高熳熳　白俊巖　孫磊　程書梅　霍書英

摘要：通過2種檢測(cè)方法測(cè)定了有機(jī)磷水解酶對(duì)不同有機(jī)磷農(nóng)藥的降解功效，一種方法是通過氣相色譜法直接檢測(cè)降解產(chǎn)物中農(nóng)藥的殘留量來評(píng)價(jià)有機(jī)磷水解酶對(duì)不同農(nóng)藥的降解功效;另一種方法是利用有機(jī)磷類農(nóng)藥可以抑制乙酰膽堿酯酶的活性，受抑制的膽堿酯酶不能將靛酚乙酸酯（紅色）分解為靛酚（藍(lán)色）和乙酸的原理，通過測(cè)定有機(jī)磷水解酶降解后有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留量對(duì)膽堿酯酶的抑制作用來評(píng)價(jià)有機(jī)磷水解酶對(duì)不同有機(jī)磷農(nóng)藥的降解功效。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：有機(jī)磷水解酶對(duì)甲基對(duì)硫磷、對(duì)硫磷、喹硫磷和敵敵畏具有高效降解作用，降解率在82.2%～98.7%;其次是氧樂果、久效磷和敵百蟲，降解效率在28.1%～45.4%;其他的降解效率均在20%以下。

關(guān)鍵詞：有機(jī)磷水解酶;有機(jī)磷農(nóng)藥;膽堿酯酶;降解功效

中圖分類號(hào)： S481+.8;X592文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）08-0217-03

20世紀(jì)90年代，我國(guó)有機(jī)磷類農(nóng)藥的年產(chǎn)量曾達(dá)到 300 000 t，目前，雖然一些毒性大的有機(jī)磷農(nóng)藥已被禁用，但一些低毒的有機(jī)磷農(nóng)藥仍在使用[1]，并且除了作為殺蟲劑之外擴(kuò)展到殺菌劑、殺鼠劑、除草劑、脫葉劑和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等方面使用。因有機(jī)磷農(nóng)藥具有藥效高、品種多、防治范圍廣、成本低等特點(diǎn)，因此一些禁用的有機(jī)磷農(nóng)藥還在偷偷生產(chǎn)使用，并且常因使用、保管不當(dāng)有機(jī)磷農(nóng)藥中毒事件也時(shí)有發(fā)生[2]。有機(jī)磷類農(nóng)藥對(duì)農(nóng)產(chǎn)品、大氣、土壤、水源等具有極大的污染[3-4]，其對(duì)環(huán)境和人類的危害，已成為事關(guān)人類健康和國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重大問題。因此有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶的研制是消除和解毒農(nóng)藥殘留的一種安全、有效的方法[5]，具有無毒、無殘留、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)。

有機(jī)磷水解酶（OPH）被公認(rèn)為最具有應(yīng)用前景的有機(jī)磷降解酶，目前由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主研發(fā)的“有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶制劑”已廣泛投入生產(chǎn)使用，比如“比亞蔬菜瓜果農(nóng)藥降解酶”、馬蒂爾“蔬菜瓜果農(nóng)藥降解酶”“綠芯農(nóng)藥降解酶”等農(nóng)藥降解產(chǎn)品已在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上大量應(yīng)用;但目前并沒有統(tǒng)一的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)來評(píng)價(jià)這些酶制劑降解底物的范圍，對(duì)底物的降解效果如何。本試驗(yàn)研究了有機(jī)磷水解酶對(duì)不同有機(jī)磷農(nóng)藥的降解功效，并通過氣相色譜法和膽堿酯酶抑制法2種檢測(cè)方法測(cè)定了有機(jī)磷水解酶對(duì)不同有機(jī)磷農(nóng)藥的降解功效，并對(duì)2種檢測(cè)方法進(jìn)行了比較。

1材料與方法

1.1試劑與材料

甲基對(duì)硫磷（CAS：298-00-0）、敵敵畏（CAS：62-73-7）、氧樂果（CAS：1113-02-6）、甲胺磷（CAS：10265-92-6）、甲拌磷（CAS：298-02-2）、內(nèi)吸磷（CAS：8065-48-3）、對(duì)硫磷（CAS：56-38-2）、敵百蟲（CAS：52-68-6）、喹硫磷（CAS：1776-83-6）、殺撲磷（CAS：950-37-8）、三唑磷（CAS：24017-47-8）、久效磷（CAS：6923-22-4），純度均≥99%，購(gòu)自德國(guó)Merck公司;丙酮、乙腈、氯化鈉（色譜純）;磷酸鹽緩沖液（分析純）;95%乙醇;膽堿酯酶、靛酚乙酸酯，購(gòu)自Solarbio;有機(jī)磷水解酶（OPH），由北京森根比亞生物技術(shù)有限公司提供[酶活性≥11 μmol/（min·mg）]。

1.2儀器與設(shè)備

恒溫水浴鍋（HH-W600，金壇市朗博儀器制造有限公司）;酶標(biāo)儀（美國(guó)伯樂，Bio-rad）;氣相色譜儀（帶氮磷檢測(cè)器，備有毛細(xì)管柱，美國(guó)Thermo TRACE GC ULTRA）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠，RE-52A）;氮吹儀（上海育模儀器有限公司，YMDCY-12S）;真空泵（上海育模儀器有限公司，YDP-02）;高速離心機(jī)（上海安亭，LXJ-IIB）;分析天平（上海儀電分析儀器有限公司，PHS-3DW）。

1.3有機(jī)磷水解酶對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥降解功效的氣相色譜法測(cè)定

1.3.1有機(jī)磷農(nóng)藥濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制用 100 mg/L 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品分別配成2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 μg/mL不同濃度的丙酮溶液，氣相色譜測(cè)定峰面積，繪制峰面積-濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并確定不同農(nóng)藥的出峰時(shí)間。

1.3.2氣相色譜條件

型號(hào)為Thermo TRACE GC ULTRA;色譜柱為石英毛細(xì)管柱，DB-1701，30 m×0.53 mm（內(nèi)徑）×1.0 μm（膜厚）;載氣為氮?dú)猓兌却笥?9.999%）;載氣流速10 mL/min，尾吹氣流速為30 mL/min;氫氣流速為 75 mL/min，空氣流速為100 mL/min;柱溫為初始溫度150 ℃保持1 min，以 20 ℃/min 升至270 ℃，保持15 min;進(jìn)樣口溫度為250 ℃;檢測(cè)器溫度為250 ℃;進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣量為1 μL;開閥時(shí)間為1.5 min。

1.3.3有機(jī)磷水解酶對(duì)不同有機(jī)磷農(nóng)藥的降解率測(cè)定取10 mL 1 μg/mL的不同農(nóng)藥工作液，加入5 mL ?pH值為8.0的1 mg/mL有機(jī)磷水解酶，對(duì)照組加入等量的磷酸鹽緩沖液，置于生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行反應(yīng)，溫度控制在37 ℃，反應(yīng)10 min，然后取出迅速加入30 mL乙腈萃取降解反應(yīng)殘留的農(nóng)藥底物，顛倒混勻，加入5 g氯化鈉，劇烈振蕩1 min，4 000 r/min 離心5 min，乙腈相取出10 mL，相當(dāng)于樣品量的1/3，移人 50 mL 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，先用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至1 mL，在室溫下用氮吹儀濃縮至近干，用丙酮定容1 mL，供氣相色譜測(cè)定，計(jì)算出酶降解后農(nóng)藥的殘留量，然后計(jì)算有機(jī)磷水解酶的降解率。

有機(jī)磷水解酶對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥降解率的計(jì)算公式：

R=X-X0X×100%。

式中：R為生物制品的降解效率;X為反應(yīng)體系中降解反應(yīng)前標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥的濃度;X0為反應(yīng)體系中降解反應(yīng)結(jié)束后殘留農(nóng)藥的濃度。

1.4有機(jī)磷水解酶降解率的酶抑制法測(cè)定

1.4.1膽堿酯酶抑制率曲線的建立在試管中加入470 μL不同濃度的有機(jī)磷農(nóng)藥（對(duì)照管加等量pH值為7.0的 50 mmol/L 磷酸緩沖液）、10 μL 的200 U/g乙酰膽堿酯酶，混勻，于37 ℃水浴中反應(yīng)10 min，加入20 μL靛酚乙酸酯，混勻，37 ℃反應(yīng)5 min，加入500 μL 95%乙醇終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀在605 nm處測(cè)定吸光度[6]。計(jì)算酶的抑制率，以農(nóng)藥濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)、抑制率為縱坐標(biāo)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。抑制率的計(jì)算公式為：

I=（U0-U1）/U0×100%。

式中：U0為未受抑制的酶活性;U1為受農(nóng)藥抑制的酶活性。

1.4.2有機(jī)磷水解酶降解率的測(cè)定取470 μL不同濃度1.5、2.5、5 μg/mL有機(jī)磷農(nóng)藥加入有機(jī)磷水解酶至終濃度為 1 000 mg/L，對(duì)照組加入等量的磷酸鹽緩沖液，37 ℃反應(yīng) 20 min，沸水中加熱5 min終止反應(yīng)，然后用酶抑制法測(cè)定有機(jī)磷水解酶降解產(chǎn)物中農(nóng)藥的殘留量。

1.4.3計(jì)算方法有機(jī)磷農(nóng)藥可以抑制乙酰膽堿酯酶活性，受抑制的膽堿酯酶不能將靛酚乙酸酯（紅色）分解為靛酚（藍(lán)色）和乙酸，根據(jù)“1.4.1”節(jié)的膽堿酯酶的抑制率與農(nóng)藥濃度的對(duì)數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)曲線查找與抑制率對(duì)應(yīng)的農(nóng)藥濃度的對(duì)數(shù)值，計(jì)算出有機(jī)磷水解酶降解產(chǎn)物中農(nóng)藥的殘留量，然后再根據(jù)“1.3.3”節(jié)有機(jī)磷水解酶降解率的計(jì)算公式計(jì)算有機(jī)磷水解酶的降解率。

2結(jié)果與分析

2.1氣相色譜法檢測(cè)農(nóng)藥降解結(jié)果

由表1可知，有機(jī)磷水解酶對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥降解率比較高的是甲基對(duì)硫磷、對(duì)硫磷、喹硫磷和敵敵畏，降解率在82.2%～98.7%之間;其次是氧樂果、久效磷和敵百蟲 （28.1%～45.4%）;其他的降解率均在20%以下，同時(shí)各個(gè)農(nóng)藥回收率范圍為75%～105%。

2.2有機(jī)磷水解酶對(duì)不同農(nóng)藥降解率的酶抑制法測(cè)定

2.2.1敵敵畏的抑制率曲線和有機(jī)磷水解酶的降解率由圖1可見，以敵敵畏濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，膽堿酯酶抑制率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 二者呈線性關(guān)系，r2=0.990 6。通過抑制率曲線計(jì)算得出有機(jī)磷水解酶對(duì)3種濃度敵敵畏的降解率均達(dá)到90%以上（表2），說明該酶對(duì)敵敵畏具有較好的降解效果。

2.2.2敵百蟲的抑制率曲線和有機(jī)磷水解酶的降解率由圖2可見，以敵百蟲濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，膽堿酯酶抑制率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，二者呈線性關(guān)系，r2=0.992。通過抑制率曲線計(jì)算得出有機(jī)磷水解酶對(duì)3種濃度敵百蟲降解率平均值在58%左右（表3），說明該酶對(duì)敵百蟲降解效果一般。

2.2.3甲基對(duì)硫磷抑制率曲線和酶降解率測(cè)定結(jié)果由圖3可見，以甲基對(duì)硫磷濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，膽堿酯酶抑制率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，二者呈線性關(guān)系，r2=0.992 5。通過抑制率曲線計(jì)算得出有機(jī)磷水解酶對(duì)3種濃度甲基對(duì)硫磷的降解率均達(dá)到98%以上（表4），說明該酶對(duì)甲基對(duì)硫磷的降解效果較好，同時(shí)也說明該酶抑制法能夠方便準(zhǔn)確地測(cè)定該酶的降解效率。

3討論與結(jié)論

我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng)藥的使用可以降低病蟲害，因此農(nóng)藥的使用在我國(guó)非常普遍[7]，每年施用80萬～100萬t的化學(xué)農(nóng)藥[8]，其中殺蟲劑占農(nóng)藥總數(shù)的75%，而在殺蟲劑中，有機(jī)磷殺蟲劑占所有殺蟲劑的75%[9-10]。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)的農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留現(xiàn)象非常嚴(yán)重，為了降低農(nóng)藥殘留和農(nóng)殘毒性的危害，目前農(nóng)藥降解酶制劑產(chǎn)品的生產(chǎn)和使用也越來越多，但市場(chǎng)上銷售的有機(jī)磷水解酶制劑產(chǎn)品并不標(biāo)注其農(nóng)藥降解范圍和降解率，并且時(shí)?？浯笃渥饔眯Ч?，目前我國(guó)還沒有出臺(tái)正式的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)農(nóng)藥降解酶制劑產(chǎn)品進(jìn)行規(guī)范檢測(cè)和監(jiān)督，參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法（GB/T 5009.20—2003《食品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的測(cè)定》），筆者建立了有機(jī)磷水解酶對(duì)農(nóng)藥降解功效的氣相色譜測(cè)定方法。筆者通過氣相色譜法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有機(jī)磷水解酶（OPH）對(duì)甲基對(duì)硫磷、對(duì)硫磷、喹硫磷和敵敵畏降解效果非常好，降解率在82.2%～98.7%，尤其是對(duì)甲基對(duì)硫磷降解率甚至可達(dá)99%;其次是對(duì)氧樂果、久效磷和敵百蟲降解率偏低，降解率在28.1%～45.4%;對(duì)其他有機(jī)磷農(nóng)藥降解率則更低，一般都在20%以下。

氣相色譜法（GC）具有靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，它的柱效高、分離能力強(qiáng)、靈敏度高，主要用于低分子量、易揮發(fā)有機(jī)化合物的分析，目前80%的農(nóng)藥殘留檢測(cè)采用GC，定性和定量測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠、靈敏度高[11]。筆者建立的農(nóng)藥降解酶的降解率的氣相色譜測(cè)定法適用于多種酶制劑對(duì)不同農(nóng)藥底物降解率的測(cè)定，但也存在操作步驟繁多、農(nóng)藥回收率不穩(wěn)定、對(duì)儀器和技術(shù)條件要求高、在實(shí)際應(yīng)用中不易廣泛推廣使用等缺點(diǎn)。

為了建立一種操作簡(jiǎn)便、便于掌握、在實(shí)踐中易推廣應(yīng)用的農(nóng)藥降解酶對(duì)農(nóng)藥降解率的測(cè)定方法，筆者參照農(nóng)藥殘留的酶抑制測(cè)定法（GB/T 5009.199—2003《蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的快速檢測(cè)》）加以改進(jìn)建立了有機(jī)磷水解酶降解功效的膽堿酯酶抑制測(cè)定法。通過該測(cè)定方法檢測(cè)的有機(jī)磷水解酶對(duì)敵敵畏降解率在92%以上，對(duì)敵百蟲的降解率在54%～65%之間，對(duì)甲基對(duì)硫磷的降解率在98%以上。有機(jī)磷水解酶對(duì)敵敵畏和甲基對(duì)硫磷的降解功效與氣相色譜法測(cè)定結(jié)果一致，但對(duì)敵百蟲降解功效的測(cè)定結(jié)果偏高，這可能是因?yàn)椴煌袡C(jī)磷農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶活性的抑制作用不同，有研究發(fā)現(xiàn)21種有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制作用較強(qiáng)的是敵敵畏;其次是毒死蜱、甲胺磷、殺撲磷、速滅磷及內(nèi)吸磷;較弱的為樂果、久效磷、異稻瘟凈、馬拉硫磷及乙拌磷[12]。因此該方法適用于對(duì)膽堿酯酶活性抑制作用較強(qiáng)的有機(jī)磷農(nóng)藥降解率的測(cè)定，所以該方法雖然操作方法簡(jiǎn)單，便于掌握但有一定的局限性。

通過氣相色譜法和酶抑制法的結(jié)果顯示，有機(jī)磷水解酶對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥確實(shí)有一定降解效果，其中對(duì)于甲基對(duì)硫磷的降解效果最好，對(duì)其他有機(jī)磷農(nóng)藥也有一定的降解效果。這為以后研發(fā)固定化酶來降解有機(jī)磷農(nóng)藥殘留提供了理論依據(jù)。通過采用酶來處理農(nóng)藥及其殘留物，不僅可以降低直接使用微生物菌種對(duì)環(huán)境造成的風(fēng)險(xiǎn)和危害，還可以利用酶比微生物本身的耐受性強(qiáng)、能夠在更惡劣的環(huán)境中存活的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)農(nóng)藥殘留物進(jìn)行降解。固化酶對(duì)環(huán)境條件的忍受能力較強(qiáng)，常用于對(duì)農(nóng)藥的降解和污染物處理。有機(jī)磷水解酶降解有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留物效果較好[13]，因此須要加強(qiáng)對(duì)其穩(wěn)定性和固定化技術(shù)的研究，從而更好地利用它來降解農(nóng)藥殘留物。另外在生產(chǎn)實(shí)踐中根據(jù)實(shí)際情況選擇有機(jī)磷水解酶降解率的測(cè)定方法，加強(qiáng)對(duì)市場(chǎng)有機(jī)磷水解酶制劑產(chǎn)品的檢測(cè)和監(jiān)管，對(duì)于規(guī)范市場(chǎng)、保證農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量、維護(hù)人類健康具有重要的意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]寧詩(shī)琦. 土壤中殘留有機(jī)磷農(nóng)藥的環(huán)境行為及生物修復(fù)研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2017，23（8）：93-95.

[2]付廣云，韓長(zhǎng)秀. 有機(jī)磷農(nóng)藥及其危害[J]. 化學(xué)教育，2005（1）：9-10.

[3]王賽妮，李蘊(yùn)成. 我國(guó)農(nóng)藥使用現(xiàn)狀、影響及對(duì)策[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007（20）：3853-3855.

[4]劉穎. 我國(guó)農(nóng)藥使用現(xiàn)狀、原因及對(duì)策研究[J]. 國(guó)土與自然資源研究，2005（4）：50-51.

[5]虞云龍，樊德方，陳鶴鑫. 農(nóng)藥微生物降解的研究現(xiàn)狀與繁殖策略.[J]環(huán)境科學(xué)進(jìn)展，1996，4（3）：28-36.

[6]羅永偵. 產(chǎn)有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶菌株的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究[D]. 南寧：廣西大學(xué)，2007：15.

[7]王政. 發(fā)酵食品中有機(jī)磷農(nóng)藥的微生物降解研究[D]. 湖北工業(yè)大學(xué)，2017：1.

[8]周春梅. “入世”與中國(guó)農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留的應(yīng)對(duì)措施[J]. 農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2001，21（6）：7-10.

[9]崔洪力，李強(qiáng)，劉美良. 農(nóng)藥殘留及監(jiān)控對(duì)策[J]. 農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2002，22（5）：74-76.

[10]王文嬌，張濤，陳健美，等. 韭菜農(nóng)藥殘留現(xiàn)狀及防控技術(shù)[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（10）：82-84.

[11]張苗苗，王素雅. 農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥檢測(cè)殘留及消解研究進(jìn)展[J]. 糧食與飼料工業(yè)，2016，10（4）：15-18.

[12]顏冬云，蔣新，余貴芬，等. 有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)乙酰膽堿酯酶活性的聯(lián)合抑制作用[J]. 科技與開發(fā)，2006，45（1）：31-34.

[13]王靜巖，傅營(yíng)，王斌. 微生物降解農(nóng)藥研究[J]. 北京農(nóng)業(yè)，2015（8）：6.