紀(jì) 漫，孫培冬

(江南大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

活性脂質(zhì)是甾醇、萜類(lèi)、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺等具有生物活性的脂溶性物質(zhì)。植物甾醇被科研工作者稱(chēng)為“Key to life”，具有降膽固醇、修復(fù)組織、抗炎等作用[1-2]。神經(jīng)酰胺是近年來(lái)新興的功能食品、藥品和化妝品中的活性成分，具有保濕、屏障、抗衰老和抗過(guò)敏等作用[3-4]。由于神經(jīng)酰胺在動(dòng)植物中含量較少，尋求富含神經(jīng)酰胺的生物材料已經(jīng)成為神經(jīng)酰胺開(kāi)發(fā)與研究的熱點(diǎn)。

龍眼(DimocarpuslonganLour.)俗名桂圓，是無(wú)患子科植物龍眼的果實(shí)，我國(guó)南方著名的藥食兩用水果[5]。在現(xiàn)代食品工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，人們習(xí)慣留取龍眼肉而將龍眼核作為廢料遺棄。中藥理論認(rèn)為[6]，龍眼核具有理氣、化濕、止血等功效，用于治療濕瘡、疝氣、創(chuàng)傷出血等。最近研究表明，龍眼核提取物中含有大量的生物活性物質(zhì)，如多糖、類(lèi)黃酮、植物甾醇和鞘磷脂等，具有降血糖、抗氧化、抗炎和抗衰老等活性[7-9]。人們對(duì)龍眼核中活性物質(zhì)的研究主要集中在多糖和多酚等水溶性物質(zhì)，對(duì)龍眼核中活性脂質(zhì)的研究較少。

本文結(jié)合植物甾醇和神經(jīng)酰胺相似的極性等物理性質(zhì)，在前期分離純化過(guò)程中，以植物甾醇含量為主要指標(biāo)，監(jiān)測(cè)神經(jīng)酰胺的富集相，定性定量地檢測(cè)神經(jīng)酰胺類(lèi)物質(zhì)。采用CCK-8法研究龍眼核活性脂質(zhì)對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞(HSF)和人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT)活性的影響，為龍眼核活性脂質(zhì)作為功效性原料添加到日用化學(xué)品中提供了可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

龍眼核，原產(chǎn)地廣西玉林，購(gòu)于匯豐藥材商行；豆甾醇(純度>95%)，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；C16神經(jīng)酰胺(C16-CER)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，購(gòu)自Sigma公司；N-油?；?植物鞘氨醇(商品級(jí)CER-3)，購(gòu)自上海言臻貿(mào)易有限公司；HSF、HaCaT細(xì)胞，購(gòu)自北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、pH 7.4磷酸鹽緩沖(PBS)溶液、0.25%胰酶、青霉素-鏈霉素雙抗、購(gòu)自Thermo-Fisher公司；胎牛血清，購(gòu)自Gibco公司；CCK-8試劑盒(500T)，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，KH-100E型超聲波清洗器，TU-1901紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)，NICOLEY-6700型全反射傅里葉紅外光譜儀，Ultimate 3000 RS型超高效液相層析儀，Wonda Cract ODS-2分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，LyoQuest Plus-85型冷凍干燥機(jī)，F(xiàn)orma3111二氧化碳培養(yǎng)箱，Synergy H4多功能酶標(biāo)儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 超聲提取龍眼核脂質(zhì)粗提物

準(zhǔn)確稱(chēng)取龍眼核粉120 g于2 000 mL錐形瓶中，以95%乙醇為提取溶劑，在料液比1∶ 15、提取溫度60℃下超聲輔助提取40 min。反應(yīng)結(jié)束后，抽濾得濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸至恒重，冷凍干燥得龍眼核脂質(zhì)粗提物(LNE)。按式(1)計(jì)算得率。

得率=粗提物質(zhì)量/龍眼核粉質(zhì)量×100%

(1)

1.2.2 分級(jí)萃取

準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0 g LNE加入20 mL水超聲分散，置于分液漏斗中，依次用石油醚、正己烷、氯仿、正丁醇進(jìn)行萃取，料液比為1∶ 10，萃取3次，合并相同溶劑萃取相，減壓濃縮后冷凍干燥得石油醚相(PEP)、正己烷相(HEP)、氯仿相(CEP)、正丁醇相(BEP)。

1.2.3 柱層析分離

采用濕法裝柱，將已經(jīng)用石油醚浸泡超聲30 min的100 g硅膠(200～300目)裝入層析柱(26 mm×500 mm)中，準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g CEP干法上樣后進(jìn)行硅膠柱層析。洗脫劑梯度依次為體積比分別為9∶ 1、7∶ 3、5∶ 5、3∶ 7、1∶ 9的石油醚-乙酸乙酯，分別洗脫200 mL，順序收集洗脫液，得到5個(gè)組分CEP-1～CEP-5。將各組分減壓濃縮，冷凍干燥后測(cè)定得率和總甾醇含量。

1.2.4 總甾醇含量測(cè)定

采用Lieberman-Burchard法測(cè)定樣品中總甾醇含量[10]。以CHCl3為溶劑，配制1.0 mg/mL豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入濃硫酸-乙酸酐(體積比1∶ 20)顯色劑2.0 mL，用CHCl3定容至5 mL。搖勻、超聲顯色10 min，以CHCl3為參比溶液，在710 nm處測(cè)量吸光值，試驗(yàn)重復(fù)3次。以豆甾醇質(zhì)量為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為y=1.367 1x+0.000 7，R2=0.999 7，在0.2～1.0 mg的范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

配制一定質(zhì)量濃度的樣品，按上述方法測(cè)定樣品的吸光值。樣品中總甾醇含量按式(2)計(jì)算。

樣品中總甾醇含量=樣品中豆甾醇的質(zhì)量×稀釋倍數(shù)/樣品質(zhì)量

(2)

1.2.5 FT-IR分析

取少量冷凍干燥后的樣品，使其將傅里葉紅外光譜儀的激光探頭完全覆蓋，壓緊旋鈕，進(jìn)行測(cè)試。儀器工作條件為：分辨率2 cm-1，樣品平均掃描100次，掃描范圍4 000～500 cm-1。

神經(jīng)酰胺含量的測(cè)定參照HPLC-ELSD分析方法[11]。層析柱為Wonda Cract ODS-2分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為超純水，流動(dòng)相B為甲醇，先線(xiàn)性洗脫20 min，從97%B到100%B，再等度洗脫10 min，洗脫劑為100%B，然后進(jìn)行平衡過(guò)程，溶劑為97%B；流速0.8 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量5 μL；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器漂移管溫度65℃；氣體流速1.5 mL/min。

配制質(zhì)量濃度分別為0.6、0.3、0.15、0.075、0.037 5 mg/mL的系列C16-CER標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣量均為5 μL，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制。取C16-CER質(zhì)量M的對(duì)數(shù)(lgM)為橫坐標(biāo)，峰面積S的對(duì)數(shù)(lgS)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。配制10.0 mg/mL的CEP-1、CEP-2、CEP-5溶液，進(jìn)樣量均為5 μL，進(jìn)行HPLC-ELSD分析。

根據(jù)HPLC-ELSD分析結(jié)果，C16-CER和豆甾醇的保留時(shí)間分別為17.96 min和26.82 min。C16-CER標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性回歸方程為lgS=1.607 4 lgM+1.489 6，R2=0.996 9。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.81%，在試驗(yàn)范圍0.18～3 μg內(nèi)呈良好線(xiàn)性關(guān)系。

1.2.7 龍眼核活性脂質(zhì)成分鑒別

采用理化鑒別方法[12-13]，初步鑒別LNE、CEP、CEP-2中的有效成分，如：神經(jīng)酰胺類(lèi)、三萜類(lèi)、生物堿類(lèi)、皂苷類(lèi)、鞣質(zhì)及酚類(lèi)、黃酮類(lèi)和有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)。其中薄層色譜[14]以氯仿-甲醇(體積比19∶ 1)為展開(kāi)劑，10%磷酸-硫酸銅為顯色劑，120℃烤板10 min進(jìn)行顯色反應(yīng)。

1.2.8 細(xì)胞培養(yǎng)及CCK-8測(cè)定

配制含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基，將HSF和HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞生長(zhǎng)到90%融合時(shí)，加入0.25%胰酶消化傳代。

參照劉艷秋等[15]的方法，采用CCK-8法評(píng)估LNE、CEP、CEP-2的細(xì)胞毒性。取10～30代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSF和HaCaT細(xì)胞，分別以7.5×103、10×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板，每孔100 μL(空白組除外)，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，移去孔中培養(yǎng)液。以DMEM為溶劑，配制成不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，每孔加入100 μL樣品溶液處理24 h，以100 μL DMEM代替樣品作為對(duì)照，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。移去孔中培養(yǎng)液，用PBS沖洗兩遍，每孔加入100 μL 10% CCK-8溶液，并向不含細(xì)胞的孔中加入100 μL 10% CCK-8溶液作為空白，于培養(yǎng)箱中避光孵育1 h。孵育結(jié)束后，用酶標(biāo)儀測(cè)定其在450 nm處的OD值。細(xì)胞存活率按式(3)計(jì)算。

她的堂妹妹，我見(jiàn)過(guò)，永久是穿著深色的衣裳，黑黑的臉，一天到晚陪著母親坐在屋子里。母親洗衣裳；她也洗衣裳，母親哭，她也哭。也許她幫著母親哭她死去的父親，也許哭的是她們的家窮。那別人就不曉得了。

細(xì)胞存活率=(OD樣品-OD空白)/(OD對(duì)照-OD空白)×100%

(3)

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取相得率及總甾醇含量

采用超聲輔助乙醇提取法從龍眼核粉中提取活性脂質(zhì)，粗提物得率為10.86%，總甾醇含量為5.28 mg/g。

各萃取相的得率及總甾醇含量如表1所示。

表1 不同萃取相得率及總甾醇含量

由表1可知，氯仿相得率最大，為34.62%，但是植物甾醇主要富集在正己烷相和氯仿相，這兩相的總甾醇含量分別為216.42 mg/g和191.95 mg/g。綜合考慮各萃取相的得率和總甾醇含量，選擇氯仿相進(jìn)行硅膠柱層析分離。

2.2 硅膠柱層析分離各組分總甾醇含量

CEP經(jīng)硅膠柱層析分離后得5個(gè)組分，各組分得率及總甾醇含量見(jiàn)表2。

表2 硅膠柱層析分離組分得率及總甾醇含量

由表2可知，甾醇主要集中在組分CEP-2中，含量為518.26 mg/g，其次甾醇含量較高的組分為CEP-1，甾醇含量最少的組分為CEP-5。因此對(duì)這3個(gè)組分進(jìn)行HPLC-ELSD檢測(cè)，以驗(yàn)證甾醇含量與神經(jīng)酰胺含量之間的關(guān)系。

2.3 FT-IR分析

CEP-2的FT-IR分析結(jié)果如圖1所示。

圖1 CEP-2的FT-IR圖譜

2.4 HPLC-ELSD分析

CEP-1、CEP-2和CEP-5的HPLC-ELSD圖譜如圖2所示。

由圖2可知：CEP-1在豆甾醇保留時(shí)間27 min左右僅有一個(gè)較小的峰出現(xiàn)，但在神經(jīng)酰胺的保留時(shí)間18 min左右并沒(méi)有出現(xiàn)峰；CEP-5中未檢出神經(jīng)酰胺和甾醇類(lèi)物質(zhì)；CEP-2在27 min附近出現(xiàn)了一個(gè)平頭峰，表明CEP-2中甾醇含量較高，同時(shí)在18 min左右出現(xiàn)了一個(gè)小峰，表明CEP-2中含神經(jīng)酰胺類(lèi)物質(zhì)。由TLC分析結(jié)果可知，C16-CER和豆甾醇的比移值分別為0.482、0.727；將這3個(gè)物質(zhì)進(jìn)行TLC定性分析，CEP-1僅在比移值0.482處出現(xiàn)了顏色較淺的點(diǎn)，CEP-5在比移值0.482和0.727處均未出現(xiàn)點(diǎn)，CEP-2在比移值0.482和0.727處均出現(xiàn)了點(diǎn)。綜合HPLC-ELSD和TLC分析結(jié)果可知，以上3種物質(zhì)，CEP-2中植物甾醇含量最高，神經(jīng)酰胺含量也最高。根據(jù)C16-CER標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)所得的線(xiàn)性方程，得CEP-2中神經(jīng)酰胺的含量為2.65 mg/g。

圖2 CEP-1、CEP-2、CEP-5的HPLC-ELSD圖譜

2.5 龍眼核活性成分檢識(shí)

為了進(jìn)一步定性地驗(yàn)證龍眼核提取純化各組分的活性成分，對(duì)LNE、CEP、CEP-2中的活性成分進(jìn)行鑒別，結(jié)果如表3所示。

表3 龍眼核活性成分鑒別結(jié)果

注：檢識(shí)結(jié)果中“+”表示有現(xiàn)象，“-”表示無(wú)明顯現(xiàn)象。

由表3可知:LNE和CEP中所含的物質(zhì)類(lèi)似，含有三萜類(lèi)、生物堿類(lèi)、皂苷類(lèi)、鞣質(zhì)及酚類(lèi)、黃酮類(lèi)和有機(jī)酸類(lèi)，但由于氯仿的極性比乙醇小，所以經(jīng)過(guò)氯仿萃取后，除去了親水性的生物堿類(lèi)及苷類(lèi)；CEP-2中含三萜類(lèi)、神經(jīng)酰胺類(lèi)、鞣質(zhì)及酚類(lèi)物質(zhì)。LNE和CEP通過(guò)TLC定性分析，未檢測(cè)出神經(jīng)酰胺類(lèi)物質(zhì)，而CEP-2中檢測(cè)出神經(jīng)酰胺類(lèi)物質(zhì)，說(shuō)明龍眼核脂質(zhì)粗提物中神經(jīng)酰胺類(lèi)物質(zhì)的含量較低，通過(guò)硅膠柱層析，富集了活性脂質(zhì)中的神經(jīng)酰胺類(lèi)物質(zhì)。

2.6 CCK-8細(xì)胞增殖活性

為確保樣品的安全性，采用CCK-8法測(cè)定不同質(zhì)量濃度LNE、CEP、CEP-2及商品級(jí)CER-3對(duì)HSF和HaCaT細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果分別見(jiàn)圖3、圖4。以?xún)H含DMEM的培養(yǎng)基作為對(duì)照組，細(xì)胞的活力設(shè)定為100%。

圖3和圖4中*代表采用ANOVA-Tukey相關(guān)性分析計(jì)算出的p值(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。

圖3 不同樣品處理的HSF細(xì)胞活力評(píng)估

由圖3A可知，當(dāng)樣品的質(zhì)量濃度為125 μg/mL時(shí)，LNE處理的HSF細(xì)胞的存活率為85.27%(p<0.01)，CEP處理的HSF細(xì)胞存活率為89.35%(p<0.01)。由圖3B可知，CEP-2在試驗(yàn)范圍20～100 μg/mL內(nèi)，對(duì)HSF細(xì)胞均沒(méi)有毒副作用，存活率均大于93%。說(shuō)明隨著樣品中植物甾醇和神經(jīng)酰胺的富集，相同質(zhì)量濃度的樣品處理的HSF細(xì)胞存活率增加。當(dāng)CER-3質(zhì)量濃度為40 μg/mL，HSF細(xì)胞的存活率為112.26%(p<0.01)，說(shuō)明神經(jīng)酰胺能促進(jìn)HSF細(xì)胞增殖；40 μg/mL的CEP-2處理的HSF細(xì)胞的存活率為105.28%，推測(cè)原因是CEP-2中神經(jīng)酰胺的種類(lèi)和含量與CER-3不同，對(duì)HSF細(xì)胞的增殖作用不明顯。

由圖4A可知，LNE對(duì)HaCaT細(xì)胞無(wú)增殖活性，而CEP質(zhì)量濃度為60 μg/mL時(shí)，對(duì)HaCaT細(xì)胞具有輕微的增殖作用，細(xì)胞存活率為105.09%。由圖4B可知，CEP-2在試驗(yàn)范圍20～200 μg/mL內(nèi)，對(duì)HaCaT細(xì)胞均沒(méi)有毒副作用，細(xì)胞存活率均大于95.29%，且當(dāng)CEP-2質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，HaCaT細(xì)胞的存活率最大，為114.21%(p<0.001)。說(shuō)明分離純化后的活性脂質(zhì)有助于HaCaT細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。80 μg/mL的CER-3處理的HaCaT細(xì)胞，細(xì)胞存活率為116.67%；純化后的活性脂質(zhì)CEP-2與商品級(jí)CER-3對(duì)HaCaT細(xì)胞的增殖作用相當(dāng)。

3 結(jié) 論

通過(guò)超聲輔助乙醇提取法得到龍眼核脂質(zhì)粗提物，經(jīng)氯仿萃取和硅膠柱層析分離得到活性脂質(zhì)CEP-2，其主要成分為三萜類(lèi)、神經(jīng)酰胺類(lèi)、鞣質(zhì)及酚類(lèi)物質(zhì)，總甾醇含量為518.26 mg/g，神經(jīng)酰胺含量為2.65 mg/g。根據(jù)CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)可知，40 μg/mL CEP-2對(duì)HSF細(xì)胞具有輕微的增殖作用，細(xì)胞存活率為105.28%；100 μg/mL CEP-2對(duì)HaCaT細(xì)胞的增殖作用較明顯，細(xì)胞存活率為114.21%(p<0.001)，且其與商品級(jí)CER-3對(duì)HaCaT細(xì)胞的增殖活性相當(dāng)。本文定性定量地檢測(cè)龍眼核中的神經(jīng)酰胺，為龍眼核作為制備神經(jīng)酰胺的原料提供了研究方向，也為神經(jīng)酰胺的分離鑒定提供了一種簡(jiǎn)單、安全有效的方法；同時(shí)表明龍眼核活性脂質(zhì)有望作為功效性成分添加于日用化學(xué)品中。