孫曉紅， 李萍， 景潔， 高潔， 楊振， 沈詠梅， 張修月， 岳碧松， 孟楊， 4*

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610065； 2. 西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，重慶402460；3. 藥用美洲大蠊四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610031； 4. 四川大學(xué)自然博物館，成都610065)

胸腺素最初是由Goldstein等(1966)發(fā)現(xiàn)并命名的一種促淋巴細(xì)胞生成因子，其序列在進(jìn)化過程中高度保守(劉羽佳，李集臨，2010)。根據(jù)等電點(diǎn)的不同，可以將胸腺素分為3類：α、β和γ。在β族胸腺素中Tβ4被研究得最多，其含有一個(gè)功能域，具有促進(jìn)傷口愈合(Huffetal.，2001)、促毛發(fā)生長(zhǎng)(Philpetal.，2004)、加速組織和器官再生(Chaetal.，2010)、增強(qiáng)免疫(Saeleeetal.，2013)等功能。而昆蟲胸腺素通常具有多個(gè)功能域，能賦予它們更復(fù)雜的功能(Hertzogetal.，2002；Irobietal.，2014)。例如黑腹果蠅Drosophilamelanogaster胸腺素Ciboulot能與體內(nèi)的G-actin偶聯(lián)而發(fā)揮作用(Boquetetal.，2000；Troysetal.，2007)，白蟻Hodotermopsissjostedti胸腺素參與腦部神經(jīng)發(fā)育(Koshikawaetal.，2005)，棉鈴蟲Helicoverpaarmigera胸腺素可能參與機(jī)體的免疫反應(yīng)和變態(tài)發(fā)育(Zhangetal.，2011)，家蠶Bombyxmori胸腺素可顯著提高被BmNPV病毒感染細(xì)胞的存活率(周鑫鑫等，2018)。

美洲大蠊Periplanetaamericana屬昆蟲綱Inseeta蜚蠊目Blattaria蜚蠊科Blattaria，又稱蟑螂，原產(chǎn)于非洲北部，現(xiàn)為分布廣泛的世界性衛(wèi)生害蟲，也是一種重要的藥用昆蟲。目前，美洲大蠊研究主要集中在藥用價(jià)值、化學(xué)成分分析等方面(郭昕等，2018)。研究表明，美洲大蠊有抗菌、抗病毒、消腫止痛、促進(jìn)傷口愈合和抗腫瘤等功效，由其制成的康復(fù)新液、心脈隆等藥物已在臨床上廣泛應(yīng)用(劉玉媛，2006；肖小芹等，2007；高潔等，2018)。但美洲大蠊中的有效藥用成分并未得到確定，很大程度上阻礙了其在醫(yī)藥領(lǐng)域的進(jìn)一步開發(fā)和利用。晉家正等(2018)采用生物信息學(xué)的方法在基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋得到美洲大蠊胸腺素3個(gè)剪接體THY1(MK573540)、THY2(MK573541)和THY3(MK573542)，其中，THY3序列最長(zhǎng)(621 bp)，含有5個(gè)外顯子，而THY1(507 bp)、THY2(393 bp)分別含有4個(gè)、3個(gè)外顯子。本研究采用real-time PCR(qPCR)技術(shù)對(duì)美洲大蠊不同性別、不同齡期及雌性成蟲不同組織中THY3表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)分析，為進(jìn)一步研究美洲大蠊胸腺素的功能奠定基礎(chǔ)和今后的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源及制備

美洲大蠊樣品均由好醫(yī)生藥業(yè)集團(tuán)有限公司西昌養(yǎng)殖基地提供，選擇同一批次生長(zhǎng)狀況良好的成蟲、新羽化成蟲、8齡若蟲雌雄各5只，3齡若蟲(不分雌雄)5只，卵莢10顆為1組，共5組；活蟲經(jīng)消毒清洗后去除腸道和翅，立即放入液氮中速凍研磨，提取總RNA，-80 ℃保存待用。為了避免美洲大蠊雌雄差異對(duì)胸腺素表達(dá)模式結(jié)果的影響，本實(shí)驗(yàn)中體壁、脂肪體、頭部、血淋巴、肌肉5種組織均取自美洲大蠊雌性成蟲。血淋巴的收集是從蟲體脛節(jié)處將足剪去，擠壓后用移液槍吸取20 μL血淋巴打入細(xì)胞裂解液中，樣品根據(jù)成都福際公司總RNA提取試劑盒說明書提取RNA。

1.2 大腸桿菌Escherichia coli刺激美洲大蠊蟲體

選擇生長(zhǎng)狀況良好、大小相近、羽化1周的雌性美洲大蠊成蟲150只，隨機(jī)分為空白組、大腸桿菌誘導(dǎo)組及磷酸鹽緩沖液(PBS)對(duì)照組，各50只，常規(guī)方法飼養(yǎng)。誘導(dǎo)組體腔注射大腸桿菌菌液10 μL(1×105個(gè)細(xì)菌)，對(duì)照組腹部注射10 μL 1×PBS，空白組不做處理。在空白組中隨機(jī)取5只美洲大蠊收集血淋巴和脂肪體，提取RNA。誘導(dǎo)組、對(duì)照組的美洲大蠊集體給CO25 min使之昏迷，然后注射大腸桿菌菌液和PBS，飼養(yǎng)3 h、6 h、12 h、18 h和24 h后，各組隨機(jī)取出5只美洲大蠊收集血淋巴和脂肪體，提取RNA。

1.3 總RNA的提取及cDNA第1鏈的合成

從美洲大蠊活體中收集血淋巴、脂肪體并立即放入到細(xì)胞裂解液中，充分震蕩、裂解。其他美洲大蠊蟲體及組織樣品在液氮中快速研磨，取適量粉末放入細(xì)胞裂解液中震蕩混勻，提取總RNA。取1 μL RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)量檢測(cè)，用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度。

以上述提取的RNA為模板，根據(jù)諾唯贊生物公司去DNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的方法合成cDNA。

1.4 qPCR分析胸腺素THY3的表達(dá)

根據(jù)美洲大蠊胸腺素THY3的特異序列，用Primer Premier 5設(shè)計(jì)特異性引物，以β-actin作為內(nèi)參基因。THY3F：5’-CGAGCTTATTCAAGGTGTC-3’，THY3R：5’-TCAATGGCTTCTGGGTCTG-3’，β-actin F：5’-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，β-actin R：5’-GCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3’。引物合成和產(chǎn)物測(cè)序均由擎科生物公司完成。qPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；40個(gè)循環(huán)：94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s。結(jié)果采用2-△△Ct法計(jì)算THY3的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

以上各組數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7中的單因素方差分析進(jìn)行差異比較。

2 結(jié)果

2.1 THY3在美洲大蠊不同性別、不同發(fā)育階段的表達(dá)差異

采用qPCR檢測(cè)THY3在美洲大蠊不同性別、不同蟲期的表達(dá)模式，結(jié)果表明，THY3在成蟲、若蟲及卵期都有表達(dá)，成蟲表達(dá)量顯著高于若蟲，雌蟲表達(dá)量顯著高于雄蟲(P<0.05)，且新羽化雌性成蟲的表達(dá)量最高(圖1)。

圖1 不同性別、不同齡期美洲大蠊中THY3的表達(dá)差異Fig. 1 Different expression of THY3 in Periplaneta americanaof different sexes and ages

不同字母表示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； 下同

Different letters indicate there is a significant difference between groups (P<0.05)； the same below

2.2 THY3在美洲大蠊不同組織中的表達(dá)差異

采用qPCR法檢測(cè)雌性美洲大蠊成蟲血淋巴、脂肪體、頭部、肌肉和體壁5種組織中THY3的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：THY3在脂肪體中的表達(dá)量最高，其次是血淋巴，均極顯著高于其他組織(P<0.01)，而在頭部、體壁和肌肉中的表達(dá)量極低(圖2)。

圖2 美洲大蠊不同組織中THY3的表達(dá)差異Fig. 2 Different expression of THY3 in different tissuesof Periplaneta americana

2.3 大腸桿菌刺激對(duì)THY3表達(dá)的影響

采用在雌性成蟲體腔注射大腸桿菌的方法，檢測(cè)血淋巴和脂肪體中胸腺素THY3的表達(dá)，結(jié)果表明，注射3 h后即可檢測(cè)到血淋巴中THY3表達(dá)量明顯升高，6 h達(dá)到最高，隨后下降，24 h后與對(duì)照組和空白組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即恢復(fù)到正常水平(圖3：A)。而注射12 h后脂肪體中THY3的表達(dá)水平明顯升高，隨后下降，24 h恢復(fù)正常水平(圖3：B)。對(duì)照組THY3表達(dá)水平與空白組之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

羽化是昆蟲變態(tài)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，此時(shí)蟲體的退化組織細(xì)胞正發(fā)生高水平的自噬及凋亡(史艷霞等，2009)。而Freeman等(2011)早期研究證明，胸腺素可以調(diào)控與抗氧化有關(guān)的酶來降低體內(nèi)活性氧簇，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的細(xì)胞凋亡反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，THY3表達(dá)量在新羽化成蟲中最高，且顯著高于8齡若蟲，在羽化1周的成蟲中又明顯下降，推測(cè)胸腺素在羽化期的高表達(dá)可能參與細(xì)胞凋亡，或加快清除和降解退化的組織。在棉鈴蟲的研究中發(fā)現(xiàn)，用20-羥基蛻皮激素刺激機(jī)體1 h后，胸腺素基因HaTHY1的表達(dá)顯著上調(diào)，并且羽化期的HaTHY1和HaTHY2都高表達(dá)(Zhangetal.，2011)，相似研究成果在合浦珠母貝Pinctadafucata中也得到驗(yàn)證，Pfthymosin β4在變態(tài)期的相對(duì)表達(dá)量最高(何文耀等，2018)。說明THY3很可能也促進(jìn)美洲大蠊的變態(tài)發(fā)育。結(jié)果還顯示，雌蟲中THY3的表達(dá)水平高于雄蟲，尤其羽化1周的成蟲雌雄表達(dá)差異顯著，美洲大蠊經(jīng)過羽化變?yōu)槌上x，生殖器官成熟，由此推測(cè)THY3可能參與雌性美洲大蠊生殖器官的發(fā)育。早期有報(bào)道胸腺素與無脊椎動(dòng)物的生殖相關(guān)，線蟲Caenorhgbditiselegans體內(nèi)由于Tetrathymosin基因突變，使卵缺乏肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)而喪失生殖能力(康志瓊等，2015)。

*P<0.05， **P<0.01

胸腺素在脊椎動(dòng)物體內(nèi)是一種重要的抗菌肽(Irobietal.，2014)和抗炎劑(Girardietal.，2003)，研究表明，人胸腺素β4可以減少傷口部位炎癥因子的產(chǎn)生，促進(jìn)膠原纖維的形成(趙雙，2012)，也可增強(qiáng)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的免疫活性(何娟娟，馬列婷，2012)。本研究顯示，THY3在美洲大蠊血淋巴和脂肪體中高表達(dá)，且顯著高于其他組織。而脂肪體和血細(xì)胞是昆蟲重要的免疫場(chǎng)所(Lemaitre & Hoffmann，2007)，因此，推測(cè)美洲大蠊胸腺素可能參與其自身免疫反應(yīng)。在美洲大蠊體內(nèi)注射大腸桿菌后發(fā)現(xiàn)，THY3表達(dá)量在血淋巴中變化比較明顯，刺激后3～12 h維持較高水平，并且在6 h達(dá)到最高，而脂肪體中THY3的表達(dá)水平在12 h后才顯著升高，說明美洲大蠊與合浦珠母貝類似，機(jī)體發(fā)揮免疫功能主要依賴血細(xì)胞。血淋巴介導(dǎo)完成的免疫反應(yīng)主要為吞噬作用、成瘤作用及包囊作用，而脂肪體的免疫反應(yīng)主要依賴于解毒作用及合成一些抗菌肽并釋放到血液中發(fā)揮作用(耿華等，2004；史艷霞等，2009；初源等，2013)。胸腺素也是一類抗菌肽物質(zhì)，因此，菌液刺激后THY3可能主要通過血淋巴參與免疫反應(yīng)，之后脂肪體迅速合成THY3等抗菌肽物質(zhì)來阻斷病菌的繼續(xù)侵染，并參與解毒作用來保證昆蟲體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。與其類似的還有中華絨螯蟹Eriocheirsinensis受細(xì)菌刺激3 h后，EsTRP1在血淋巴中高表達(dá)，24 h后EsTRP2在血淋巴中的表達(dá)顯著上升(Gaietal.，2009)；同樣，日本囊對(duì)蝦Marsupenaeusjaponicas受細(xì)菌刺激后，血細(xì)胞中Mjthymosin3的表達(dá)水平明顯上調(diào)(Fengetal.，2018)；棉鈴蟲受細(xì)菌刺激3 h后，脂肪體中HaTHY1和HaTHY2的表達(dá)水平也明顯上調(diào)(Zhangetal.，2011)。細(xì)菌刺激后胸腺素表達(dá)量上調(diào)的行為可能是蟲體受到細(xì)菌等異物刺激后做出的免疫應(yīng)答反應(yīng)，以增強(qiáng)機(jī)體的免疫防衛(wèi)，這進(jìn)一步證實(shí)了胸腺素THY3參與機(jī)體的免疫反應(yīng)，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。