彭媛媛，武煊，陶曉奇

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(國(guó)家級(jí)食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(西南大學(xué))，重慶，400715)3(重慶市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，重慶，401120)

肉類(lèi)食品富含大量的營(yíng)養(yǎng)成分，是人們?nèi)粘ｏ嬍硺?gòu)架中的重要組成部分。近年來(lái)，隨著市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展和人們生活水平的提高，消費(fèi)者對(duì)各種肉類(lèi)的需求在不斷上漲[1]。目前市面上可食用肉類(lèi)品種繁多，但由于供需量不同，不同品種間價(jià)格差異大，進(jìn)而誘使不法商販在肉類(lèi)及其制品中摻雜使假、以次充好而牟取暴利，這樣的事件屢屢出現(xiàn)。肉類(lèi)摻假涉及到食品安全及其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等問(wèn)題，同時(shí)也擾亂了市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)秩序，更直接影響了消費(fèi)者的健康，尤其是那些對(duì)部分食物過(guò)敏的消費(fèi)者[2]。此外，由于伊斯蘭教禁食豬肉，在清真食品中摻雜豬肉更涉及宗教信仰方面的問(wèn)題[3]。而肉類(lèi)制品通常經(jīng)過(guò)加工處理后，以依靠感官與經(jīng)驗(yàn)的傳統(tǒng)的肉類(lèi)形態(tài)學(xué)為主的鑒別手段已無(wú)法準(zhǔn)確鑒別其品質(zhì)。因此，建立快速準(zhǔn)確的肉類(lèi)鑒別檢測(cè)方法是十分必要的。

近年來(lái)，肉類(lèi)鑒別檢測(cè)主要是在蛋白質(zhì)與核酸水平進(jìn)行，常用檢測(cè)技術(shù)包括物理技術(shù)、化學(xué)技術(shù)、電泳技術(shù)、DNA鑒定技術(shù)以及免疫學(xué)技術(shù)等[4]。基于蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法對(duì)儀器、試劑和樣品處理要求高，存在復(fù)雜、昂貴、費(fèi)時(shí)且缺乏特異性等問(wèn)題。而經(jīng)熱處理后蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生變性，其特定表位改變，故基于蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法往往不適用于經(jīng)熱加工處理的肉制品，而適用于對(duì)新鮮肉類(lèi)的檢測(cè)[5]。而因肉制品中蛋白質(zhì)含量多樣化及其干擾因素多變性，導(dǎo)致該鑒定方法的應(yīng)用存在局限性，而基于DNA的檢測(cè)方法更具優(yōu)勢(shì)，DNA測(cè)序能鑒定出物種所具有的獨(dú)特DNA序列，即使是未知樣品也能通過(guò)比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)已知的物種信息得到樣品的種類(lèi)[4]。在DNA水平進(jìn)行的檢測(cè)方法包括：DNA探針雜交和以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為基礎(chǔ)的基因檢測(cè)技術(shù)[6]。PCR檢測(cè)技術(shù)相比于其他檢測(cè)手段更為準(zhǔn)確，且靈敏度更高。

但常規(guī)的PCR技術(shù)雖能定性檢測(cè)不同品種的混合肉類(lèi)，但卻不能實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的定量分析。實(shí)時(shí)熒光PCR(Real-Time PCR)定量檢測(cè)是指向反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱變化，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)特異性產(chǎn)物的量，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)目的基因進(jìn)行定量分析的過(guò)程[7]。而Real-Time PCR作為一種以PCR為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)，在實(shí)現(xiàn)定性定量分析的同時(shí)，與常規(guī)PCR相比自動(dòng)化程度更高、動(dòng)態(tài)范圍更高、特異性更強(qiáng)，并能有效解決PCR污染問(wèn)題。目前，此項(xiàng)技術(shù)已應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域，在肉類(lèi)摻假檢測(cè)方面的研究及應(yīng)用也較為成熟。因此，本文梳理了近幾年Real-Time PCR技術(shù)檢測(cè)肉類(lèi)摻雜的研究，旨在為完善食品摻假檢測(cè)體系提供有益參考。

1 Real-Time PCR檢測(cè)肉類(lèi)摻假

1.1 Real-Time PCR檢測(cè)流程

PCR技術(shù)是指在體外酶促合成特異性DNA片段的一種方法，Real-Time PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上加入熒光染料或標(biāo)記探針，根據(jù)熒光信號(hào)的累積對(duì)反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，以實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的精確定量[7]。圖1反映了Real-Time PCR技術(shù)基本操作流程，根據(jù)反應(yīng)中熒光信號(hào)的變化可繪制如圖1-A所示的擴(kuò)增曲線(xiàn)，利用閾值循環(huán)數(shù)(Ct)值和起始拷貝數(shù)可建立如圖1-B所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[8]，通過(guò)兩者的對(duì)應(yīng)關(guān)系可推斷待測(cè)模板起始含量。

圖1 Real-Time PCR技術(shù)基本操作流程[4,9]

Fig.1 Real-Time PCR technology basic operation flow

1.2 鑒定肉類(lèi)品種基因的選擇

Real-Time PCR技術(shù)應(yīng)用于肉類(lèi)摻假檢測(cè)領(lǐng)域的關(guān)鍵步驟是根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)選擇合適的熒光報(bào)告基因并設(shè)計(jì)特異性引物，基于熒光探針?lè)ǖ腞eal-Time PCR技術(shù)，還需要設(shè)計(jì)并優(yōu)化探針序列。表1整合了部分常見(jiàn)肉類(lèi)品種的引物和探針序列，肉類(lèi)鑒別中的熒光報(bào)告基因往往需要有較強(qiáng)的特異性，主要包括線(xiàn)粒體基因組DNA、細(xì)胞基因組中重復(fù)序列和單拷貝序列。線(xiàn)粒體基因組DNA經(jīng)母體遺傳，其種屬特異性較強(qiáng)，是常用的靶基因，通常不會(huì)出現(xiàn)由多個(gè)等位基因所致的序列歧義情況[10]。線(xiàn)粒體基因組DNA包括：線(xiàn)粒體12S rRNA[11]、16S rRNA[12]、細(xì)胞色素b (Cyt b)[13]以及細(xì)胞色素C氧化酶I(COI)[14]等基因。但由于不同組織部位的線(xiàn)粒體DNA含量不一致，定量結(jié)果易出現(xiàn)偏差。為使得檢測(cè)結(jié)果更可靠，含量更穩(wěn)定的細(xì)胞基因組也開(kāi)始作為肉類(lèi)鑒別的靶基因，包括衛(wèi)星DNA、白細(xì)胞介素2前體基因以及生長(zhǎng)激素基因等[15]。由表1可知，研究人員往往針對(duì)不同檢測(cè)體系設(shè)計(jì)不同的引物和探針，并將其優(yōu)化以得到最佳的反應(yīng)過(guò)程。

表1 Real-Time PCR技術(shù)鑒定常見(jiàn)肉類(lèi)物種的引物及探針序列設(shè)計(jì)

2 Real-Time PCR在肉類(lèi)摻假檢測(cè)的應(yīng)用

2.1 熒光探針?lè)?/h3>

2.1.1 熒光探針?lè)ǖ慕?/p>

2.1.1.1 Taqman熒光探針

Taqman熒光探針?lè)ㄓ址Q(chēng)雜交探針標(biāo)記法，利用了引物及探針與靶基因序列的匹配機(jī)制，具有高特異性、高適應(yīng)性和可靠性的特點(diǎn)。如圖2所示，同時(shí)加入一對(duì)引物和一個(gè)水解核苷酸探針于PCR擴(kuò)增體系，在激光激發(fā)下，可通過(guò)體系內(nèi)的熒光信號(hào)變化來(lái)準(zhǔn)確定量模板[17]。

圖2 Taqman實(shí)時(shí)熒光定量PCR過(guò)程示意圖[1]

Fig.2 The diagrammatic drawing of the process of Taqman real-time PCR[1]

2.1.1.2 分子信標(biāo)

分子信標(biāo)(molecular beacon)是一種呈環(huán)形發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙標(biāo)記寡核苷酸探針[7]。如圖3所示，探針最初呈環(huán)狀關(guān)閉狀態(tài)，PCR擴(kuò)增時(shí)，探針環(huán)狀區(qū)序列與目標(biāo)分子模板特異性結(jié)合，在激光作用下釋放熒光[17]。

圖3 分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)及釋放熒光過(guò)程示意圖[7]

Fig.3 The diagrammatic drawing of molecular beacon structure and the process of releasing fluorescence[7]

2.1.2 熒光探針?lè)ǖ膽?yīng)用

熒光探針?lè)ㄔ谌忸?lèi)摻假檢測(cè)方面應(yīng)用較為廣泛，以前基于熒光探針的Real-Time PCR技術(shù)多用于檢測(cè)單一的目標(biāo)，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，Real-Time PCR檢測(cè)體系日益改善：逐漸優(yōu)化引物及探針的設(shè)計(jì)，利用探針與配體結(jié)合將配體的特性引入檢測(cè)過(guò)程中；逐漸提高檢測(cè)效率，該技術(shù)也逐漸由單重?zé)晒舛繖z測(cè)發(fā)展為多重Real-Time PCR以及液滴PCR的方法。

2.1.2.1 熒光探針?lè)ㄔ趩沃豏eal-Time PCR中的應(yīng)用

Taqman熒光探針?lè)ㄟm用于檢測(cè)擴(kuò)增序列專(zhuān)一的體系，以及樣品中靶基因含量較低的PCR檢測(cè)。ALI等[18]將豬線(xiàn)粒體Cyt b基因作為分析對(duì)象建立Taqman熒光探針，檢測(cè)混合肉中是否含有豬肉，該法檢出限低至0.01%，可用于測(cè)定商業(yè)漢堡中的豬肉摻假。MARTIN等[19]以豬線(xiàn)粒體12S rRNA基因?yàn)榉治鰧?duì)象建立豬肉特異性引物，擴(kuò)增來(lái)自豬肉DNA的411 bp片段，同時(shí)擴(kuò)增來(lái)自哺乳動(dòng)物物種DNA的425～428 bp片段用作內(nèi)源對(duì)照，未顯示其他動(dòng)物DNA的交叉反應(yīng)，該檢測(cè)方法對(duì)豬肉定量檢測(cè)的靈敏度在0.5%～5%。ZHANG等[20]則以牛線(xiàn)粒體Cyt b基因分析對(duì)象建立特異性引物和Taqman探針檢測(cè)熱處理純?nèi)庵信Ｔ葱猿煞值暮?，該法可最低定量檢測(cè)到35 pg的牛DNA，且未顯示與綿羊、山羊或豬DNA的交叉反應(yīng)。但Taqman熒光探針也存在局限性，需要在保守區(qū)域內(nèi)擴(kuò)增熒光探針的引物，并對(duì)保守序列的3個(gè)區(qū)域分別設(shè)計(jì)上下游引物，而找到合適的保守區(qū)域并不相容[21]。且無(wú)論怎么優(yōu)化引物設(shè)計(jì)條件都不能解決靶基因的特異序列較短的狀況，而且如果體系中存在與靶基因同源的序列，則容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增使得定量不準(zhǔn)確。

分子信標(biāo)優(yōu)于Taqman探針之處是能檢測(cè)單個(gè)核苷酸的突變，近年來(lái)，在肉類(lèi)摻假檢測(cè)方面，YUSOP等[22]將豬的Cyt b基因作為分析對(duì)象設(shè)計(jì)引物及分子信標(biāo)探針，建立Real-Time PCR體系用于檢測(cè)生肉混合樣品中豬肉的含量，其他樣品顯示陰性結(jié)果，這證實(shí)了引物的特異性，豬肉的檢出限為0.000 1 ng。MOHAMAD等[23]以豬的染色體DNA和Cyt b基因設(shè)計(jì)引物以及分子信標(biāo)探針，用于定量檢測(cè)由明膠制品中含有的豬源性成分，結(jié)果表明基于染色體DNA和Cyt b基因的檢測(cè)方法可分別檢測(cè)體系中低至1 pg和10 pg的豬DNA。但分子信標(biāo)存在設(shè)計(jì)困難、價(jià)格昂貴的局限性，且既要避免產(chǎn)生強(qiáng)的背景信號(hào)，又要避免其莖部與模板雜交過(guò)強(qiáng)，而致使退火過(guò)程受到影響[24]。可能正是引物分子信標(biāo)具有的特性，致使其在檢測(cè)肉制品中有害微生物方面研究較多，相比之下在肉類(lèi)摻假檢測(cè)方面的應(yīng)用較少。

2.1.2.2 熒光探針在多重Real-Time PCR的應(yīng)用

在Real-Time PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上利用多對(duì)引物測(cè)定，可以在單次PCR反應(yīng)中快速、準(zhǔn)確地同時(shí)識(shí)別多個(gè)肉類(lèi)品種[4]，基于Taqman探針的多重Real-Time PCR技術(shù)在肉類(lèi)鑒定方面的應(yīng)用較為廣泛。IWOBI等[25]以β-肌動(dòng)蛋白基因和肌肉生長(zhǎng)抑制素基因?yàn)榉治鰧?duì)象建立引物和Taqman探針，建立三重Real-Time PCR技術(shù)用于特異性識(shí)別并量化混合肉中牛和豬成分，未顯示其他動(dòng)物DNA的交叉反應(yīng)，定量為0.5%～99.5%，該方法的檢測(cè)限為20個(gè)基因組當(dāng)量。章晶晶等[26]以貉子線(xiàn)粒體D-loop基因和狐貍的線(xiàn)粒體基因?yàn)榉治鰧?duì)象建立引物和探針，并根據(jù)各反應(yīng)體系的Ct值驗(yàn)證引物與探針對(duì)于狐貍和貉子源性成分的特異性，檢測(cè)肉制品中狐貍、貉子源性成分，最低檢測(cè)限分別為0.5 pg/μL和5 pg/μL。相比之下基于分子信標(biāo)的多重Real-Time PCR技術(shù)應(yīng)用于肉類(lèi)摻假領(lǐng)域的研究較少，劉艷艷等[12]以線(xiàn)粒體基因組和16S rRNA基因設(shè)計(jì)引物和分子信標(biāo)探針，建立多重Real-Time PCR體系能同時(shí)區(qū)分阿膠原料中的驢、馬、驢騾和馬騾源性成分，其他樣品顯示陰性結(jié)果，該法特異性強(qiáng)靈敏度高，檢測(cè)限達(dá)到0.01 ng/μL。

近年來(lái)，為使得基于熒光探針的檢測(cè)技術(shù)在肉類(lèi)成分定量分析中的效率更高，出現(xiàn)了在Taqman探針的基礎(chǔ)上結(jié)合配體形成的新型探針，如Taqman-MGB和Taqman-LNA探針。這些與Taqman探針結(jié)合的配體往往具有某些特性，比如Minor Groove Binding (MGB)配體具有能選擇性結(jié)合富含AT堿基的序列特性[27]。近年來(lái)Taqman-MGB探針在多重Real-Time PCR的應(yīng)用較多：ANDREO等[28]將t-Glu和Cyt b基因作為分析對(duì)象設(shè)計(jì)探針，在1%～20%特異性檢測(cè)混合肉中豬、牛以及雞肉的含量，原樣和熱處理樣的最低檢測(cè)限分別為1%和0.32 pg/μL。CHENG等[29]則利用β-肌動(dòng)蛋白基因和生長(zhǎng)因子基因設(shè)計(jì)引物以及Taqman-MGB探針，將鵝、馬、兔、牛、驢、鯽魚(yú)、綿羊和山羊源性物質(zhì)作為對(duì)照顯示為陰性，表明結(jié)果具有特異性，在1%～20%檢測(cè)雞、鴨和豬的成分在混合DNA中所含的量，檢測(cè)限達(dá)到0.15 ng。DRUML等[30]利用偽表皮生長(zhǎng)因子基因建立Taqman-MGB探針，以鑒別混合肉DNA中小鹿、馬鹿以及梅花鹿的含量，該法未顯示肉類(lèi)產(chǎn)品中可能含有的20種動(dòng)物物種和43種植物物種的交叉反應(yīng)，在0.1%～100%，檢測(cè)限達(dá)到0.1%。而新型探針Taqman-LNA在肉類(lèi)摻假方面的應(yīng)用也較為廣泛：XU等[31]將鴨、豬、牛和雞的線(xiàn)粒體DNA序列作為分析對(duì)象，設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan-LNA探針，開(kāi)發(fā)并優(yōu)化了多重Real-Time PCR檢測(cè)體系，通過(guò)鑒定不相關(guān)的(綿羊、馬、鹿、驢、兔、鵝、山羊、蝦、鮭魚(yú)和玉米)線(xiàn)粒體DNA作為物種特異性靶標(biāo)來(lái)驗(yàn)證特異性，檢測(cè)限達(dá)到每個(gè)物種的0.01%。許如蘇等[32]利用線(xiàn)粒體基因組設(shè)計(jì)引物及探針，建立多重Taqman-LNA熒光PCR技術(shù)，同時(shí)檢測(cè)肉制品中豬雞鴨源性成分，與牛、羊、驢、兔、鵝等動(dòng)物源性成分無(wú)交叉反應(yīng)，其檢測(cè)限均達(dá)到肉含量的0.001%。許如蘇等[33]還基于馬的種屬保守序列設(shè)計(jì)特異性引物和Taqman-LNA探針，建立快速檢測(cè)肉制品中馬源性成分的檢測(cè)方法，與豬、牛、羊、鹿、驢、兔、雞、鴨、鵝和蝦源性成分無(wú)交叉反應(yīng)，可檢測(cè)到馬肉DNA最低限為1.4 pg。

2.1.2.3 熒光探針液滴PCR

微滴數(shù)字PCR(dd PCR) 是先將待測(cè)樣品微滴化處理，再經(jīng)PCR擴(kuò)增后逐個(gè)檢測(cè)每個(gè)液滴的熒光信號(hào)，根據(jù)泊松分布以及陽(yáng)性微滴的個(gè)數(shù)與比例進(jìn)行結(jié)果分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)肉及肉制品的精確定量[17]。是傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)的革新，在滿(mǎn)足目標(biāo)物的絕對(duì)定量的同時(shí)具備更加快速、準(zhǔn)確和靈敏的特點(diǎn)，在肉類(lèi)摻假檢測(cè)方面應(yīng)用較為廣泛。苗麗等[34-35]將羊、牛和豬的β-肌動(dòng)蛋白基因作為分析對(duì)象設(shè)計(jì)引物和熒光探針，建立dd PCR法對(duì)肉制品中羊、牛和豬的含量進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明測(cè)量值和真實(shí)值基本一致，且不受外源物種的干擾，當(dāng)核酸的含量在100～1 000 ng時(shí)，生鮮肉質(zhì)量與DNA含量、DNA含量與DNA拷貝數(shù)之間均呈現(xiàn)明顯的線(xiàn)性關(guān)系。而CAI等[36]也利用豬和雞的β-肌動(dòng)蛋白基因設(shè)計(jì)引物和熒光探針，建立了相似的dd PCR法精確定量檢測(cè)肉制品中的豬和雞源性成分，且不受外源物種的干擾。陳晨[17]根據(jù)牛羊豬雞鴨的基因組設(shè)計(jì)引物及探針，建立了dd PCR技術(shù)以實(shí)現(xiàn)牛肉和羊肉中摻入的豬鴨雞等動(dòng)物源成分的定量分析，并構(gòu)建牛羊豬雞鴨的生肉質(zhì)量和DNA濃度曲線(xiàn)以及DNA濃度和DNA拷貝數(shù)曲線(xiàn)，得到5個(gè)物種的拷貝數(shù)和生肉質(zhì)量的公式，實(shí)現(xiàn)了不同物種單一的定量檢測(cè)。EUN等[37]利用dd PCR技術(shù)高精度定量海產(chǎn)品中阿拉斯加鱈魚(yú)的含量：先將混合物分離成15 000～20 000個(gè)液滴，經(jīng)PCR擴(kuò)增后通過(guò)液滴讀數(shù)器檢測(cè)TaqMan熒光，基于DNA拷貝數(shù)建立公式來(lái)計(jì)算原始樣品質(zhì)量，且檢測(cè)體系中原始樣品質(zhì)量，DNA濃度與DNA拷貝數(shù)之間同樣呈線(xiàn)性關(guān)系。

2.2 熒光染料法

2.2.1 熒光染料法的建立

如圖4所示，熒光染料能非特異嵌合于ds DNA雙螺旋小溝區(qū)域[38]。在激發(fā)光的作用下結(jié)合狀態(tài)的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于游離態(tài)的熒光強(qiáng)度，隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，熒光信號(hào)隨PCR產(chǎn)物的同步增加[39]。該法可以監(jiān)測(cè)任何ds DNA序列的擴(kuò)增，設(shè)計(jì)引物容易且不需要探針，成本較低。

圖4 SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)過(guò)程示意圖[1]

Fig.4 The diagrammatic drawing of the process of SYBR Green I real-time PCR[1]

2.2.2 熒光染料法的應(yīng)用

2.2.2.1 熒光染料法在單重Real-Time PCR中的應(yīng)用

常見(jiàn)的熒光染料有：SYBR Green I和EvaGreen。SYBR Green I熒光染料是一種具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的不對(duì)稱(chēng)菁類(lèi)熒光素，最大吸收波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別約為497 nm、520 nm。近年來(lái)，基于SYBR Green I的Real-Time PCR技術(shù)，在肉類(lèi)摻假檢驗(yàn)方面應(yīng)用較為廣泛。SOARES等[40]以豬的Cyt b和18S rRNA基因?yàn)榉治鰧?duì)象設(shè)計(jì)引物，并在體系中加入SYBR Green I熒光染料，該方法通過(guò)熔解曲線(xiàn)分析顯示出高度特異性，在0.1%～25%檢測(cè)混合肉中豬肉的含量，在原樣和熱處理樣中最低能檢測(cè)到5 pg和20 ng的豬DNA。郭云霞[41]等利用真核生物18S rRNA設(shè)計(jì)引物，對(duì)9種鯊魚(yú)及48種常見(jiàn)非鯊魚(yú)類(lèi)動(dòng)植物樣品進(jìn)行檢測(cè)，非鯊魚(yú)樣品中均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)，熔解曲線(xiàn)在(84±1.5)℃也未出現(xiàn)峰值，建立了基于SYBR Green I熒光染料的Real-Time PCR方法，用于特異性檢測(cè)食品中鯊魚(yú)源性成分，該法的檢測(cè)限為0.000 1 ng/μL。KANG等[42]則利用基于SYBR Green的Real-Time PCR技術(shù)，在100%～0.01%，對(duì)豬肉和牛肉混合物中豬肉的含量進(jìn)行分析，并對(duì)建立的定量方法進(jìn)行驗(yàn)證和比較，以用于檢測(cè)牛肉加工制品中的豬肉摻假。

EvaGreen熒光染料是一種同時(shí)適用于Real-Time PCR反應(yīng)和高分辨率熔解曲線(xiàn)分析的新一代熒光染料， EvaGreen與SYBR Green I熒光染料的光譜相似，且應(yīng)用于現(xiàn)有定量PCR儀的兼容性良好，這種新型飽和染料能均勻地插入ds DNA，同時(shí)能在擴(kuò)增過(guò)程中及時(shí)釋放DNA，減少對(duì)PCR過(guò)程的抑制，故基于EvaGreen熒光定量PCR反應(yīng)的靈敏度相對(duì)較高，再加上該技術(shù)穩(wěn)定性良好，且具有相對(duì)較高的熒光強(qiáng)度和反應(yīng)效率的特點(diǎn)[43]，近年來(lái)其應(yīng)用也較為廣泛。LUBIS等[44]以豬的Cyt b基因設(shè)計(jì)引物，建立使用EvaGreen熒光染料的Real-Time PCR技術(shù)，以此檢測(cè)肉制品中豬的DNA含量，且通過(guò)9種非豬類(lèi)動(dòng)物和6種蔬菜種類(lèi)(陰性)，證實(shí)了該法可測(cè)定豬DNA特異性。在生豬肉和雞肉的混合體系中檢測(cè)限低至0.001%。MEIRA等[45]同樣針對(duì)Cyt b基因設(shè)計(jì)新引物，建立定性定量檢測(cè)，來(lái)檢測(cè)加工食品中馬肉摻假的特性，該測(cè)定顯示出高靈敏度和特異性，在檢測(cè)牛和馬的混合體系中，最低可檢到0.1 pg的馬DNA。JOANA等[46]利用EvaGreen熒光定量PCR建立檢測(cè)體系，通過(guò)分析標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)以及熔解曲線(xiàn)達(dá)到對(duì)肉制品中豬肉含量定量檢測(cè)的目的，該方法利用盲肉混合物進(jìn)行有效驗(yàn)證，具有較強(qiáng)的精確性和可重復(fù)性，最低可檢到0.01 pg的豬DNA。

2.2.2.2 熒光染料在多重Real-Time PCR的應(yīng)用

隨著Real-Time PCR技術(shù)的發(fā)展，往往需要建立多重?zé)晒鈾z測(cè)技術(shù)，以達(dá)到同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)物種的目的，提高檢測(cè)效率。TAE等[14]利用瓦魚(yú)的COI和18S rRNA基因作為分析對(duì)象，建立Real-Time PCR反應(yīng)體系，基于SYBR Green I熒光染料檢測(cè)混合肉中瓦魚(yú)種類(lèi)，且未顯示20種其他物種DNA的交叉反應(yīng)，證實(shí)了該法的特異性，其檢測(cè)限為0.1～0.001 ng/μL，同時(shí)開(kāi)發(fā)了直接三重PCR和超快速Real-Time PCR技術(shù)用于現(xiàn)場(chǎng)食品分析。

ASING等[47]建立了基于SYBR Green熒光染料的雙重Real-Time PCR技術(shù)，以檢測(cè)肉丸和香腸等肉制品中馬來(lái)亞龜?shù)暮?，檢測(cè)過(guò)程中熔解曲線(xiàn)在74.63 ℃和78.40 ℃附近呈現(xiàn)了2個(gè)分別代表這種龜和真核生物的峰，該法的檢測(cè)限為0.001%。SAFDAR等[48]也建立了雙重實(shí)時(shí)PCR技術(shù)用于檢測(cè)飼料中的牛和家禽肉的含量，在79.5 ℃和87.5 ℃的溫度下，牛和家禽的基因產(chǎn)物分別產(chǎn)生2個(gè)不同的熔解峰，且體系也達(dá)到了0.001%的檢測(cè)限。WU等[9]以線(xiàn)粒體DNA和細(xì)胞基因組序列作為分析對(duì)象，建立基于SYBR Green熒光染料的多重Real-Time PCR體系，用于同時(shí)檢測(cè)混合體系中狐貍、狗、貂和兔的DNA含量，含量在5%～40%，相對(duì)偏差為1.98%～12.23%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.06%～11.51%。而近年來(lái)基于EvaGreen熒光染料建立的多重Real-Time PCR技術(shù)，在肉類(lèi)摻假檢測(cè)方面的應(yīng)用也同樣較為廣泛： SAKALAR等[49]以豬和馬的12S rRNA和16S rRNA基因?yàn)檠芯繉?duì)象設(shè)計(jì)引物，建立基于EvaGreen的多重Real-Time PCR技術(shù)，在0.1%～10%能同時(shí)檢測(cè)混合肉中馬和豬肉的含量，檢測(cè)限達(dá)0.000 01 ng/μL。SAKALAR等[50]還開(kāi)發(fā)了基于EvaGreen的雙重Real-Time PCR檢測(cè)方法，該法特異性強(qiáng)，用于檢測(cè)肉類(lèi)及肉制品中的牛肉和豬肉摻假，靈敏度達(dá)到0.001%。

3 展望

肉制品的巨大市場(chǎng)需求促使肉類(lèi)摻雜使假現(xiàn)象趨于嚴(yán)重，為此建立完善肉類(lèi)鑒別檢測(cè)方法成為熱點(diǎn)。以核酸為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)種類(lèi)豐富，包括：DNA探針雜交、普通PCR技術(shù)及其衍生技術(shù)。應(yīng)用于快速定量檢測(cè)的Real-Time PCR技術(shù)以其特異性強(qiáng)、靈敏度高及操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，自問(wèn)世以來(lái)倍受青睞，在食品檢測(cè)領(lǐng)域更是具有較高的應(yīng)用價(jià)值。近年來(lái)，大量研究利用Real-Time PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，建立了鑒別禽、畜和魚(yú)類(lèi)的檢測(cè)方法，應(yīng)用于肉類(lèi)摻假檢測(cè)領(lǐng)域。

同時(shí)，Real-Time PCR技術(shù)仍存在一些挑戰(zhàn)：基于熒光染料的技術(shù)檢測(cè)簡(jiǎn)便、價(jià)格便宜，但染料與DNA雙鏈的非特異性結(jié)合往往會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要通過(guò)擴(kuò)增曲線(xiàn)來(lái)判斷多個(gè)終產(chǎn)物的特異性[38]。相比之下，基于熒光探針的技術(shù)具有更強(qiáng)的特異性，但至關(guān)重要的目標(biāo)基因選擇以及引物探針設(shè)計(jì)還較為困難，若體系中存在與靶基因同源的序列，則易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，使得定量不準(zhǔn)確。單一的Real-Time PCR技術(shù)雖能解決定量檢測(cè)問(wèn)題，但需要建立已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)才能得到目標(biāo)序列的拷貝數(shù)，而檢測(cè)結(jié)果可能受到擴(kuò)增效率的影響，所以該法并不能很好地達(dá)到絕對(duì)定量的要求[17]。

近年來(lái)，為使得檢測(cè)體系的定性定量結(jié)果更加準(zhǔn)確，大量研究對(duì)此項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行了完善，使其應(yīng)用空間更為廣闊。該技術(shù)的新興發(fā)展方向無(wú)疑是使檢測(cè)效率更高和檢測(cè)結(jié)果更可靠。在提升檢測(cè)效率方面：(1)縮短提取DNA的時(shí)間，目前，肉制品中DNA的提取是Real-Time PCR檢測(cè)技術(shù)的限速步驟；(2)縮短PCR反應(yīng)時(shí)間，可利用高效設(shè)備如微量熒光定量PCR儀來(lái)實(shí)現(xiàn)；(3)增大單次檢測(cè)物種數(shù)目，結(jié)合多重PCR技術(shù)的思想，準(zhǔn)確、高效地同時(shí)識(shí)別多個(gè)肉類(lèi)品種；(4)讓檢測(cè)結(jié)果可視化，傳統(tǒng)Real-Time PCR技術(shù)是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算目標(biāo)物種的含量，此技術(shù)較為抽象，可結(jié)合等溫PCR技術(shù)的思想，通過(guò)產(chǎn)物或試紙條顏色變化呈現(xiàn)更直觀的結(jié)果。在提升檢測(cè)結(jié)果可靠性方面：(1)嚴(yán)格控制變量，由于不同組織肉樣的DNA豐度不同，基因拷貝數(shù)存在差異，選取不同的質(zhì)量梯度，準(zhǔn)確建立生肉質(zhì)量和DNA拷貝數(shù)的關(guān)系曲線(xiàn)至關(guān)重要；(2)多角度分析結(jié)果，結(jié)合其他學(xué)科知識(shí)構(gòu)建新型檢測(cè)體系，以當(dāng)下新興的數(shù)字PCR技術(shù)為例，將檢測(cè)體系同統(tǒng)計(jì)概率學(xué)和“化一為萬(wàn)”的技巧相結(jié)合，通過(guò)直接計(jì)數(shù)或泊松分布公式來(lái)計(jì)算檢測(cè)結(jié)果，不必對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量，不受擴(kuò)增效率的影響[36]。

較為繁瑣的操作(公式的建立、摻假模型的設(shè)計(jì))往往不利于檢測(cè)方法的推廣。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化檢驗(yàn)流程，整合DNA提取、擴(kuò)增與檢測(cè)過(guò)程，將PCR技術(shù)與各項(xiàng)新技術(shù)(基因芯片、蛋白質(zhì)芯片等)有機(jī)結(jié)合[1,17]是未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展、新型熒光標(biāo)記物的設(shè)計(jì)和新型檢測(cè)模式的深入研究，在肉類(lèi)摻假檢測(cè)領(lǐng)域，建立以Real-Time PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的新型簡(jiǎn)單快速準(zhǔn)確、高通量、低成本的檢測(cè)體系指日可待。