周 穎 惠延波 馮蘭芳 閆 磊 馬曉曉

(河南工業(yè)大學(xué)，鄭州 450001 )

小麥在儲(chǔ)藏期間，外界的高溫高濕空氣或糧堆濕熱擴(kuò)散量超過(guò)籽粒水分平衡速度時(shí)，特別容易被霉菌和真菌降解，被霉菌真菌病原體感染的核會(huì)導(dǎo)致干物質(zhì)含量和核密度的降低，在糧倉(cāng)中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)結(jié)頂、掛壁、點(diǎn)翠等現(xiàn)象。霉菌是糧食儲(chǔ)藏期危害嚴(yán)重的微生物類群，霉菌的次級(jí)代謝物會(huì)引起糧食品質(zhì)的劣變和真菌毒素的產(chǎn)生。據(jù)統(tǒng)計(jì)，糧食生產(chǎn)因霉菌活動(dòng)導(dǎo)致的損失率約占糧食總產(chǎn)量的3%以上，霉菌在造成經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)也給食品安全帶來(lái)了嚴(yán)重的不確定性[1,2]。掌握糧食中霉菌生長(zhǎng)代謝規(guī)律，及早的發(fā)現(xiàn)霉菌，對(duì)確保儲(chǔ)糧安全意義重大。

小麥籽粒最外層有一層堅(jiān)硬的組織叫種皮，它包圍著胚乳和胚芽， 因此在不破壞內(nèi)核、無(wú)損的情況下來(lái)研究霉菌污染對(duì)內(nèi)部籽粒結(jié)構(gòu)的影響是非常困難的。常規(guī)的“平皿菌落計(jì)數(shù)法”、基于細(xì)胞中酶活性變化的“微生物活性檢測(cè)方法”主要局限于檢測(cè)糧粒外部霉菌量的變化[3-5]，基于微生物生長(zhǎng)代謝活動(dòng)導(dǎo)致溫度和呼吸強(qiáng)度變化的“電子測(cè)溫”和“二氧化碳檢測(cè)”的方法是間接的，通常是在糧倉(cāng)或大型糧堆中檢測(cè)，但其監(jiān)測(cè)霉菌生長(zhǎng)活動(dòng)的起點(diǎn)較實(shí)際滯后[6-9]。微生物的生理活動(dòng)不僅會(huì)消耗糧食中的成分，而且會(huì)破壞糧食的組織、結(jié)構(gòu)，目前對(duì)小麥籽粒本身感染霉菌后內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化研究較少。傳統(tǒng)的圖像分析技術(shù)如光學(xué)顯微鏡(LM)、掃描電子顯微鏡(SEM)、激光掃描共聚焦顯微鏡(CSLM)、聚離子束掃描電子顯微鏡(FIB-SEM)、原子粒顯微鏡(AFM)等。這些圖像分析技術(shù)在樣件制備的過(guò)程中需要對(duì)樣件進(jìn)行切片和化學(xué)處理, 耗時(shí)、危害健康、污染環(huán)境，對(duì)制備的切片進(jìn)行分析時(shí)僅能夠得到樣件內(nèi)部的結(jié)構(gòu)信息,不能給出整個(gè)籽粒內(nèi)部三維內(nèi)核的各向異性信息,而且樣件可能經(jīng)過(guò)切片和化學(xué)處理后會(huì)破壞原始結(jié)構(gòu)并引入成像偽影。

X射線顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)是一種非破壞性的三維成像和分析技術(shù)，用于無(wú)損分析各種材料的內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征或用于材料內(nèi)部缺陷的檢測(cè)，最近作為食品科學(xué)領(lǐng)域一種較為新穎的方法，已被成功地應(yīng)用于獲取不同理化條件下食品的微觀結(jié)構(gòu)信息[10-13]。Gubatz等[14]利用連續(xù)切片重建發(fā)育的大麥籽粒的數(shù)字模型，該模型提供了在開(kāi)花期，胚乳發(fā)育合胞期和淀粉積累開(kāi)始時(shí)發(fā)育谷物的詳細(xì)空間描述。Schulze等[15-17]利用X射線分析了真空浸漬槲皮素衍生物對(duì)蘋果薄壁組織強(qiáng)化的影響及蘋果果核內(nèi)孔隙結(jié)構(gòu)及分布。Zhu等[18]通過(guò)X射線顯微CT研究高直鏈淀粉和野生型水稻的籽粒結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了內(nèi)核結(jié)構(gòu)的三維表征。Orina等[19]利用X射線顯微CT無(wú)損的分析感染輪狀鐮刀菌的玉米籽粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。X射線提供了獲取完整三維結(jié)構(gòu)圖像手段，以非破壞性方式在微觀層面上展示可視化內(nèi)部結(jié)構(gòu)，對(duì)圖像進(jìn)行分析處理還可以實(shí)現(xiàn)內(nèi)部結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的量化。因此，該技術(shù)不僅用于內(nèi)部特征的定性描述，而且還可用于定量分析。

X射線三維顯微鏡是采用傳統(tǒng)CT技術(shù)與光學(xué)顯微技術(shù)結(jié)合，X射線斷層掃描是一種無(wú)創(chuàng)傷和無(wú)損成像技術(shù)，可用于高分辨率的三維可視化和表征。X射線源發(fā)射出來(lái)的射線束，在穿過(guò)待測(cè)樣本時(shí)與待測(cè)樣本發(fā)生作用，由于樣本內(nèi)的密度和成分差異，待測(cè)對(duì)象的不同部位對(duì)X射線的吸收率不同造成X射線的衰減，樣本內(nèi)的X射線衰減的變化產(chǎn)生不同的圖像對(duì)比度。用X射線三維顯微測(cè)試系統(tǒng)，將樣本旋轉(zhuǎn)得到一系列不同灰度的二維X切片，這一系列切片，覆蓋整個(gè)樣本，可以被渲染成一個(gè)三維的圖像，可以在不同的深度和不同方向作為一個(gè)整體或虛擬切片如圖3所示。本研究的目的是確定X射線顯微CT是否是研究小麥籽粒霉變后內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)變化的有效手段，通過(guò)對(duì)二維截面圖分析霉變后籽粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化與不同，通過(guò)對(duì)圖像進(jìn)行重建和渲染，實(shí)現(xiàn)對(duì)感染籽粒及內(nèi)部孔隙的三維可視化，除了可視化還可以獲取籽粒體積、籽粒內(nèi)部孔隙率等參數(shù)。為進(jìn)一步探討糧食內(nèi)部的孔隙與糧情之間的關(guān)系提供參考。

1 材料與方法

圖1詳細(xì)介紹了用X射線斷層掃描方法無(wú)損研究霉變對(duì)小麥籽粒三維結(jié)構(gòu)的影響的實(shí)驗(yàn)流程圖。

圖1 用X射線顯微CT分析發(fā)霉對(duì)籽粒微觀結(jié)構(gòu)影響的流程圖

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料選用小麥品種為周麥26，由河南工業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)田提供，隨機(jī)取部分實(shí)驗(yàn)籽粒

〗利用ASAE S352標(biāo)準(zhǔn)把小麥籽粒在130 ℃條件下烘干19 h，通過(guò)測(cè)量烘干前后水分的損失測(cè)得的初始含水率為12%。小麥中按NYT1094.1—2006標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定潤(rùn)麥加水量公式(1)計(jì)算潤(rùn)麥加水量，加入一定量的無(wú)菌水，均勻混合，然后置于5 ℃以下的冷藏箱中存放48 h，調(diào)制后實(shí)驗(yàn)樣品的初始含水量26%。

(1)

1.2 發(fā)霉樣件

2種發(fā)霉的樣件如圖2所示，圖2a為常溫條件下發(fā)霉的樣件：將調(diào)制后含水量為26%的小麥裝入1 000 mL的廣口瓶中，用保濕劑(含氯化鈉8%，甘油10%)浸泡過(guò)的棉紗布將瓶口覆蓋8層，放在常溫下；圖2b為恒溫恒濕箱中模擬儲(chǔ)藏條件的發(fā)霉樣件：將調(diào)制后含水量為26%的小麥裝入1 000 mL廣口瓶中，用保濕劑(含氯化鈉8%，甘油10%)浸泡過(guò)的棉紗布將瓶口覆蓋8層，置于德國(guó)BINDER恒溫恒濕培養(yǎng)箱，調(diào)整培養(yǎng)箱的溫度為28 ℃，將濕度調(diào)節(jié)至接近小麥平衡水分的范圍，保持小麥水分在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期中基本穩(wěn)定。在本實(shí)驗(yàn)條件下小麥的含水量變化不超過(guò)0.5%。7 d后各取6粒樣件放置X射線微米CT執(zhí)行掃描。

圖2 小麥籽粒感染霉菌圖

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

用Y.CHEETAN型微米X射線斷層CT進(jìn)行掃描，設(shè)置工作參數(shù)：電壓70 kV，電流40 μA,測(cè)量分辨率為7.14 μm。 測(cè)試時(shí)首先將小麥籽粒用泡沫塊固定，注意在固定時(shí)盡量避開(kāi)小麥籽粒發(fā)霉的部位。再用雙面膠將固定好小麥籽粒的泡沫塊粘接在旋轉(zhuǎn)柱上，粘接牢固后放置旋轉(zhuǎn)臺(tái)，在旋轉(zhuǎn)臺(tái)上保持射線源和探測(cè)器不動(dòng)；旋轉(zhuǎn)臺(tái)旋轉(zhuǎn)1個(gè)小角度，探測(cè)器采集1組數(shù)據(jù)，直至旋轉(zhuǎn)臺(tái)轉(zhuǎn)360°，完成1次圓周的掃描，掃描時(shí)不需要人工協(xié)助機(jī)器完全自動(dòng)化操作，掃描大概需要20 min，掃描完成獲取1024張二維切片。

圖3 X射線的三維視圖及對(duì)應(yīng)的二維截面視圖

2 圖像處理與重構(gòu)

從Y.CHEETAH X射線CT中采集從不同角度對(duì)小麥籽粒的投影成像圖，需要對(duì)其進(jìn)行重建才能得到小麥籽粒的三維結(jié)構(gòu)。在Image J軟件中實(shí)現(xiàn)了對(duì)1 024張切片的重構(gòu)可視化與定量分析。應(yīng)用了非局部均值濾波算法對(duì)圖像采集過(guò)程中由于人為、設(shè)備等各方面的原因攜帶的各種噪聲信號(hào)進(jìn)行去除，在去除噪聲的同時(shí)，最大限度的保持圖像輪廓，紋理等細(xì)節(jié)特征。同時(shí)又使用了交互式閾值分割算法將樣品信息與背景信息，樣品內(nèi)部不同特征區(qū)域劃分出來(lái)。通過(guò)渲染對(duì)重建后的模型進(jìn)行三維可視化，渲染是觀察和可視化內(nèi)部形態(tài)和微觀結(jié)構(gòu)所必需的，通過(guò)渲染對(duì)不同組織結(jié)構(gòu)賦予不同的顏色，把不同的組織結(jié)構(gòu)從整體中剝離出來(lái)，得到籽粒的三維形態(tài)信息及樣品局部細(xì)節(jié)信息，可以直觀形象地觀察籽粒的三維形貌。

3 參數(shù)計(jì)算

通過(guò)X射線顯微CT再附加相關(guān)的重建算法，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)小麥籽粒內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)的重建表征，獲取如籽粒體積、孔隙體積、孔隙大小分布、孔隙率等參數(shù)。重構(gòu)切片上的每個(gè)像素代表了體積圖像中的一個(gè)立方體體素，經(jīng)過(guò)閾值分割后的三維數(shù)據(jù)每個(gè)組織結(jié)構(gòu)所占的體素?cái)?shù)量都是已知的，目標(biāo)體積可以通過(guò)公式(2)獲取。

V=S×N

(2)

式中：S為每個(gè)體素體積；N為體素的個(gè)數(shù)。

孔隙率是孔隙空間的體積與樣品總體積的比率,如公式(3)，以百分比表示。

(3)

式中：P為孔隙率；V1為空氣體積；V2為籽粒體積。

4 結(jié)果分析與討論

X射線顯微CT基于圖像對(duì)比度，該圖像對(duì)比度由樣本內(nèi)的X射線衰減的變化產(chǎn)生，X射線衰減的變化可歸因于樣本內(nèi)的密度和成分差異。使用閾值分割程序從背景中分割籽?？梢缘玫阶蚜５幕叶戎狈綀D如圖4所示，灰度值范圍從0到655 35之間，灰度值與圖像對(duì)比度有關(guān)，如果灰度值集中在圖像的下端，圖像的亮度比較暗，相反灰度值集中在上端圖像就會(huì)比較亮。整個(gè)核灰度直方圖的不同峰值對(duì)應(yīng)了不同的相位，低灰度值對(duì)應(yīng)于內(nèi)部的空氣，高灰度值對(duì)應(yīng)于核結(jié)構(gòu)。發(fā)霉后籽?；叶戎档念l率在0～10 000范圍內(nèi)有升高的趨勢(shì)，說(shuō)明空氣相增多，孔隙增加。

圖4 小麥籽粒的灰度直方圖

4.1 霉菌生長(zhǎng)部位分析

小麥籽粒的解剖結(jié)構(gòu)有種皮，胚乳，胚，盾片組成，它們具有不同的化學(xué)成分，這些解剖結(jié)構(gòu)在微生物生長(zhǎng)代謝的作用下組織會(huì)發(fā)生變化，X射線顯微CT能夠根據(jù)它們?cè)赬射線衰減方面的差異將這些結(jié)構(gòu)組件在內(nèi)核中區(qū)分開(kāi)來(lái)。

圖5展示了不同條件下小麥籽粒水平視圖和矢狀圖。從二維截面圖上可以看出小麥籽粒感染霉菌初期，霉菌生長(zhǎng)代謝首先出現(xiàn)在小麥籽粒的胚部，胚部豐富的營(yíng)養(yǎng)為霉菌的生長(zhǎng)代謝提供了適宜的基質(zhì)，霉菌初期在小麥籽粒上生長(zhǎng)呈現(xiàn)向外繁衍的趨勢(shì)。糧粒種皮的保護(hù)作用也是影響霉菌生長(zhǎng)活動(dòng)的重要因素[20]，胚部外圍的皮層組織較其他部位皮層組織薄，對(duì)胚組織的保護(hù)弱，且皮層與胚之間存在著較大的孔隙，微生物生長(zhǎng)所需環(huán)境條件主要有碳源物質(zhì)、氧氣、水和無(wú)機(jī)鹽，皮層與胚之間的空隙為微生物的有氧呼吸提供了良好的空間。圖5a為未感染霉菌的小麥籽粒的二維截面(水平、矢狀)圖，小麥皮層輪廓線清晰，胚組織緊密，吸收X射線的能力較強(qiáng)，圖像灰度值高更亮。圖5b為常溫下發(fā)霉小麥籽粒的二維截面(水平、矢狀)圖，霉菌感染初期菌絲及孢子數(shù)量少，對(duì)X射線的吸收較少，圖像灰度值低，亮度低。圖5c模擬儲(chǔ)藏環(huán)境下感染霉菌小麥籽粒的二維截面(水平、矢狀)圖，皮層的輪廓線較模糊，且胚部的圖像的灰度值也較其他未感染籽粒低，主要儲(chǔ)糧微生物含有多種酶類，它們可以通過(guò)呼吸作用，分解糧粒中蛋白質(zhì)、淀粉、碳水化合物、糖類、纖維素、有機(jī)酸等有機(jī)物質(zhì)，為其生長(zhǎng)﹑繁殖﹑代謝所利用，導(dǎo)致內(nèi)核的降解，胚組織密度降低[21]，吸收X射線的能力減弱，圖像灰度值低，亮度變低。

圖5 不同條件下感染霉菌的小麥籽粒的二維橫截面圖

4.2 發(fā)霉部位的三維可視化圖

分割渲染重構(gòu)后的小麥籽粒如圖6所示。圖6a為未霉變的籽粒，圖6b為常溫下發(fā)霉的籽粒，圖6c為培養(yǎng)箱中模擬儲(chǔ)藏條件感染霉菌的籽粒。圖中紅色部分為小麥籽粒的胚部，藍(lán)色為胚乳部分，黃色為種皮部分，暗綠色為霉菌生長(zhǎng)部位。從重構(gòu)視圖發(fā)現(xiàn)種皮與胚乳及胚部并不是緊密的貼合在一起，中間存在孔隙，種皮呈褶皺狀覆蓋在胚乳及胚組織的表面，小麥籽粒的背部的種皮褶皺多。小麥籽粒在常規(guī)自然條件下霉菌的生長(zhǎng)代謝主要在胚部，在培養(yǎng)箱中霉菌的生長(zhǎng)代謝主要集中在胚部，腹溝靠近果毛處也存在部分霉菌。

注：紅色為胚，藍(lán)色為胚乳，淡黃色為種皮，暗綠色為霉菌。圖6 重構(gòu)完成后小麥籽粒的三維視圖

4.3 定量參數(shù)計(jì)算

籽粒內(nèi)部的孔隙中游離的氧原子是碳水化合物、脂類和蛋白質(zhì)等有機(jī)化合物主要組成成分，它在微生物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和酶的功能方面起著重要的作用，對(duì)絕大多數(shù)微生物的生長(zhǎng)代謝而言絕對(duì)是必要的。由于霉變導(dǎo)致小麥籽粒體積、內(nèi)部孔隙度的變化和額外孔隙度的發(fā)展是有可能的，對(duì)霉變后小麥籽?？紫兜谋碚髋c研究對(duì)于探究霉菌與孔隙之間的關(guān)系及霉菌內(nèi)部生長(zhǎng)代謝機(jī)理意義重大。體積的測(cè)定常采用液體置換法，孔隙的測(cè)定需要先測(cè)定容重、體積等參數(shù)在通過(guò)公式間接進(jìn)行計(jì)算這些方法不能實(shí)現(xiàn)單個(gè)籽粒體積的計(jì)算，更不能實(shí)現(xiàn)籽粒內(nèi)部孔隙的三維可視化。X射線斷層掃描方法不僅可以獲取一定量籽粒的體積、孔隙率，而且可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)籽粒體積，內(nèi)部孔隙的表征和定量計(jì)算。利用X射線首次實(shí)現(xiàn)了不同條件下小麥籽粒霉變后內(nèi)部孔隙的三維可視化如圖7。

圖7 小麥籽粒的孔隙圖不同顏色代表不同孔隙大小(培養(yǎng)箱發(fā)霉后)

獲取了籽粒體積、孔隙體積及孔隙占籽?？傮w積的比例等參數(shù)如表1。從這些視圖中可以看出孔隙的大小、位置、分布等，孔隙多數(shù)集中在小麥籽粒腹溝內(nèi)側(cè)的種皮附近。培養(yǎng)箱里發(fā)霉籽粒的孔隙率要大于自然條件發(fā)霉的籽粒，這些參數(shù)將對(duì)研究孔隙與霉菌之間的關(guān)系提供良好的前提。

表1 小麥顆粒的幾何參數(shù)

5 結(jié)論

研究表明高分辨率X射線顯微CT是研究小麥籽粒感染霉菌后內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化的一種有效的手段，通過(guò)對(duì)比不同狀態(tài)下小麥籽粒的灰度值可以區(qū)分籽粒是否感染霉菌，通過(guò)X射線的二維截面視圖發(fā)現(xiàn)盾片和種皮是小麥籽粒內(nèi)部的致密區(qū)域，灰度值大、亮度高。胚組織外圍的種皮較其它部位薄，對(duì)胚的保護(hù)力度較弱，小麥籽粒在感染霉菌后最先侵入的部位是胚部。小麥籽粒在模擬儲(chǔ)藏條件下感染霉菌后，胚部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被霉菌的生長(zhǎng)代謝消耗導(dǎo)致核內(nèi)干物質(zhì)的分解，核密度的降低，吸收X射線的能力低，灰度值變低。根據(jù)X射線衰減方面的差異實(shí)現(xiàn)小麥籽粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)及孔隙的三維可視化表征，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算了小麥籽粒的體積、孔隙體積、孔隙率等參數(shù)。這些可以用于糧食籽粒儲(chǔ)藏期間易發(fā)霉部位如(糧倉(cāng)墻壁附近、糧粒表層)以及糧食在深加工前是否霉變的區(qū)分檢測(cè)，也可以用于無(wú)損檢測(cè)單顆小麥籽粒被生物材料損傷后微觀結(jié)構(gòu)組織的變化。通過(guò)對(duì)籽粒霉變形態(tài)結(jié)構(gòu)做的基礎(chǔ)性研究和參數(shù)的大量統(tǒng)計(jì)分析，有可能為后續(xù)無(wú)損檢測(cè)儀器和快速檢測(cè)儀器的開(kāi)發(fā)提供參考。