斷宮頸錐切術(shù)后病變復(fù)發(fā)的ROC曲線下面積分別為0.899[95%CI（0.810，0.987）]、0.872[95%CI（0.801，0.943）]。HPV-DNA診斷的臨界值為46.685，以HPV-DNA拷貝量≥46.685為預(yù)測界值，其預(yù)測錐切術(shù)后病變復(fù)發(fā)的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為88.40%、51.35%、24.00%、96.45%。HPV E6/E7mRNA診斷的臨界值為6.670，以HPV E6/E7mRNA負(fù)荷量≥6.670為預(yù)測界值，其預(yù)測錐切術(shù)后病變復(fù)發(fā)的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為92.01%、74.19%、51.22%、98.86%。兩種檢測方法預(yù)測錐切術(shù)后病變復(fù)發(fā)的敏感度及陰性預(yù)測值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但HPV E6/E7mRNA檢測預(yù)測錐切術(shù)后病變復(fù)發(fā)的特異度及陽性預(yù)測值均高于HPV-DNA檢測，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

3.1 錐切術(shù)后病變復(fù)發(fā)的相關(guān)高危因素 近年來，宮頸癌發(fā)病率逐年增高，且年輕化越來越明顯[3]。LEEP和冷刀錐切是宮頸錐切最常用的術(shù)式，LEEP手術(shù)對患者創(chuàng)傷較小，出血較少，對妊娠結(jié)局影響較小，但可影響病理醫(yī)生對切緣狀態(tài)的評估;而冷刀錐切術(shù)不僅切除病變較徹底，還可充分評估切緣狀態(tài)。雖然宮頸錐切術(shù)對高級別上皮內(nèi)病變有較好的療效，但術(shù)后病變復(fù)發(fā)仍然是急需關(guān)注的問題[4]。本研究隨訪共18個月，術(shù)后3、9、12、18個月HPV陽性率分別為25.9%（56/216）、19.9%（43/216）、15.2%（32/211）、12.9%（26/201）。有研究表明，錐切術(shù)后仍有5%～30%的復(fù)發(fā)率[5]。本研究隨訪18個月累計(jì)復(fù)發(fā)23例，復(fù)發(fā)率為10.6%（23/216），與Leguevaque等[6]研究相似。據(jù)文獻(xiàn)[7]報道，宮頸錐切術(shù)后病變復(fù)發(fā)的相關(guān)危險因素有年齡、病變級別、切緣陽性、病毒負(fù)荷量等。Lu等[8]的研究表明年齡>50歲患者病變復(fù)發(fā)的風(fēng)險高于年齡≤50歲者，年齡增大是病變復(fù)發(fā)的危險因素之一，可能與高齡患者絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素水平明顯降低，生殖系統(tǒng)保護(hù)能力變?nèi)?，容易受到HPV的再感染，且高齡患者免疫低下，HR-HPV清除率較低。但Zappacosta等[9]卻認(rèn)為較年輕患者錐切術(shù)后病變復(fù)發(fā)率高于年長患者，可能與性生活活躍、性生活時沒有正確使用安全套導(dǎo)致HR-HPV再感染有關(guān)。本研究中，年齡≥45歲和年齡<45歲的病變復(fù)發(fā)率分別為11.4%（14/123）和9.7%（9/93），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.688），與趙花等[10]研究結(jié)果相符合。有研究表明，LEEP術(shù)后復(fù)發(fā)率高于CKC[11]，可能是因?yàn)長EEP手術(shù)時所產(chǎn)生的高溫會灼傷標(biāo)本切緣，導(dǎo)致病理醫(yī)生對切緣狀態(tài)的無法評估，且LEEP手術(shù)對可疑頸管病變手術(shù)深度不夠。而本研究中LEEP手術(shù)復(fù)發(fā)率為12.6%（11/87）高于CKC的9.3%（12/129），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.435）。本研究中CIN2者復(fù)發(fā)率為11.9%（7/59），CIN3者復(fù)發(fā)率為10.2%（16/157），兩者復(fù)發(fā)率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.722），結(jié)果與劉哲穎等[12]研究相似。曾燕等[13]的研究表明，腺體的累及是錐切術(shù)后病變復(fù)發(fā)的危險因素之一，當(dāng)病變累及腺體時，病變復(fù)的可能性增加。而本研究結(jié)果顯示，術(shù)后累及腺體者復(fù)發(fā)率為11.6%（16/138），未累及腺體者復(fù)發(fā)率為9.0%（7/78），兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.549），腺體累及與否與病變復(fù)發(fā)無明顯相關(guān)性。Kyehyun等[14]同時采用第二代雜交捕獲（HC-Ⅱ）和HPV分型檢測隨訪錐切術(shù)后患者，發(fā)現(xiàn)同一亞型HPV持續(xù)感染尤其是HPV16亞型感染是錐切術(shù)后病變復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險因素。

3.2 HPV E6/E7mRNA在錐切術(shù)隨訪中的應(yīng)用價值 細(xì)胞學(xué)檢查是宮頸篩查及術(shù)后隨訪的基本方法，但其敏感度較低，且受診斷者主觀影響較大。文獻(xiàn)[15]研究表明，HPV分型檢測預(yù)測病變復(fù)發(fā)的準(zhǔn)確性為71.5%，TCT檢測準(zhǔn)確性僅為56.4%。因此HPV-DNA檢測聯(lián)合薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查是目前常用的宮頸錐切術(shù)后隨訪方法，聯(lián)合篩查在一定程度上提高了篩查的敏感性和特異性。但HPV-DNA檢測特異度相對較低，易造成假陽性，不僅導(dǎo)致過度陰道鏡轉(zhuǎn)診，而且增加患者的心理負(fù)擔(dān)。文獻(xiàn)[16]研究表明，HPV E6/E7mRNA檢測的敏感性高于液基細(xì)胞學(xué)檢查，且HPV E6/E7mRNA檢測聯(lián)合液基細(xì)胞學(xué)檢查可明顯提高宮頸篩查的敏感性。宮頸錐切術(shù)后隨訪的目的是發(fā)現(xiàn)病變而不是病毒感染。HPV E6/E7mRNA檢測不僅可以反映HPV感染狀態(tài)，而且能夠預(yù)測病變發(fā)生的風(fēng)險。文獻(xiàn)[17]研究表明，在診斷高級別上皮內(nèi)病變方面，Aptima HPV E6/E7檢測與HPV-DNA檢測相比具有同樣的敏感性，但其特異性較高。文獻(xiàn)[18]研究表明，HPV E6/E7mRNA檢測效果優(yōu)于HPV-DNA檢測。本研究HPV E6/E7mRNA和HPV-DNA診斷宮頸錐切術(shù)后病變復(fù)發(fā)的ROC曲線下面積分別為0.899[95%CI（0.810，0.987）]、0.872[95%CI（0.801，0.943）]。兩種檢測方法預(yù)測錐切術(shù)后病變復(fù)發(fā)的敏感度及陰性預(yù)測值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但HPV E6/E7mRNA檢測預(yù)測錐切術(shù)后病變復(fù)發(fā)的特異度及陽性預(yù)測值均高于HPV-DNA檢測，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。E6、E7基因是導(dǎo)致宮頸癌的兩個致癌基因，當(dāng)HPV病毒發(fā)生持續(xù)感染后，HPV E6、E7基因通過轉(zhuǎn)錄E6、E7mRNA編碼E6、E7癌蛋白，E6蛋白可降解p53抑癌蛋白、激活端粒酶，使細(xì)胞無限增殖并向惡性轉(zhuǎn)化;E7蛋白可結(jié)合并降解pRb，可最終造成惡性腫瘤的發(fā)生[19]。HPV E6/E7mRNA檢測是一種新型的HPV檢測方法，可以檢測到高危型別HPV的E6、E7mRNA的表達(dá)，可以區(qū)分HPV一過性感染和持續(xù)性感染，能顯著減少對不必要的一過性HPV感染的檢出[20]。術(shù)后隨訪18個月，HPV-DNA檢測陽性者累計(jì)80例，復(fù)發(fā)者中陽性20例;HPV E6/E7mRNA陽性者累計(jì)46例，其中復(fù)發(fā)者中陽性19例。HPV-DNA檢測的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為88.40%、51.35%、24.00%、96.45%。HPV E6/E7mRNA檢測的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為92.01%、74.19%、51.22%、98.86%，HPV E6/E7mRNA檢測的特異度及陽性預(yù)測值均高于HPV-DNA檢測。

綜上所述，宮頸錐切術(shù)后仍需要長期管理并隨訪，HPV E6/E7mRNA檢測的特異度及陽性預(yù)測值均高于HPV-DNA檢測，且HPV E6/E7mRNA在不降低病變總體檢出率的情況下可提高高級別上皮內(nèi)病變的檢出率，降低HPV一過性感染的檢出率，在宮頸錐切術(shù)后的隨訪中具有一定的臨床應(yīng)用價值，可以避免過度轉(zhuǎn)診陰道鏡及過度治療。但由于本研究樣本量小，還需要大樣本的研究及Meta分析來進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)論。

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（收稿日期：2018-10-24） （本文編輯：張爽）