常亞南，王瀑童，吳玉杰，袁曉波，樊亞棟， 張 莉，王苗苗，李夢(mèng)園，孟凡榮，李永春

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南鄭州 454002; 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州 454002)

MicroRNA(miRNA)是一類在植物中廣泛存在的小RNA(21～24nt)，在植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控和逆境脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮重要調(diào)控功能[1-2]。近年來，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，大量的植物miRNA被鑒定。目前，在miRNA數(shù)據(jù)庫(miRBase)中已包含了82種植物的miRNA信息，其中來源于擬南芥、水稻、玉米和小麥的miRNA分別有428、738、325和125條。在擬南芥中，一些miRNA參與了碳氮代謝的調(diào)控過程[3]；在水稻[4]和玉米[5]中，一些miRNA參與了干旱、高鹽、淹水等逆境脅迫的響應(yīng)過程；最近的研究顯示，小麥根系中依賴于miRNA的調(diào)控途徑參與了谷胱甘肽相關(guān)的氧化還原調(diào)控過程[6]。在大量被鑒定的植物miRNA中，miR167是一類植物中普遍存在的保守型miRNA，在植物發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能。比如，miR167與擬南芥的胚和根系發(fā)育調(diào)控密切相關(guān)[7-8]，在番茄中該miRNA過表達(dá)后導(dǎo)致了花發(fā)育異常和雌性不育[9]，在水稻中miR167具有不同的時(shí)空表達(dá)模式[10-11]，且對(duì)植物外源生長(zhǎng)素具有特定的響應(yīng)模式[12]。目前，有關(guān)小麥miR167的研究還未見報(bào)道。我們前期發(fā)現(xiàn)，miR167與小麥籽粒的發(fā)育調(diào)控密切相關(guān)[13]。本研究擬系統(tǒng)分析小麥中該miRNA的染色體定位、序列特征、時(shí)空表達(dá)特性及其對(duì)滲透脅迫的響應(yīng)，為明確miR167在小麥發(fā)育調(diào)控及逆境脅迫響應(yīng)過程中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

小麥(TriticumaestivumL.)材料包括豫麥18、矮抗58和中國春3個(gè)品種，于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)基地種植。在開花期掛牌，依次剪取授粉后5、10、15、20、25、30 d的麥穗，剝?nèi)∽蚜！Ｓ酌缡覂?nèi)培養(yǎng)：選取籽粒飽滿小麥種子經(jīng)HgCl2表面消毒7 min后用無菌水沖洗；在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，氣候箱光照強(qiáng)度為240 mol·m-2·s-1，光照時(shí)間為14 h，溫度為24 ℃(光照)和18 ℃(黑暗)。滲透脅迫處理方法為：將培養(yǎng)至二葉一心期的幼苗，用20%的PEG6000溶液進(jìn)行模擬干旱脅迫處理；用150 mmol·L-1的NaCl溶液進(jìn)行模擬鹽脅迫處理；在脅迫處理0、0.5、1、2、6、12、24、 48 h分別剪取根系和葉片組織備用。用于進(jìn)行不同組織表達(dá)特性分析的材料包括：田間種植條件下成熟籽粒，開花期的穗下節(jié)、旗葉、節(jié)間、節(jié)，以及室內(nèi)培養(yǎng)的三葉一心期的根系和葉片組織。上述試驗(yàn)均設(shè)三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，所有組織取樣后均需迅速液氮速凍，然后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因染色體定位和生物信息學(xué)分析

采用來源于小麥的miR167e序列進(jìn)行小麥基因組數(shù)據(jù)庫EnsemblPlants(http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index)比對(duì)分析，對(duì)MIR167基因進(jìn)行定位并注釋。利用NCBI轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)庫搜索TaMIR167e基因的轉(zhuǎn)錄序列。運(yùn)用RNAfold軟件(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/rna-folding-form)對(duì)pre-miR167序列的發(fā)卡結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；運(yùn)用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)MIR167e基因的啟動(dòng)子元件進(jìn)行預(yù)測(cè)。運(yùn)用PASPA(http://bmi.xmu.edu.cn/paspa/interface/run_PASPA.php)對(duì)MIR167e基因的下游調(diào)控序列進(jìn)行預(yù)測(cè)。采用primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，克隆TaMIR167e的上游引物為YP1669(5′-GCCCCCAATTATTCCCACCTCT-3′)，下游引物為YP1667(5′-AGTAACACCCAAGAAACCC AGATCC-3′)，基因組A特異性鑒定上游引物YP1673(5′-CTCTCTCTCTCTCTCCCTCCCTCA-3′)，基因組B特異性鑒定上游引物YP1670(5′-GACCTCCTTCCCCGCCC-3′)，與通用下游引物YP1667組合進(jìn)行基因組A、B的鑒定。tae-miR167e的表達(dá)分析引物為YP0943(5′-TGAAGCTGCCAGCATGATCTGA-3′)，下游引物為全式金試劑盒提供的通用引物。定量分析采用U6為內(nèi)標(biāo),引物序列為：YP1303(5′-CCTTCGGGGACATCCGATAAA-3′)和YP1304(5′-ATTTGGACCATTTCTCGATTTGTGC-3′)。

1.3 RNA提取和cDNA的克隆

總RNA的提取采用Trizol法，具體的提取步驟參照TaKaRa的RNAiso Plus的說明書進(jìn)行。并通過非變形瓊脂糖凝膠電泳及分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的完整性、質(zhì)量、純度和濃度。用于tae-miR167e基因克隆的cDNA采用試劑盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser)，用于tae-miR167e表達(dá)特性分析的cDNA采用試劑盒(TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis Supermix)。合成的cDNA于 -80 ℃保存?zhèn)溆?。以上述cDNA為模板，克隆片段經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后、DNA片段凝膠回收、純化、連接到pMD19-T載體。利用基因組A、B特異性引物，篩選出基因組A、B和D(A、B以外的重組克隆)的單克隆，送公司測(cè)序。

1.4 表達(dá)特性分析

采用Bio-Rad CFXConnectTM熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)體系為20 μL，包括cDNA模板1 μL，2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，上下游引物 (10 μM)各0.4 μL，用RNase-free water補(bǔ)足到20 μL。每個(gè)反應(yīng)3次重復(fù)。采用兩步法PCR，94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。熒光定量結(jié)果用2-△△Ct法計(jì)算，用Excel 2003作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥 MIR167e基因的鑒定和序列分析

課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，tae-miR167的一個(gè)家族成員(5′- TGAAGCTGCCAGCATGATCTGA -3′)在小麥籽粒發(fā)育過程中逐漸上調(diào)表達(dá)；通過與miRBase數(shù)據(jù)庫序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該miRNA為小麥miR167家族新成員，將其命名為tae-miR167e(圖1A)。利用該miRNA序列進(jìn)行小麥基因組Ensembl Plants比對(duì)分析顯示，ta-miR167e基因位于第5同源群染色體的短臂，將其在A、B和D基因組的3個(gè)部分同源基因分別命名為ta-miR167e-5AS、ta-miR167e-5BS和ta-miR167e-5DS；通過與NCBI轉(zhuǎn)錄組的序列比對(duì)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和加尾信號(hào)的預(yù)測(cè)分析，將ta-miR167e的3個(gè)部分同源基因進(jìn)行了注釋(圖1B)。序列比對(duì)顯示，3個(gè)部分同源基因在上游調(diào)控區(qū)域差異較大，與5AS位點(diǎn)相比，5BS和5DS在上游調(diào)控區(qū)域的序列一致性分別為88%和86%。通過PlantCARE軟件對(duì)該基因上游 2 000 bp啟動(dòng)子區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)，上游調(diào)控區(qū)包含有光響應(yīng)相關(guān)元件(GATA-motif和G-box)、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件(TGA-element)、分生組織特異調(diào)控元件(CCGTCC-box和CAT-box)、Myb結(jié)合位點(diǎn)(MBS和MRE)、種子特異調(diào)控相關(guān)順式作用元件RY-element和脫落酸響應(yīng)原件ABRE等多個(gè)調(diào)控元件。為進(jìn)一步證實(shí)ta-miR167e前體的序列特征，利用特異引物YP1669和YP1667從3個(gè)小麥品種(中國春、豫麥18和矮抗58)的cDNA中擴(kuò)增獲得了長(zhǎng)度約431 bp的片段(圖1C)。將該片段回收、連接到T-載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌，利用A、B和D基因組特異引物對(duì)重組克隆進(jìn)行鑒定，然后進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游85～225 bp(豫麥18)的RNA折疊區(qū)域高度保守；但3個(gè)部分同源基因之間仍存在SNP差異(圖1D)；通過RNA折疊分析顯示，3個(gè)部分同源基因均能形成特定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)(圖1E)。對(duì)克隆區(qū)域的序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在所檢測(cè)的3個(gè)品種間存在SNP和InDel差異，在第32和79個(gè)核苷酸位置豫麥18中分別存在2個(gè)核苷酸缺失和1個(gè)SNP差異，在第364和390位核苷酸處，矮抗58存在2個(gè)SNP差異(圖1F)。

2.2 籽粒發(fā)育過程中tae-miR167e的表達(dá)模式

利用實(shí)時(shí)定量對(duì)tae-miR167e在小麥籽粒發(fā)育過程中的表達(dá)動(dòng)態(tài)分析結(jié)果(圖2)顯示，豫麥18小麥籽粒發(fā)育過程中tae-miR167e的表達(dá)量逐漸上升，授粉后第30天時(shí)表達(dá)量最高；矮抗58小麥僅在籽粒發(fā)育后期(授粉后30 d)表現(xiàn)出該miRNA的迅速上調(diào)表達(dá)，表達(dá)量為籽粒發(fā)育早期的10倍左右；在中國春中，從授粉后20d起tae-miR167e的表達(dá)量也明顯上調(diào)，直至籽粒發(fā)育后期仍保持較高的表達(dá)水平?？傮w來看，tae-miR167e在小麥籽粒發(fā)育過程中呈上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，這預(yù)示著該miRNA在籽粒發(fā)育過程中發(fā)揮重要調(diào)控功能；tae-miR167e的表達(dá)動(dòng)態(tài)在品種間存在明顯差異，在花后10～25 d期間，該miRNA的表達(dá)量在豫麥18籽粒中最高，其次是中國春，在矮抗58中表達(dá)水平最低；但在花后30 d時(shí)，在矮抗58中最高，這種表達(dá)差異可能與不同品種的籽粒發(fā)育特性有關(guān)。

A：小麥miR167家族成員的序列比對(duì)；tae-miR167a～d的基因來源于miRBase數(shù)據(jù)庫中的小麥；B：TaMIR167e三個(gè)部分同源基因的基因組結(jié)果；DS：下游；C：TaMIR167e基因的cDNA擴(kuò)增結(jié)果；M：DL2000；1：矮抗58；2：豫麥18；3：中國春；D：Pre-miR167基因的A、B、D序列比對(duì)；黑色實(shí)線：成熟的miR167e的序列；E：Pre-miR167e的RNA折疊的發(fā)卡結(jié)構(gòu)；綠色堿基：成熟miR167e序列；F:三個(gè)品種間TaMIR167e基因克隆區(qū)域序列比對(duì)分析

A:Sequence comparison of miR167s in wheat;tae-miR167a-d was derived from wheat sequences in miRBase datebase; B:Genomic results of three partial homologous genes ofTaMIR167e; DS:Downstream; C:Results of cDNA amplification ofTaMIR167egene; M:DL2000; 1-3:Fragments amplified from the cDNA of wheat variety Aikang 58,Yumai 18 and Chinese Spring,respectively; D:Comparison of A,B and D homologous of pri-miR167e genes,and the mature miR167e sequences are highlighted with black line; E:RNA folding hairpin structure of pri-miR167e and mature miR167e sequence is highlighted with green base; F:Sequence alignment of cloned regions ofTaMIR167efrom the three varieties.

圖1 小麥TaMIR167e三個(gè)部分同源基因的克隆及特征分析

Fig.1 Cloning and characterization of three homeologous genes of TaMIR167e

2.3 小麥tae-miR167e的組織表達(dá)特性

通過檢測(cè)不同組織中tae-miR167e的表達(dá)特性發(fā)現(xiàn)(圖3)，在3葉期，該miRNA在葉片和根系中表達(dá)量較高，在成熟種子中次之，開花期穗下節(jié)中表達(dá)量最低；在開花期旗葉、節(jié)間和節(jié)中的表達(dá)量在品種間差異較大。在開花期豫麥18旗葉中，tae-miR167e的表達(dá)量顯著低于矮抗58和中國春，而在3葉期幼葉和開花期的節(jié)間中，該miRNA的表達(dá)量顯著高于另兩個(gè)品種，且在節(jié)間中的表達(dá)量最高。不同品種間該miRNA的差異表達(dá)可能與品種間發(fā)育調(diào)控的差異有關(guān)，例如，開花期矮抗58的莖和節(jié)間中該miRNA的表達(dá)水平較低，這可能與該品種植株較矮有關(guān)?？傮w來看，tae-miR167e在不同品種和相同品種不同組織間存在表達(dá)差異，推測(cè)其對(duì)小麥不同組織的發(fā)育有一定的調(diào)控作用。

圖柱上的字母不同表示材料間差異顯著(P<0.05)。圖3同。

Different letters on the columns in dicate significant difference among the three materials at 0.05 level.The same in figure 3.

圖2 tae-miR167e在籽粒發(fā)育過程中的表達(dá)特性分析

Fig.2 Expression patterns of tae-miR167e in developing wheat grains

圖3 tae-miR167e的組織表達(dá)特性分析Fig.3 Expression characteristics of tae-miR167e in different tissues

2.4 小麥tae-miR167e對(duì)滲透脅迫的響應(yīng)

在PEG6000溶液(20%)介導(dǎo)的模擬干旱脅迫條件下(圖4A和B)，tae-miR167e在矮抗58和中國春兩個(gè)品種的根系和葉片中均表現(xiàn)出受干旱脅迫誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，不過在兩個(gè)品種間表達(dá)水平和動(dòng)態(tài)均有較大差異。在矮抗58根系中(圖4A)，tae-miR167e在受脅迫0.5 h時(shí)迅速上調(diào)表達(dá)，之后表達(dá)水平回落；而在中國春根系中，該miRNA在脅迫處理0.5 h時(shí)僅有小幅的上調(diào)表達(dá)，在脅迫處理12 h時(shí)表達(dá)水平迅速升高，之后逐漸回落。整體來看，矮抗58根系中該miRNA對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)要比中國春更快，這可能與矮抗58具有較強(qiáng)的抗旱能力有關(guān)。在矮抗58的葉片中(圖4B)，tae-miR167e受脅迫后表達(dá)逐漸上調(diào)，脅迫處理24 h達(dá)到最高；而在中國春葉片中，該miRNA雖然也表現(xiàn)出一定上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，但整體表達(dá)水平明顯低于矮抗58，推測(cè)tae-miR167e在小麥干旱脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮重要調(diào)控功能。在150 mmol·L-1NaCl鹽脅迫條件下，tae-miR167e在根系中的表達(dá)水平隨時(shí)間延長(zhǎng)雖有小幅的波動(dòng)，但是整體表現(xiàn)為受脅迫而表達(dá)下調(diào)的趨勢(shì)(圖4C)；從總體表達(dá)模式來看，tae-miR167e在鹽脅迫和干旱脅迫過程中表現(xiàn)出不同的響應(yīng)模式，這可能與這兩種滲透脅迫過程具有不同的脅迫響應(yīng)通路有關(guān)；在葉片中(圖4D)，所檢測(cè)兩個(gè)品種tae-miR167e呈現(xiàn)出相似的鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)模式，即整體表現(xiàn)為受鹽脅迫而上調(diào)表達(dá)，且在脅迫0.5 h和6 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)兩個(gè)表達(dá)峰，脅迫處理12 h后表達(dá)水平迅速回落；tae-miR167e在矮抗58小麥葉片中的表達(dá)水平明顯高于中國春，這可能與所檢測(cè)兩個(gè)品種間脅迫響應(yīng)機(jī)制的差異有關(guān)。

A：20%PEG處理的根；B：20%PEG處理的葉；C：150 mmol·L-1NaCl處理的根系；D：150 mmol·L-1NaCl處理的葉片。

A:Roots treated with 20% PEG; B:Leaves treated with 20% PEG; C:Roots treated with 150 mmol·L-1NaCl; D:Leaves treated with 150 mmol·L-1NaCl.

圖4 tae-miR167e在滲透脅迫過程中的表達(dá)模式

Fig.4 Expression patterns of tae-miR167e under osmotic stresses in wheat

3 討 論

小麥?zhǔn)侨蛑匾募Z食作物，提高小麥籽粒產(chǎn)量、改善加工品質(zhì)是保障世界糧食安全和提高人民生活水平的重要研究方向[14]。小麥籽粒發(fā)育過程是決定小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵時(shí)期，開展小麥籽粒發(fā)育分子調(diào)控機(jī)制的研究對(duì)于小麥高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)分子育種具有重要的意義。本課題組前期研究中，系統(tǒng)分析了小麥籽粒發(fā)育調(diào)控相關(guān)的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR167與籽粒發(fā)育過程密切相關(guān)[13]。本研究中，進(jìn)一步對(duì)小麥tae-miR167e的序列特征和表達(dá)模式進(jìn)行了系統(tǒng)分析，結(jié)果顯示，該miRNA在所檢測(cè)的3個(gè)品種中的表達(dá)模式均與籽粒灌漿過程呈正相關(guān)趨勢(shì)，這與大麥中的研究結(jié)果一致[15]。預(yù)示著該miRNA對(duì)小麥發(fā)育發(fā)揮重要調(diào)控功能。miR167e在灌漿過程中的表達(dá)水平在品種間存在一定的差異，在矮抗58中，花后20 d后開始上調(diào)表達(dá)，花后30 d達(dá)到最高，可能與該品種具有較高的抗逆特性有關(guān)。近年來，一些研究結(jié)果表明，miR167在植物發(fā)育的多個(gè)環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要調(diào)控功能。例如，擬南芥的miR167表達(dá)抑制導(dǎo)致了晚花表型[16]，該miRNA受藍(lán)光的誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá)[17]；水稻的miR167在花藥發(fā)育過程中特異上調(diào)表達(dá)，并持續(xù)到三細(xì)胞花粉階段[18]；另有研究發(fā)現(xiàn)，miR167通過調(diào)控其靶基因ARF6/8參與了龍眼(DimocarpuslonganLour)體細(xì)胞胚發(fā)育[19]、鴨茅(DactylisglomerataL.)階段發(fā)育[20]以及煙草的開花[21]調(diào)控過程。本研究發(fā)現(xiàn)，小麥的tae-miR167e在成熟種子、開花期旗葉、穗下節(jié)、節(jié)間和節(jié)、三葉期葉和根中存在時(shí)空差異表達(dá)現(xiàn)象，且表達(dá)模式在不同品種間存在差異。通過對(duì)該miRNA基因上游調(diào)控區(qū)域的序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)存在一些與發(fā)育調(diào)控相關(guān)的順式元件，比如分生組織特異的調(diào)控元件(CAT-box)和種子特異性調(diào)控元件(RY-element)等，這可能是影響該tae-miR167e出現(xiàn)時(shí)空表達(dá)差異的重要原因。

大量研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在逆境脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮重要功能。例如，miR1139參與了低磷脅迫的響應(yīng)調(diào)控[22]，miR408與水稻的冷脅迫和干旱脅迫響應(yīng)密切相關(guān)[23]。近期的研究也發(fā)現(xiàn)，miR167參與了多種逆境脅迫響應(yīng)的調(diào)控，比如番茄的細(xì)菌脅迫[24]、橡膠樹的干旱脅迫[25]及玉米的滲透脅迫[26]等。本研究發(fā)現(xiàn)，tae-miR167e對(duì)干旱和鹽脅迫均有響應(yīng)，且在根系和葉片中具有不同的響應(yīng)模式，而且干旱和鹽脅迫過程中該miRNA的表達(dá)模式也存在較大差異，這可能與干旱和高鹽脅迫具有不同的信號(hào)通路有關(guān)。序列分析顯示，在tae-miR167e基因上游調(diào)控區(qū)域存在一些與脅迫響應(yīng)相關(guān)的的元件，比如茉莉酸響應(yīng)元件(TGACG-motif)、脫落酸響應(yīng)元件(ABRE)、和光響應(yīng)元件(ATCT-motif)等，這些元件可能與該miRNA參與逆境脅迫響應(yīng)密切 相關(guān)。

在植物中，miRNA的序列相對(duì)較為保守，但是由于不同物種間基因組差異較大，導(dǎo)致編碼miRNA的基因也存在序列差異[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR167包含多個(gè)家族成員，tae-miR167e與其他成員的編碼基因間序列存在一定差異。與Ensemble數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析顯示，TA-MIR167A與第5染色體群的短臂基因位點(diǎn)100%匹配，而TA-MIR167C與第6染色群短臂的基因位點(diǎn)100%匹配；TA-MIR167B和TA-MIR167D在中國春基因組中未發(fā)現(xiàn)完全匹配的基因位點(diǎn)，這可能是由于不同小麥品種間的差異所致，也可能是miRNA形成過程中存在復(fù)雜的編輯現(xiàn)象所致，具體原因有待進(jìn)一步證實(shí)。由于miRNA家族的成員間可能存在功能互補(bǔ)或冗余現(xiàn)象，從基因組水平進(jìn)行miRNA基因的敲除和miRNA功能分析存在較大困難，因此直接針對(duì)成熟miRNA進(jìn)行人工miRNA過表達(dá)和STTM抑制表達(dá)分析就成為理想的分析方法[28]，關(guān)于小麥tae-miR167e的生物學(xué)功能驗(yàn)證分析工作仍在進(jìn) 行中。