劉海英，甄俊琦，茹振鋼，董 娜，高 遠(yuǎn)， 馮必得，張 麗，師學(xué)珍

(1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007； 2.河南科技學(xué)院小麥研究中心， 河南新鄉(xiāng) 453003； 3.河南師范大學(xué)新聯(lián)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007)

利用雜種優(yōu)勢(shì)是提高小麥產(chǎn)量最有效的途徑之一[1]。C49S[2]、BS210[3]和K78S[4]等溫光敏小麥雄性不育系的育成，為“二系法”雜交小麥制種提供了種質(zhì)保障。研究小麥雄性不育系小孢子發(fā)育過(guò)程并檢測(cè)花粉育性的變化，是揭示其敗育機(jī)理的細(xì)胞學(xué)依據(jù)[5]。

前人對(duì)玉米[6]、小麥[7-8]和水稻[9]等作物小孢子發(fā)育和育性檢測(cè)開(kāi)展了大量研究。目前，常用I2-KI染色法指示小孢子內(nèi)的淀粉積累情況，用醋酸洋紅和DAPI染色法指示細(xì)胞核情況。樣品固定液主要有FAA和卡諾氏固定液兩種，但對(duì)這兩種固定液在采用不同染色方法時(shí)是否會(huì)對(duì)觀察結(jié)果產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性影響，是何種影響，目前尚未見(jiàn) 報(bào)道。

小麥溫敏雄性不育系BNS366由河南科技學(xué)院茹振鋼教授育成，抽穗前低于8.9 ℃的日平均溫度可誘導(dǎo)其花粉敗育[7,10]，其近等基因系為鄭麥366。在本試驗(yàn)前期研究中嘗試過(guò)用FAA固定液對(duì)小麥小孢子進(jìn)行長(zhǎng)期固定，然后采用上述3種方法染色后觀察小麥小孢子發(fā)育進(jìn)程，發(fā)現(xiàn)I2-KI染色法指示淀粉積累情況效果良好，但醋酸洋紅和DAPI染色的細(xì)胞核模糊不清；接著進(jìn)行了改進(jìn)，將固定后樣品經(jīng)過(guò)70%～70%乙醇(每次30 min)置換并保存在70%乙醇中，然后再染色觀察，I2-KI染色法對(duì)淀粉積累情況指示效果變化不大，醋酸洋紅染色的小孢子細(xì)胞核達(dá)到可觀察狀態(tài)[10]，DAPI染色的細(xì)胞核依然模糊不清(內(nèi)部資料未發(fā)表)，推測(cè)小麥小孢子樣品固定和保存與其細(xì)胞學(xué)觀察效果聯(lián)系密切。為此，本試驗(yàn)以鄭麥366和BNS366為試驗(yàn)材料，對(duì)比了分別采用2種固定液(固定后立即進(jìn)行乙醇置換)、3種染色方法染色效果和花粉可育率統(tǒng)計(jì)結(jié)果的差異，為明確其小孢子發(fā)育和花粉育性檢測(cè)適宜的樣品固定液提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)在河南師范大學(xué)小麥試驗(yàn)田進(jìn)行，地處黃淮麥區(qū)(東經(jīng)113°54′，北緯35°19′，海拔 76.3 m)，屬于暖溫帶大陸性氣候。

1.2 試驗(yàn)材料

選擇溫敏小麥雄性不育系BNS366及其近等基因系鄭麥366為供試材料，均由河南科技學(xué)院小麥中心提供。于2017年10月11日播種，條播，小區(qū)長(zhǎng)3 m，寬1.5 m，行距0.25 m，株距 0.10 m，次年選代表型植株主莖穗進(jìn)行研究。按一般大田管理方式栽培。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置FAA(50%乙醇∶冰醋酸∶福爾馬林=18∶1∶1)和卡諾氏(無(wú)水乙醇∶冰醋酸= 3∶1)兩種固定液處理。參照劉海英等[10]的農(nóng)藝性狀判斷方法，配合鏡檢，在小孢子發(fā)育的單核期、二核期、三核期和開(kāi)花期，于上午9:00- 10:00，各選10穗代表型植株主莖穗，剪去頂部與基部各6個(gè)小穗，留下中部小穗，分別置于兩種固定液中， 0.034×105Pa抽真空30 min后在4 ℃條件下固定24 h，經(jīng)90%—80%—70%—70%梯度置換固定液(每次置換時(shí)間均為30 min)，最后轉(zhuǎn)入70%乙醇中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細(xì)胞學(xué)觀察

分別取FAA和卡諾氏固定液固定的材料，參照劉海英等[10]的方法進(jìn)行I2-KI法和醋酸洋紅法染色、制片、觀察和花粉育性統(tǒng)計(jì)。DAPI與I2-KI染色法相似，不同之處在于染色過(guò)程為滴加1 mg·L-1DAPI溶液且避光條件下靜置3 min左右，在Leica DMIL倒置熒光顯微鏡下用紫外光觀察、拍照和統(tǒng)計(jì)，小孢子細(xì)胞核呈發(fā)白發(fā)亮狀態(tài)，可育花粉判斷標(biāo)準(zhǔn)同醋酸洋紅染色法。

1.5 套袋自交結(jié)實(shí)率調(diào)查統(tǒng)計(jì)

于抽穗后開(kāi)花前各隨機(jī)選取10個(gè)麥穗分別套袋，成熟期按國(guó)內(nèi)法[9]調(diào)查和統(tǒng)計(jì)自交結(jié)實(shí)率。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016和SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同固定液對(duì)小孢子發(fā)育進(jìn)程中不同染色法染色效果的影響

2.1.1 對(duì)I2-KI法染色效果的影響

由圖1可知，采用FAA固定液固定， 經(jīng)I2-KI法染色后，在單核期，鄭麥366小孢子(圖1A)和BNS366小孢子(圖1E)均能觀察到一個(gè)細(xì)胞核，以BNS366的細(xì)胞核清晰度相對(duì)較高。在二核期之后，鄭麥366絕大部分小孢子始終維持圓形，細(xì)胞內(nèi)開(kāi)始積累淀粉，并隨發(fā)育進(jìn)程推進(jìn)，積累的淀粉逐漸增多，至開(kāi)花期淀粉充滿整個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞核由于淀粉積累區(qū)域的遮擋模糊不清(二核期)，至三核期之后完全觀察不到；BNS366則半數(shù)以上細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)皺縮變形，且隨發(fā)育進(jìn)程推進(jìn)，細(xì)胞變形程度加劇，變形細(xì)胞數(shù)量增多，在二核期僅見(jiàn)少數(shù)細(xì)胞內(nèi)有較少量淀粉積累，之后細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)淀粉存在，大部分細(xì)胞難以正常進(jìn)入二核期，且細(xì)胞核逐漸減小(二核期)直至消失(三核期之后)。由圖2可知，與FAA固定液相比，采用卡諾氏固定液固定、I2-KI法染色后，在二核期，細(xì)胞核清晰程度略有提高，但同樣由于染色區(qū)域的遮擋難以滿足細(xì)胞學(xué)觀察的要求；在二核期之后小孢子中I2-KI法染色區(qū)域顏色較淺，但不影響開(kāi)花期對(duì)花粉育性的判斷。

A～D:鄭麥366; E～F:BNS366; A、E:單核期; B、F:二核期; C、G:三核期; D、H:開(kāi)花期. 下同。

A-D:Zhengmai 366; E-F:BNS366; A and E:Uninucleate period; B and F:Binucleate period; C and G:Trinucleate period; D and H:Flowering period. The same in figures 2-6.

圖1 FAA固定液處理下鄭麥366和BNS366花粉粒的I2-KI染色結(jié)果

Fig.1 Pollens of Zhengmai 366 and BNS366 stained with I2-KI when fixed with FAA

圖2 諾氏固定液處理下鄭麥366和BNS366花粉粒的I2-KI染色結(jié)果Fig.2 Pollens of Zhengmai 366 and BNS366 stained with I2-KI when fixed with carnoys

以上結(jié)果表明，BNS366小孢子敗育在單核期向二核期轉(zhuǎn)變時(shí)開(kāi)始。采用兩種固定液固定、I2-KI染色法染色，均可以清晰地反映小孢子內(nèi)淀粉積累的情況，輔助判斷花粉育性，其中采用FAA固定液固定，對(duì)小孢子內(nèi)淀粉積累情況的指示效果較好；但均無(wú)法清晰觀察二核期之后細(xì)胞核的情況。

2.1.2 對(duì)醋酸洋紅法染色效果的影響

由圖3和圖4可知，采用兩種固定液固定，經(jīng)醋酸洋紅法染色后觀察到的鄭麥366和BNS366小孢子發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞外形的變化和內(nèi)容物積累情況與I2-KI染色法相似，細(xì)胞內(nèi)容物能被醋酸洋紅淺染但不適宜指示其成分。采用兩種固定液固定，在鄭麥366小孢子發(fā)育的不同時(shí)期，均可見(jiàn)到紅色的細(xì)胞核，且隨發(fā)育進(jìn)程推進(jìn)，細(xì)胞核的染色程度加重，二核期少量存在的細(xì)胞內(nèi)容物對(duì)細(xì)胞核觀察影響不大，三核期大量?jī)?nèi)容物與細(xì)胞核染色程度差別較小，難以同時(shí)觀察到三個(gè)清晰的細(xì)胞核，開(kāi)花期內(nèi)容物充實(shí)，能清晰看到兩個(gè)梭型精核和一個(gè)圓形營(yíng)養(yǎng)核，在單核期和二核期采用FAA固定液固定細(xì)胞核清晰度較高，在三核期和開(kāi)花期采用卡諾氏固定液固定細(xì)胞核清晰度較高；在BNS366小孢子細(xì)胞核染色程度變淺，大部分小孢子僅有一個(gè)細(xì)胞核，僅少數(shù)細(xì)胞可見(jiàn)兩個(gè)細(xì)胞核，三核期多數(shù)小孢子內(nèi)有比二核期縮小的細(xì)胞核，少數(shù)小孢子內(nèi)觀察不到細(xì)胞核，開(kāi)花期絕大部分小孢子不能被深染，細(xì)胞核消失不見(jiàn)，個(gè)別小孢子內(nèi)可見(jiàn)一個(gè)比三核期繼續(xù)縮小的細(xì)胞核，兩種固定液固定之間無(wú)顯著差異。

圖3 FAA固定液處理下鄭麥366和BNS366花粉粒的醋酸洋紅染色結(jié)果Fig.3 Pollens of Zhengmai 366 and BNS366 stained with acetate carmine when fixed with FAA

圖4 卡諾氏固定液處理下鄭麥366和BNS366花粉粒的醋酸洋紅染色結(jié)果Fig.4 Pollens of Zhengmai 366 and BNS366 stained with acetate carmine when fixed with carnoys

以上結(jié)果表明，采用醋酸洋紅染色法觀察到的鄭麥366和BNS366小孢子發(fā)育進(jìn)程與I2-KI染色法的基本一致，其優(yōu)勢(shì)在于對(duì)各時(shí)期細(xì)胞核的指示效果較好。采用兩種固定液固定，對(duì)不同時(shí)期發(fā)育小孢子的顯微觀察效果存在差異，在單核期和二核期，采用FAA固定液固定效果較好，在三核期和開(kāi)花期，采用卡諾氏固定液固定效果較好。

2.1.3 對(duì)DAPI法染色效果的影響

由圖5和圖6可知，采用兩種固定液固定，經(jīng)DAPI法染色后觀察到的鄭麥366和BNS366小孢子發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞外形的變化和內(nèi)容物積累情況與上述兩種染色法也基本一致，不同之處在于細(xì)胞內(nèi)容物積累情況僅能通過(guò)略顯白色區(qū)域判斷。DAPI染色法觀察到的細(xì)胞學(xué)變化與醋酸洋紅染色法相似，但DAPI法染色后細(xì)胞核發(fā)白高亮，與細(xì)胞質(zhì)略顯白色背景之間形成強(qiáng)烈反差，細(xì)胞核清晰度明顯高于醋酸洋紅法。與FAA固定液固定相比，采用卡諾氏固定液固定，小孢子細(xì)胞核清晰度較低，且在二核期和三核期出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)區(qū)域色調(diào)偏紅的現(xiàn)象。這些結(jié)果表明，在與前兩種染色法觀察到的小孢子發(fā)育規(guī)律基本吻合的前提下，DAPI染色法比醋酸洋紅染色法在清晰指示細(xì)胞核情況方面的優(yōu)勢(shì)更強(qiáng)，采用FAA固定液固定，小孢子細(xì)胞核清晰度較高，細(xì)胞圖像色調(diào)正常，效果更可靠。

圖5 FAA固定液處理下鄭麥366和BNS366花粉粒的DAPI染色結(jié)果Fig.5 Pollens of Zhengmai 366 and BNS366 stained with DAPI when fixed with FAA

圖6 卡諾氏固定液處理下鄭麥366和BNS366花粉粒的DAPI染色結(jié)果Fig.6 Pollens of Zhengmai 366 and BNS366 stained with DAPI when fixed with carnoys

2.2 花粉育性與自交結(jié)實(shí)率比較

在鄭麥366開(kāi)花期取樣，分別采用兩種固定液固定，經(jīng)3種染色方法對(duì)花粉染色后，統(tǒng)計(jì)花粉育性，并與成熟期自交結(jié)實(shí)率進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，采用FAA固定液固定，I2-KI(99.07%)和DAPI(97.47%)染色法以及采用卡諾氏固定液固定，I2-KI(95.59%)、醋酸洋紅(93.43%)和DAPI染色法(94.86%)染色的花粉可育率基本一致，高于采用FAA固定液固定、醋酸洋紅染色法染色的花粉可育率(72.15%)和自交結(jié)實(shí)率(70.83%)。

3 討 論

采用I2-KI、醋酸洋紅和DAPI染色法染色，均可以清楚觀察到BNS366敗育時(shí)期在單核期到二核期，這與賀曉敏等[7]的研究結(jié)果相一致。BNS366的近等基因系鄭麥366則表現(xiàn)出正?？捎←湹男℃咦影l(fā)育細(xì)胞學(xué)特征。這表明本試驗(yàn)?zāi)Ｐ图?xì)胞學(xué)現(xiàn)象準(zhǔn)確可靠，可以進(jìn)一步開(kāi)展細(xì)胞學(xué)觀察效果的比較研究。

固定液成分不同，其固定效果也不同，存在引起細(xì)胞學(xué)觀察效果差異的可能。FAA固定液組成成分(50%乙醇∶冰醋酸∶福爾馬林=18∶1∶1)中促使材料收縮的乙醇和福爾馬林的相對(duì)比例較高，對(duì)小麥小孢子內(nèi)容物及細(xì)胞核等細(xì)胞學(xué)特征的高保真固定均有利。劉子涵等[8]和趙卜等[11]采用FAA固定液固定不同時(shí)期的小麥花藥，I2-KI法和DAPI法染色后可分別清晰指示淀粉積累和細(xì)胞核狀況，醋酸洋紅染色后則由于內(nèi)容物也可以被淺染，造成細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核反差小，導(dǎo)致細(xì)胞核不易觀察。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，采用FAA固定液固定，I2-KI和DAPI染色法染色，細(xì)胞圖像均清晰明了，在單核期和二核期，細(xì)胞內(nèi)容物尚不豐富的條件下，醋酸洋紅染色法可以較好地指示細(xì)胞核情況，在三核期之后細(xì)胞圖像清晰度不理想，與前人研究結(jié)果基本一致。卡諾氏固定液組成成分(無(wú)水乙醇∶冰醋酸=3∶1)中促使材料膨脹的冰醋酸含量較高，具有軟化細(xì)胞壁的作用[12]，有助于小孢子內(nèi)容物的釋放，降低其對(duì)細(xì)胞核的遮擋效應(yīng)。王小利等[13]和錢(qián)煥煥等[14]采用卡諾氏固定液固定小麥穗，I2-KI法淀粉染色效果基本正常，醋酸洋紅法也存在細(xì)胞內(nèi)大量?jī)?nèi)容物影響細(xì)胞核清晰度的現(xiàn)象，與FAA固定液條件下小孢子顯微觀察效果相似，但由于前人一般在某一種固定液條件下開(kāi)展研究，難以在兩種固定液之間進(jìn)行比較分析，DAPI染色的細(xì)胞核模糊且在有些樣品細(xì)胞質(zhì)區(qū)域色調(diào)偏紅，推測(cè)樣品特殊性和固定液種類與這種現(xiàn)象的發(fā)生均可能有關(guān)，這需要在同一樣品體系下，采用FAA和卡諾氏固定液經(jīng)上述3種染色法染色后對(duì)小孢子發(fā)育細(xì)胞學(xué)特征進(jìn)行觀察和比較研究，對(duì)此目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)條件下，與FAA固定液固定相比，采用卡諾氏固定液固定，I2-KI法染色效果較淺，但不影響對(duì)淀粉積累情況的判斷，醋酸洋紅法染色可以清晰顯示細(xì)胞核情況，在單核期和二核期細(xì)胞核清晰度較低，但在三核期之后較高，表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)，DAPI法染色細(xì)胞圖像略模糊且色調(diào)偏紅，與已有研究結(jié)果基本吻合。這表明樣品固定液種類確實(shí)與小孢子顯微觀察效果關(guān)系密切，染色法不同，適宜采用的樣品固定液不同，即使同一染色法在小麥小孢子不同發(fā)育階段，適宜的樣品固定液也不同，對(duì)于I2-KI、單核期和二核期醋酸洋紅和DAPI染色法均以采用FAA固定液較適宜，對(duì)于三核期和開(kāi)花期醋酸洋紅染色法來(lái)說(shuō)，采用卡諾氏固定液較好。

花粉育性檢測(cè)結(jié)果往往需要與自交結(jié)實(shí)率進(jìn)行相關(guān)性分析，以驗(yàn)證花粉育性檢測(cè)手段的準(zhǔn)確性[10]。本研究中，與自交結(jié)實(shí)率相比，除采用FAA固定液固定、醋酸洋紅染色法染色外，采用兩種固定液固定，經(jīng)3種染色方法檢測(cè)到的花粉可育率一致偏高。原因可能是自交結(jié)實(shí)率來(lái)自整穗統(tǒng)計(jì)結(jié)果，而花粉可育率統(tǒng)計(jì)來(lái)自穗中部第1、第2位小花，即來(lái)自強(qiáng)勢(shì)部位強(qiáng)勢(shì)小花，進(jìn)一步改進(jìn)花藥取樣方法可能有助于解決二者不一致的問(wèn)題，對(duì)此尚需開(kāi)展進(jìn)一步研究。采用FAA固定液固定、醋酸洋紅染色的花粉可育率較低且與自交結(jié)實(shí)率一致，可能是FAA固定液對(duì)樣品的高保真固定不利于開(kāi)花期小孢子細(xì)胞內(nèi)容物釋放，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)反差較小，細(xì)胞圖像清晰度較低，凡不能看清細(xì)胞核特征的花粉粒均被計(jì)為不育花粉，導(dǎo)致可育花粉計(jì)數(shù)偏低所致。