婁亭亭 李慧 劉漪 張旭陽(yáng) 黃輝

根管治療術(shù)是目前治愈牙髓病和根尖周疾病的主要方法，但其成功率無法達(dá)到100%。在根管充填完善但仍有持續(xù)根尖損害的根管中糞腸球菌的檢出率為24%～77%，糞腸球菌是導(dǎo)致根管治療失敗的主要致病菌之一[1-2]。因此，控制根管內(nèi)細(xì)菌數(shù)量，是根管治療成功與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。在機(jī)械預(yù)備根管的同時(shí)，輔以具有高效抗菌作用的沖洗液沖洗根管，可降低根管內(nèi)細(xì)菌數(shù)量。次氯酸鈉是目前臨床上使用最廣泛的根管沖洗液，常用濃度為0.5%～5.25%。但是對(duì)生活組織有較強(qiáng)的毒性作用，且氣味難聞[3]，很大程度上限制了高濃度次氯酸鈉的使用，也降低了臨床療效。Octenisept是一款高效廣譜殺菌藥物，殺菌力強(qiáng)且細(xì)胞毒性低，常被用于皮膚、黏膜和開放性傷口的消毒，近年來國(guó)外將其應(yīng)用于根管沖洗[4-7]。本實(shí)驗(yàn)研究通過檢測(cè)不同濃度Octenisept對(duì)糞腸球菌的抗菌效果，并與不同濃度次氯酸鈉對(duì)糞腸球菌的抗菌效果對(duì)比，探討Octenisept溶液作為根管沖洗液的可行性及其抗菌性能等相關(guān)問題，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

標(biāo)準(zhǔn)糞腸球菌凍干菌株(ATCC 29212)(江西省微生物研究所)；腦心浸出液(brain-heart infusion，BHI)肉湯培養(yǎng)基、電子比濁儀(生物梅里埃公司,法國(guó))；CO2恒溫培養(yǎng)箱(Forma公司,美國(guó))；Hfsafe-1200生物安全柜(上海力申有限公司)；Quanta 200F型掃描電子顯微鏡(FEI公司，美國(guó))；Octenisept?(舒美公司，德國(guó))；8%次氯酸鈉溶液、硫代硫酸鈉、吐溫80、卵磷脂、L-半胱氨酸(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司)。

1.2 建立體外糞腸球菌感染根管模型

1.2.1 樣本的選擇和處理 選取因牙周病等原因新鮮拔除的單根管前牙70 顆，無裂痕、無近髓齲壞、未行根管治療、根尖孔發(fā)育完全。去除牙結(jié)石和牙周膜后截去牙冠，標(biāo)準(zhǔn)化根管長(zhǎng)度至12 mm。拔髓后，用ProTaper鎳鈦銼按Crown-down法預(yù)備根管至F3。待根管干燥后，用復(fù)合樹脂封閉根尖孔。將制備好的樣本放入含BHI液體培養(yǎng)基的玻璃試管中，121 ℃、1.5 MPa高溫高壓滅菌后，將裝有樣本的玻璃試管放入37 ℃需氧條件下孵育24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。確認(rèn)試管內(nèi)液體清亮，無細(xì)菌生長(zhǎng)后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 糞腸球菌菌懸液的制備 取少量標(biāo)準(zhǔn)糞腸球菌(ATCC 29212)凍干粉，于2 ml無菌BHI肉湯中培養(yǎng)復(fù)蘇后劃線接種于BHI瓊脂培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、 CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h后，在電子比濁儀上調(diào)配菌液濃度為McFarland 0.5(1.5×108CFU/ml)。

1.2.3 體外糞腸球菌根管感染模型的建立 將調(diào)配好的糞腸球菌菌液按100 μl/根管接種至根管內(nèi)。按5 個(gè)樣本/試管分別放入含5 ml BHI液體培養(yǎng)基的試管中。所有樣本置于37 ℃、CO2培養(yǎng)箱中孵育，隔日更換1 次新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)21 d。期間隨機(jī)抽樣對(duì)試管內(nèi)的培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)，以確定無雜菌污染。

1.3 檢測(cè)抗菌效果

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 將70 個(gè)成功建立的糞腸球菌根管感染模型，按隨機(jī)數(shù)字表法，以沖洗液的不同分為7 組：A組(5.25%次氯酸鈉溶液)、B組(2.5%次氯酸鈉溶液)、C組(1%次氯酸鈉溶液)、D組(100%Octenisept)、E組(50%Octenisept)、F組(25%Octenisept)和G組(生理鹽水陰性對(duì)照)，每組10 個(gè)樣本。

1.3.2 沖洗前根管內(nèi)取樣及細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù) 用無菌紙尖吸干根管內(nèi)的培養(yǎng)液，注入0.2 ml生理鹽水，靜置1 min，每個(gè)根管插入3 根30#無菌紙尖吸取根管內(nèi)液體至飽和后，放入裝有2 ml生理鹽水的離心管中，震蕩器上震蕩30 s，10 倍系列稀釋后取50 μl稀釋液接種于BHI瓊脂培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)菌落數(shù)(CFU/ml)。

1.3.3 根管沖洗 各組分別采用新鮮配制的沖洗液5 ml緩慢沖洗根管1 min，使沖洗液充盈根管，靜置4 min后，A～C組5%硫代硫酸鈉液1 ml沖洗根管并靜置1 min，以中和次氯酸鈉；D～E組用Octenisept的中和劑(3%吐溫80、0.3%卵磷脂、0.1% L-半胱氨酸，無菌PBS液配制)沖洗根管并靜置1 min；G組用無菌PBS液1 ml沖洗根管并靜置1 min。

1.3.4 沖洗后根管內(nèi)取樣及細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù) 方法同1.3.2。

1.3.5 掃描電鏡觀察沖洗后根管感染模型 每組沖洗后隨機(jī)抽取5 個(gè)樣本置于2.5%戊二醛中固定，48 h后取出；樣本沿牙體長(zhǎng)軸劈開，PBS緩沖液沖洗3 次，每次5 min；脫水、鍍膜后，將實(shí)驗(yàn)樣本后置于掃描電鏡下觀察根管內(nèi)壁冠1/3、中1/3、根尖1/3糞腸球菌生物膜清除情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。將細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果按1 g(CFU/ml+1)做對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，每組沖洗前與沖洗后根管細(xì)菌量的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；各組沖洗前、后細(xì)菌量差值的比較采用單因素方差分析，之后兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)各組根管沖洗前、后根管內(nèi)細(xì)菌取樣計(jì)數(shù)值見表 1。

組別n細(xì)菌計(jì)數(shù)(CFU/ml)沖洗前沖洗后差值A(chǔ)107.03±0.112.49±0.124.54±0.04aB107.03±0.093.37±0.093.67±0.03bC107.01±0.073.73±0.043.28±0.03cD107.03±0.093.38±0.093.64±0.03bE106.99±0.073.72±0.053.26±0.03cF107.04±0.123.90±0.033.09±0.04dG107.05±0.104.50±0.072.56±0.03e

注： 不同字母代表組間相比差異有顯著性(LSD檢驗(yàn)，P<0.05)

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，沖洗前各組根管內(nèi)細(xì)菌數(shù)量差異無顯著性(P>0.05)。各實(shí)驗(yàn)組沖洗后根管內(nèi)細(xì)菌數(shù)量較沖洗前顯著降低(P<0.01)。各組沖洗前后細(xì)菌計(jì)數(shù)差值從大到小依次為A組、B組、D組、C組、E組、F組、G組。組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，其中A組與其余各組間差異顯著(P<0.05 )；B組、D組間差異無顯著性(P>0.05)，與其余各組間有顯著差異(P<0.05)；C組與E組間差異無顯著性(P>0.05)，與其余各組間有顯著差異(P<0.05)。

各實(shí)驗(yàn)組經(jīng)不同沖洗液沖洗后，掃描電鏡下分別觀察根管內(nèi)壁冠1/3、中1/3、根1/3段糞腸球菌生物膜的清除效果(圖 3)。圖中可見A、B、C、D、E、F組沖洗液對(duì)根管冠1/3處的糞腸球菌生物膜都有較好的清除效果；各組對(duì)根中1/3處的細(xì)菌生物膜清除情況一般，A組效果明顯優(yōu)于其他各組，B組與D組清除效果相近，但優(yōu)于C組與E組(2 組生物膜清除效果相近)，F(xiàn)組效果最差；各組對(duì)根尖1/3處的糞腸球菌生物膜效果均較差(圖 1)。

圖 1 各組沖洗后電鏡掃描圖像比較

3 討 論

糞腸球菌為人類腸道正常菌群，是一種機(jī)會(huì)感染菌。當(dāng)抗生素大量使用或宿主免疫力低下時(shí)，宿主與菌群失衡，糞腸球菌離開正常寄居部位進(jìn)入其他組織器官，局部聚集粘附于宿主細(xì)胞，通過分泌細(xì)胞溶解素、明膠酶等毒力因子[8-10]侵襲破壞宿主組織細(xì)胞，并耐受宿主的非特異性免疫應(yīng)答，引起感染性疾病的發(fā)生發(fā)展。糞腸球菌可侵入側(cè)支根管、根管峽部以及根管側(cè)壁的牙本質(zhì)小管內(nèi)，被認(rèn)為是導(dǎo)致根管治療失敗和持續(xù)性根尖周炎的主要致病菌[11]，并有學(xué)者提出糞腸球菌所致的難治性根尖周炎引起全身健康的可能[12]。因此，積極控制根管系統(tǒng)內(nèi)的糞腸球菌數(shù)量是必需的。在進(jìn)行根管治療時(shí)，為盡可能殺滅根管內(nèi)細(xì)菌，在進(jìn)行根管機(jī)械預(yù)備的同時(shí)，還需要輔以積極有效根根管沖洗。

理想的根管沖洗液應(yīng)具備以下性能：高效廣譜的抗菌作用；良好的組織溶解性能；對(duì)生活組織無細(xì)胞毒性作用；對(duì)牙體硬組織無腐蝕性；且性能持久穩(wěn)定。Octenisept是一種新型的局部抗菌劑，具有廣泛的抗菌譜，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌和真菌有很好的抗菌作用，并對(duì)生物膜內(nèi)細(xì)菌有效，且不易產(chǎn)生耐藥性[13]。這是由于其主要抗菌成分鹽酸奧替尼啶是一種陽(yáng)離子活性物質(zhì)，可與帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)合，使其擾亂微生物細(xì)胞功能導(dǎo)致細(xì)菌死亡。有研究發(fā)現(xiàn)Octenisept的抗菌效果不受血液、體液影響，抗菌作用持久穩(wěn)定[14]。此外，大量研究表明，Octenisept不被皮膚，黏膜或傷口吸收，對(duì)生活組織無毒性[15]。因此，本實(shí)驗(yàn)選取Octenisept作為根管沖洗液，并檢測(cè)其對(duì)糞腸球菌及其生物膜的抗菌效果。本實(shí)驗(yàn)通過建立體外糞腸球菌根管感染模型檢測(cè)不同濃度的Octensiept作為根管沖洗液對(duì)根管內(nèi)糞腸球菌的清除效果。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)100%Octenisept對(duì)感染根管模型中的糞腸球菌有較好的殺菌作用，其抗菌效果低于5.25%次氯酸鈉，與2.5%NaOCl的效果相當(dāng)；50%Octenisept的抗糞腸球菌效果與1%NaOCl的相近；25%Octenisept對(duì)糞腸球菌的殺菌效果不理想。這一結(jié)果與Bukhary等[7]的研究結(jié)果一致。但是也有研究發(fā)現(xiàn)Octenisept對(duì)糞腸球菌的抗菌效果與5.25%NaOCl一致[16]，甚至優(yōu)于5.25%NaOCl[4]。不同實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異，分析原因可能是由于感染模型建立方法和細(xì)菌取樣方法不同所致。但是，以上結(jié)果均表明Octenisept溶液用具有良好的抗菌性能，提示其用于根管沖洗的可行性。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過掃描電鏡觀察根管內(nèi)壁經(jīng)不同根管沖洗溶液作用后糞腸球菌生物膜的清除效果。結(jié)果表明，各種濃度Octenisept溶液與次氯酸鈉溶液均對(duì)根管冠1/3處的糞腸球菌生物膜有較好的清除效果；對(duì)根中1/3處的細(xì)菌生物膜清除情況一般，其效果差異與細(xì)菌取樣結(jié)果一致：100%Octenisept與2.5%次氯酸鈉結(jié)果相近但低于5.25%次氯酸鈉，50%Octenisept與1%次氯酸鈉結(jié)果相近，25%Octenisept最差；各組對(duì)根尖1/3處的糞腸球菌生物膜均無明顯作用，這可能與進(jìn)入根管中下段沖洗液的量較少有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)研究表明Octenisept溶液對(duì)根管內(nèi)糞腸球菌有較好的抗菌作用，尤其是100%Octenisept的作用效果最佳，與2.5%次氯酸鈉作用效果相近，可考慮作為根管沖洗劑的替代品。但是，本實(shí)驗(yàn)選取的牙齒為單根管的離體牙，根管系統(tǒng)相對(duì)簡(jiǎn)單，所以O(shè)ctenisept對(duì)于復(fù)雜根管系統(tǒng)的消毒效果還有待研究。此外，Octenisept用于根管沖洗目前還只限于離體牙的研究，其在患者口腔內(nèi)的抗菌效果還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。