徐小波　嚴(yán)敏　歐正銓　任憲路　師蔚群

摘要：為了解進(jìn)口豬精液常溫保存稀釋粉的實(shí)際應(yīng)用效果，選購市場(chǎng)上常見的6種進(jìn)口稀釋粉進(jìn)行比較試驗(yàn)。結(jié)果表明：隨著常溫保存時(shí)間的延長(zhǎng)，不同稀釋粉組間，活力下降速度存在差異，其中DILTEC和CXM下降最快，PRIMXCELL組下降最慢。精子有效存活時(shí)間差異很大，由長(zhǎng)到短的順序?yàn)镻RIMXCELL>ACTIYE>XINZUAN>SpermPro>CXM>DILTEC;總存活時(shí)間也是PRIMXCELL最長(zhǎng)，達(dá)到384 h以上;保存120 h頂體完整率存在顯著差異，從高到低順序?yàn)镻RIMXCELL>SpermPro>XINZUAN>ACTIYE>CXM>DILTEC。說明法國(guó)的PRIMXCELL稀釋粉最好，有效存活時(shí)間242 h，總存活時(shí)間384 408 h，保存120 h頂體完整率79.6%。

關(guān)鍵詞：公豬精液;稀釋粉;常溫保存;精子活力;頂體完整率

中圖分類號(hào)： S814.3;S828.3+4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）09-0201-03

1956年英國(guó)學(xué)者Polge成功地將豬人工授精技術(shù)從試驗(yàn)研究應(yīng)用于養(yǎng)豬生產(chǎn)實(shí)踐，但直到20世紀(jì)80年代這項(xiàng)技術(shù)才真正在養(yǎng)豬生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用[1]。我國(guó)豬人工授精推廣較晚，且外種豬引進(jìn)（造成發(fā)情鑒定不準(zhǔn)確）等原因嚴(yán)重影響了本項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展。一些養(yǎng)豬發(fā)達(dá)國(guó)家人工授精的普及率在90%以上[2-3]，我國(guó)豬人工授精的比例在40%左右，規(guī)模豬場(chǎng)的比例達(dá)85%。雖然豬冷凍精液能實(shí)現(xiàn)豬精液的長(zhǎng)期保存，但其技術(shù)相對(duì)復(fù)雜、成本高且受胎率低，所以99%以上采用常溫保存精液來實(shí)施豬人工授精[4]。豬精液的活力保存是人工授精的重要環(huán)節(jié)，其中稀釋粉的配制是保證精子質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一。國(guó)外稀釋粉研究較早，保存效果相對(duì)較好，目前常見的進(jìn)口稀釋粉有丹麥的亞衛(wèi)、比利時(shí)的CMX、美國(guó)的VIM、西班牙BIO、法國(guó)卡蘇BTS等，進(jìn)口稀釋粉種類多，價(jià)格貴，效果差別較大。為篩選出優(yōu)秀的進(jìn)口稀釋粉，本研究挑選出市售常見的6種進(jìn)口稀釋粉進(jìn)行效果比較，以期為豬人工授精的推廣應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 稀釋粉

選購市場(chǎng)上常見的6種進(jìn)口稀釋粉（法國(guó)PRIMXCELL、荷蘭SpermPro、丹麥ACTIYE、西班牙DILTEC、比利時(shí)CXM和韓國(guó)XINZUAN）進(jìn)行比較試驗(yàn)。

1.2 公豬精液

試驗(yàn)用精液來源于徐州惠牧種畜禽有限公司18月齡的健康大約克種豬，于2017年5月共4次采集同一頭公豬精液（公豬號(hào)HM15385），手握法采精，收集中段精子含量高的部分（丟棄射精開始與結(jié)束時(shí)精清含量高的部分）精液，每次采精結(jié)束10 min內(nèi)用豬精子質(zhì)量計(jì)算機(jī)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)原精密度與活力（表1），平均分成6份，準(zhǔn)備稀釋。

1.3 精液的稀釋和保存

在精液稀釋前1 h，將6種不同的稀釋粉按說明書分別用雙蒸水配制成稀釋液，置于37 ℃恒溫水浴中預(yù)熱備用。采集的新鮮精液檢查合格后30 min內(nèi)完成稀釋，根據(jù)精液密度確定稀釋倍數(shù)（稀釋終密度為3.5×107個(gè)/mL），保證80～100 mL 稀釋精液中含有效精子數(shù)30×108個(gè)左右。稀釋前將稀釋液的溫度調(diào)至與精液溫度之差小于1 ℃，將稀釋好的精液分裝在10 mL青霉素瓶中做好6種不同標(biāo)記并編號(hào)，用多層毛巾覆蓋在室溫中緩慢降溫，3～4 h后置于17 ℃的恒溫箱中保存。保存過程中每隔12 h輕輕翻動(dòng)1次，防止精子在瓶底沉淀時(shí)間過長(zhǎng)，影響活力保存。

1.4 精子活力檢查

每隔24 h，從6種稀釋精液中各取出1瓶輕輕搖勻后置于37 ℃水浴中預(yù)熱2 min，取中層精液10 μL涂片，用豬精子質(zhì)量計(jì)算機(jī)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)精子活力變化。

1.5 頂體完整率

于稀釋后保存120 h，使用南京建成精子快速染色試劑盒按程序?qū)舆M(jìn)行涂片染色，在1 000倍光學(xué)顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)頂體完整率（即頂體完整的精子所占總精子的比例）。

1.6 數(shù)據(jù)處理

精子活力及頂體完整率檢測(cè)均采用多視野（3個(gè)以上）平均值，用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SPSS 18.0進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同豬精液稀釋粉在稀釋過程中對(duì)精子活力的影響

6種稀釋粉稀釋后的精液，精子活力均有所下降（表2），其中西班牙的DILTEC和比利時(shí)的CXM下降幅度較大（P<0.05），其次是法國(guó)的PRIMXCELL和丹麥的ACTIYE（P<0.05），荷蘭的SpermPro下降幅度較小（P<0.05），韓國(guó)的XINZUAN下降最小（P<0.05）。說明不同的稀釋粉，在稀釋過程中對(duì)精子的應(yīng)激損傷程度有差異。

2.2 不同豬精液稀釋粉對(duì)精子常溫保存過程中活力的影響

隨著常溫保存時(shí)間的延長(zhǎng)，精子活力呈現(xiàn)逐步下降（表3），但不同稀釋粉組間，下降速度存在差異，其中DILTEC和CXM下降較快，PRIMXCELL下降最慢，ACTIYE、SpermPro和XINZUAN下降速度居中且總速度相近，但ACTIYE表現(xiàn)為前期（120 h前）下降速度較快（3組下降速度依次為每天2.56、2.00和2.37百分點(diǎn)），后期（120～360 h）下降速度較慢（3組下降速度依次為每天6.15、6.42、6.89百分點(diǎn)）。

2.3 不同精液稀釋粉對(duì)精子有效存活時(shí)間、總存活時(shí)間和頂體完整率的影響

6種稀釋粉組的有效存活時(shí)間（活力維持在60%以上的存活時(shí)間）在162～242 h差異很大，由長(zhǎng)到短的順序?yàn)镻RIMXCELL>ACTIYE>XINZUAN>SpermPro>CXM>DILTEC，PRIMXCELL有效存活時(shí)間最長(zhǎng)，DILTEC最短;活力在30%時(shí)的存活時(shí)間在273～353 h之間，由長(zhǎng)到短的順序?yàn)镻RIMXCELL>ACTIYE>SpermPro>XINZUAN>CXM>DILTEC，其中ACTIYE、SpermPro和XINZUAN很接近，都在 338 h 左右;總存活時(shí)間也是PRIMXCELL最長(zhǎng)，達(dá)到384 h以上，DILTEC最短，只有312 h以上。6種稀釋粉組保存 120 h 頂體完整率存在顯著差異，其中PRIMXCELL最高（79.6%），顯著高于DILTEC最低（69.8%），從高到低順序?yàn)镻RIMXCELL>SpermPro>XINZUAN>ACTIYE>CXM>DILTEC（表4）。

3 討論與結(jié)論

3.1 豬精液稀釋粉及其添加物的作用

豬原精不進(jìn)行適當(dāng)稀釋，在室溫下放置十幾小時(shí)就會(huì)全部失去活力，常溫保存稀釋液提供豬精子存活并保持受精能力所需的能量物質(zhì)及適宜的環(huán)境（pH值和滲透壓等），稀釋液中不同的添加物具有不同的作用，葡萄糖提供能量維持滲透壓，碳酸氫鈉、Tris和檸檬酸鈉提供酸堿環(huán)境，EDTA防止頂體反應(yīng)，谷胱甘肽和褪黑激素保護(hù)質(zhì)膜防止氧化損傷，海藻糖和蔗糖等對(duì)質(zhì)膜和頂體結(jié)構(gòu)有保護(hù)作用，BSA作為蛋白保護(hù)劑則通過穩(wěn)定精子結(jié)構(gòu)等多途徑保護(hù)精子，維生素C和氯丙嗪能抑制或降低精子的運(yùn)動(dòng)，這些添加物的適量使用與合理配合才能最大限度地延長(zhǎng)稀釋精液在常溫保存的時(shí)間[5]。蘇澤智等自制的稀釋粉保存5 d的精子活力為63%，頂體完整率78.4%[6]，活力不同程度地低于本試驗(yàn)選的6種進(jìn)口稀釋粉，頂體完整率相當(dāng)。尤如華等選用6種進(jìn)口稀釋粉與自配稀釋粉進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)法國(guó)的PRIMXCELL活力保存時(shí)間最長(zhǎng)，且自配與進(jìn)口的在保存7 d活力差異不是很大，但之后活力差距迅速拉開[7]，由于其鮮精活力與本研究相比較低，所以保存相同時(shí)間的精子活力和總存活時(shí)間均低于本試驗(yàn)結(jié)果，但其比較與排序結(jié)果基本吻合。

3.2 精子活力、頂體完整率與受精能力

豬人工授精實(shí)踐證明，豬一次正常輸精量為80～100 mL，必須含有25×108個(gè)左右的精子，才能得到較高的受胎率。同時(shí)對(duì)精子活力的要求必須在60%以上，否則受胎率也會(huì)受到嚴(yán)重影響，所以保持60%精子活力的存活時(shí)間才是有意義的存活時(shí)間，并確定為有效存活時(shí)間。另外，精子的頂體含有多種與受精有關(guān)的酶，在頂體穿過透明帶和放射冠中發(fā)揮重要作用，只有頂體完整、有活力的精子才具備受精能力，所以有些形態(tài)正常的精子雖然有活力但不具備受精能力，那是因?yàn)槠漤旙w結(jié)構(gòu)異常所致，同樣一些頂體形態(tài)正常，但精子尾部丟失等精子整體形態(tài)不正常的精子則沒有活力，也不具備受精能力，因此在對(duì)精液受精能力進(jìn)行判定時(shí)，在活力檢查的基礎(chǔ)上結(jié)合頂體染色是很必要的[8]。本研究選擇在常溫下保存120 h在活力檢測(cè)后進(jìn)行頂體染色檢查，結(jié)果顯示所有稀釋粉組精子活力都在64.9%以上，頂體完整率都在70%以上，說明6種稀釋液雖然保存精子活力的時(shí)間有差異，但保存5 d都不會(huì)影響正常的受精。

3.3 研制高效國(guó)產(chǎn)稀釋粉很有必要

目前養(yǎng)殖場(chǎng)使用較多的為進(jìn)口稀釋粉，雖然進(jìn)口稀釋粉價(jià)格較貴，但國(guó)產(chǎn)稀釋粉保存時(shí)間短、受精效果差，所以人們寧愿選擇較貴的稀釋粉來保證較好的保存與受精質(zhì)量，從而能在生產(chǎn)中得到較好的回報(bào)。因此，對(duì)好的進(jìn)口稀釋粉的成分進(jìn)行研究，在國(guó)內(nèi)已有稀釋劑中添加各種利于精子活力保存的成分，以期研制出價(jià)格低、保存時(shí)間長(zhǎng)、受精能力強(qiáng)的稀釋粉，打破國(guó)人迷信進(jìn)口稀釋粉的狀況，推動(dòng)我國(guó)豬人工授精行業(yè)的快速發(fā)展。

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