沈小瑞， 王鈺， 陳達(dá)偉

(安徽大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院， 合肥 230601)

紅曲霉(Monascusspp.)在中國(guó)的應(yīng)用有著很久遠(yuǎn)的歷史，在工業(yè)、食品、醫(yī)學(xué)等方面都占據(jù)著重要作用[1-3]。紅曲霉可產(chǎn)多種對(duì)人體有益的次生代謝產(chǎn)物，如γ-氨基丁酸、麥角甾醇、洛伐他汀等。其中洛伐他汀是當(dāng)今世界治療高血脂癥的有效藥物之一，具有多種藥理作用[4-6]。常見(jiàn)產(chǎn)洛伐他汀真菌有紅曲霉，土曲霉與青霉菌，但產(chǎn)量不適宜大規(guī)模生產(chǎn)，提高洛伐他汀的產(chǎn)量具有重要意義。?；D(zhuǎn)移酶LovD是洛伐他汀的生物合成中一個(gè)重要酶， LovD 催化 Monacolin J(洛伐他汀前體物)進(jìn)行轉(zhuǎn)?；饔?，合成洛伐他汀[7]。所以研究LovD基因?qū)β宸ニ〉纳锖铣删哂兄匾饬x[8]。

根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)是一種革蘭氏陰性菌[9]，有將自身部分DNA轉(zhuǎn)移到宿主基因組中的能力，在基因工程和分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究中具有重要作用[10]。De Groot等[11]利用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化黑曲霉，為絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化開(kāi)創(chuàng)了新的研究方法。目前，根癌農(nóng)桿菌已被成功運(yùn)用于食藥用真菌、動(dòng)植物致病性真菌等多種真菌的遺傳轉(zhuǎn)化。據(jù)報(bào)道，已有超過(guò)125種真菌通過(guò)此方法完成遺傳轉(zhuǎn)化[12-15]，但對(duì)紅曲霉的農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化研究相對(duì)較少。

本研究以紫外誘變后得到的高產(chǎn)洛伐他汀菌株M120-1為出發(fā)菌株，通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆LovD基因序列，構(gòu)建過(guò)量表達(dá)載體，使用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)紅曲霉遺傳轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性菌株，通過(guò)高效液相色譜法篩選高產(chǎn)洛伐他汀菌株，并對(duì)其進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性分析，以期為研究紅曲霉產(chǎn)洛伐他汀分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

紅曲霉M120-1由本學(xué)院資源植物保護(hù)與利用研究組通過(guò)紫外誘變篩選及保存[16]。大腸桿菌DH5α、根癌農(nóng)桿菌由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑

洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司。TaqPlus酶、膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工。pMD18-T載體、pRI101-AN表達(dá)載體(啟動(dòng)子為 CaMv 35S，終止子為 NOS)購(gòu)自TaKaRa公司。乙酰丁香酮，卡那霉素等均為分析純，購(gòu)于上海生工公司。PCR引物由上海生工合成。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：稱取200 g土豆切塊，煮沸30 min后加入2% 葡萄糖，1% 瓊脂粉，定容至1 L，pH值自然， 121℃高壓滅菌30 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：100 mL甘油，20 mL玉米漿，10 g硝酸鈉，10 g乙酸鈉，5 g甲硫氨酸，5 g KH2PO4，2 g MgSO4·7H2O，定容至1 L，pH值自然， 121℃高壓滅菌30 min。。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紅曲霉總RNA提取及cDNA第一鏈合成

稱取1 g紅曲霉，加入 1 mL RNAiso Reagent，振蕩混勻，4 ℃ 12 000 r/min，離心 5 min。吸取上清液平均分至 2個(gè)離心管中。加入 1/5 體積的氯仿。乳化靜置后離心，加入等體積的異丙醇，混勻靜置后離心，加入 75%的乙醇 1 mL，搖勻離心，棄去乙醇。RNA沉淀的清洗，待 RNA 沉淀完全溶解后于-80 ℃保存。1.5%甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)。

RT-PCR反應(yīng)體系:上樣緩沖液4 μL，RNA 2 μL，隨機(jī)引物1 μL，反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，去RNA 酶水12 μL，共20 μL，37 ℃ 15 min。

1.2.2 表達(dá)載體構(gòu)建

膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化。將回收、純化后得到的目的片段與pRI101-AN表達(dá)載體進(jìn)行過(guò)夜連接。熱刺激轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑法篩選陽(yáng)性菌株，將克隆片段交由上海生工進(jìn)行測(cè)序。把帶有LovD基因的質(zhì)粒，整合進(jìn)根瘤農(nóng)桿菌中，采取PCR檢測(cè)分析轉(zhuǎn)化菌株。

1.2.3 紅曲霉遺傳轉(zhuǎn)化

將紅曲霉菌株接種至PDA培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)15 d后，制備孢子懸液，用無(wú)菌水將孢子稀釋濃度為1×105個(gè)/mL。誘導(dǎo)培養(yǎng)農(nóng)桿菌時(shí)誘導(dǎo)劑乙酰丁香酮(AS)濃度為140 μmol/L，根癌農(nóng)桿菌的OD600值為0.6，農(nóng)桿菌和紅曲霉孢子于30 ℃共培養(yǎng)3 d。對(duì)其紅曲霉LovD基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化共得到1000個(gè)左右的轉(zhuǎn)化子，隨機(jī)挑選12個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.2.4 高產(chǎn)洛伐他汀菌株篩選

取2 mL發(fā)酵液于6 mL乙酸乙酯中，超聲30 min，6000 r/min，離心10 min。將上清液于微孔濾膜過(guò)濾， HPLC檢測(cè)分析。檢測(cè)條件：波長(zhǎng)238 nm，梯度洗脫，進(jìn)樣量10 μm，柱溫35 ℃，流動(dòng)相：乙腈和0.1%磷酸緩沖液。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=3×10-8x+0.003 (R2=0.9968)，其中x表示峰面積，y表示為濃度mg/mL。

1.2.5 遺傳穩(wěn)定性分析

將篩選出的高產(chǎn)洛伐他汀轉(zhuǎn)化菌株連續(xù)培養(yǎng)9代，測(cè)定1、3、5、7及9代的洛伐他汀產(chǎn)量，以其產(chǎn)量為標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)其遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲霉總RNA提取

圖1 紅曲霉總RNA主要脂糖凝膠電泳

吸取1 μL紅曲霉總RNA樣品，用1.5%甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)，總RNA的3條帶非常明亮，其中28S rRNA和18S rRNA兩個(gè)條帶亮度好，條帶邊緣比較分明，且28S rRNA大概為18S rRNA的兩倍的亮度，說(shuō)明提取的質(zhì)量較高，沒(méi)有降解和DNA污染，滿足用來(lái)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 紅曲霉轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定

(Marker：GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, 75、 200、 300、 400、 500、 700、 1000、 1500、 2000、 3000、 4000、 5000、 7000、 10 000、 20 000 bp)

圖2紅曲霉轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定結(jié)果

Figure 2 PCR assay results ofMonascustransformants

根據(jù)遺傳轉(zhuǎn)化體系獲取轉(zhuǎn)化子1000個(gè)左右，隨機(jī)挑選12個(gè)轉(zhuǎn)化子，1-14分別代表：水，原始菌株，MD-1，MD-2，MD-3，MD-4，MD-5，MD-6，MD-7，MD-8，MD-9，MD-10，MD-11，MD-12進(jìn)行PCR鑒定，如圖所示，12個(gè)轉(zhuǎn)化子中有10個(gè)出現(xiàn)條帶，水和原始菌株中沒(méi)有出現(xiàn)明顯的條帶，故得到證明T-DNA成功導(dǎo)入到紅曲霉基因組中。

2.3 紅曲霉洛伐他汀的產(chǎn)量測(cè)定

表1 紅曲霉洛伐他汀的產(chǎn)量測(cè)定

注：P≤0.05

對(duì)初步篩選的10個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)，30 ℃培養(yǎng)7 d，通過(guò)HPLC測(cè)定洛伐他汀產(chǎn)量，方差分析結(jié)果如表1所示，其中9株的洛伐他汀產(chǎn)量高于出發(fā)菌株[16]，且MD-5的產(chǎn)量最高，與其他9個(gè)菌株在P≤0.05表現(xiàn)出顯著性差異。MD-5的洛伐他汀產(chǎn)量為0.55 mg/mL，比出發(fā)菌株高出63%。

2.4 轉(zhuǎn)化菌株遺傳穩(wěn)定性

對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量最高的紅曲霉轉(zhuǎn)化菌株MD-5進(jìn)行傳代培養(yǎng)，分析其遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果如表2所示，子代相對(duì)于第 1 代產(chǎn)量略有下降，但每組之間以及和一代對(duì)比沒(méi)有表現(xiàn)出顯著性差異，基本保持產(chǎn)量的穩(wěn)定性， MD-5轉(zhuǎn)化菌株表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。

表2 高產(chǎn)洛伐他汀菌株的穩(wěn)定性分析

3 討論

常見(jiàn)產(chǎn)洛伐他汀真菌有紅曲霉、土曲霉與青霉菌，但其產(chǎn)量都不是很高，并不適宜進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。目前已通過(guò)菌種改良、發(fā)酵工藝優(yōu)化及基因工程技術(shù)等方法提高洛伐他汀產(chǎn)量[17-18]。

通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紅曲霉遺傳轉(zhuǎn)化，獲得的MD-5菌株洛伐他汀產(chǎn)量為0.55 mg/mL。根瘤農(nóng)桿菌導(dǎo)入的LovD過(guò)量表達(dá)載體是否與染色體發(fā)生重組，或形成獨(dú)立的質(zhì)粒有待進(jìn)一步研究。