董志紅, 陳 渝, 宋慧謹(jǐn), 周長春, 盧志龍, 李 旭

(1.成都大學(xué) 機(jī)械工程學(xué)院, 四川 成都 610106；2.四川大學(xué) 國家生物醫(yī)學(xué)工程研究中心， 四川 成都 610064)

0 引 言

隨著材料學(xué)、分子生物學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)等交叉學(xué)科的發(fā)展，通過生物活性材料在體內(nèi)刺激細(xì)胞(干細(xì)胞)使其遷移、增殖、分化、誘導(dǎo)，使自身的組織進(jìn)行再修復(fù)以及重建受損組織或器官，已成為該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn).20世紀(jì)70年代，科研人員就發(fā)現(xiàn)了生物玻璃粉體(CaO-SiO2-P2O5)材料，該種材料具有特有的生物活性，可與人體活骨組織產(chǎn)生牢固的化學(xué)結(jié)合，植入人體后與組織界面區(qū)域不會(huì)形成非黏連性纖維層隔膜，進(jìn)一步的研究也證實(shí)了生物玻璃作為骨修復(fù)材料長期植入體內(nèi)對成骨細(xì)胞沒有毒性，能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，加速新骨的生成，并和骨形成牢固的鍵合，可修復(fù)受損的骨組織和牙缺損，獲得了較好的臨床應(yīng)用效果[1-5].氟是人體中的一種必需微量元素，主要分布在骨骼、牙齒、指甲和毛發(fā)中，對骨骼和牙齒硬組織的生長起著重要作用.牙齒中含微量的氟，可促進(jìn)磷灰石在牙釉質(zhì)表面沉積，加速釉面再礦化，提高結(jié)晶度[6].研究證實(shí)，氟基磷灰石比羥基磷灰石晶體表面積更小，使牙齒比人體骨更加堅(jiān)固，可提高外來物質(zhì)的侵蝕[7].常規(guī)的氟元素，在日常牙齒保護(hù)中，常以單純的氟離子存在，如氟化鈉.但牙齒中釋放過多的氟離子，會(huì)減少釉質(zhì)蛋白的分泌，干擾成釉細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，減少釉基質(zhì)絲氨酸蛋白酶的合成和分泌，最終導(dǎo)致氟牙癥的發(fā)生[8].且這些氟離子，不能和其他元素形成活性物質(zhì)誘導(dǎo)磷灰石的形成，也就不能修復(fù)受損的牙組織.而釉原蛋白，在牙釉質(zhì)形成階段，可自行組裝，調(diào)控牙釉質(zhì)晶體的有序生長和排列，形成納米晶，從而使牙齒更加堅(jiān)固.本研究擬采用氟基硅酸鈣，在釉原蛋白誘導(dǎo)下，在仿生礦化液中對牙齒進(jìn)行仿生礦化，在其表面形成一層致密的礦化層，并分析該礦化層的結(jié)構(gòu)和晶體形態(tài)，對其力學(xué)性能進(jìn)行評估及生物學(xué)表征，以獲得最佳的仿生牙釉質(zhì).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

1.1.1 材 料.

實(shí)驗(yàn)所用的牙釉質(zhì)小片為臨床上因正畸而拔掉的成人恒牙，用切割機(jī)去除根部，牙冠超聲清洗，縱向切割成3 mm×3 mm×2 mm大小的牙釉質(zhì)樣品，然后進(jìn)行拋光處理，再經(jīng)乙醇溶液超聲波清洗后，烘干備用.

實(shí)驗(yàn)所用試劑包括：硅酸鈉(Na2SiO3)、硝酸鈣(Ca(NO3)2)、氟化銨(NH4F)、氯化鈉(NaCl)、碳酸氫鈉(NaHCO3)、氯化鉀(KCl)、三水磷酸氫二鉀(K2HPO4· 3H2O)、 六水氯化鎂(MgCl2· 6H2O)、 鹽酸(HCl)、二水氯化鈣(CaCl2·2H2O)、十水硫酸鈉(Na2SO4·10H2O)，均購自成都科龍化工試劑廠；三羥甲基氨基甲烷(HN2C(CH2OH)3)，購自Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，購自Gibco公司.

1.1.2 儀 器.

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：PW2404型X射線光電子能譜儀(飛利浦公司)；TCS SP8型激光共聚焦顯微鏡(徠卡儀器有限公司)；Infinite200 Pro型多功能酶標(biāo)儀(帝肯(上海)貿(mào)易有限公司)；JSE-5900LV型掃描電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)；HV-1000型顯微維氏硬度計(jì)(上海比目儀器有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 氟基硅酸鈣制備.

1.2.2 仿生礦化液配置.

1.2.3 實(shí)驗(yàn)流程.

實(shí)驗(yàn)流程為：將處理好的牙釉質(zhì)小片清洗干凈后備用，將配置好的檸檬酸(pH=4.2)置于容量瓶中，將牙釉質(zhì)小片酸蝕30 s后，用清水沖洗，然后用小牙刷蘸取氟基硅酸鈣粉體在牙釉質(zhì)表面輕輕刷涂，模擬刷牙的形式，刷1 min后，用清水沖洗；取配置好的仿生礦化液，將0.2 μg豬釉原蛋白(P173)溶液滴定到礦化液中，調(diào)節(jié)pH值到7.4～7.6，再將上述處理的牙釉質(zhì)小片放在溶液中，置于37.2～37.6 ℃恒溫水浴箱中振蕩浸泡24～48 h，獲得仿生礦化材料層.實(shí)驗(yàn)對照樣為未加釉原蛋白的礦化液處理樣.實(shí)驗(yàn)材料的仿生礦化流程如圖1所示.

圖1氟基硅酸鈣在誘導(dǎo)牙齒仿生礦化的流程

1.3 材料表征

在材料表征中，氟基硅酸鈣材料的成分通過X射線光電子能譜儀測定；仿生礦化層的顯微結(jié)構(gòu)通過掃描電子顯微鏡觀察，并通過X射線能譜分析(EDX)測試礦化層的主要成分比;礦化層的力學(xué)性能通過顯微維氏硬度計(jì)測定，測定5個(gè)樣品，取平均值.

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

在常規(guī)的體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，將經(jīng)仿生礦化處理的牙釉質(zhì)小片，用70%酒精消毒15 min后，再通過紫外光照30 min殺菌消毒后備用，然后將樣品放在培養(yǎng)皿中，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)在體外共培養(yǎng)1、2、3 d.細(xì)胞培養(yǎng)液的成分為RPMI-1640與10%胎牛血清(FCS)，將100 μL含細(xì)胞大約為1×106個(gè)/mL的培養(yǎng)液直接種植在各個(gè)試樣中(試樣置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中)，經(jīng)過24 h后細(xì)胞附著在試樣上，然后再往試樣上添加2mL的培養(yǎng)液，之后將試樣放置在37 ℃，5% CO2的環(huán)境下進(jìn)行細(xì)胞培育，并且每24 h換一次培養(yǎng)液.

為了觀察細(xì)胞的貼壁及生長情況，本研究使用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞增殖及分化等，并通過多功能酶標(biāo)儀計(jì)算細(xì)胞的生物活性.

2 結(jié)果與分析

2.1 仿生礦化層的顯微結(jié)構(gòu)

試樣的仿生礦化層的顯微結(jié)構(gòu)如圖2所示.

由圖2可知，試樣經(jīng)過氟基硅酸鈣處理后，在牙釉質(zhì)表面形成了一層礦化層(見圖2(a))，呈納米多層狀的短柱狀納米晶粒團(tuán)聚體，且中間有微孔隙，孔徑大小為2～20 nm，粒徑大小為30～80 nm.而試樣經(jīng)過氟基硅酸鈣處理后，在釉原蛋白誘導(dǎo)下的礦化液中，牙釉質(zhì)表面形成簇狀短棒狀結(jié)晶(見圖2(b))，結(jié)構(gòu)類似于牙釉質(zhì)的納米磷灰石，且按一定方向有序簇狀生長.進(jìn)一步分析可知，2個(gè)樣品的材料表面化學(xué)成分也類似，在較短實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)礦化層的鈣磷比(1.42)接近于牙釉質(zhì)鈣磷比(1.45).事實(shí)上，釉原蛋白誘導(dǎo)氟基硅酸鈣形成的仿生礦化結(jié)構(gòu)，與很多因素有關(guān)，如理化條件、pH值等，且釉原蛋白中的一種異形體具有信號分子作用，能夠改變細(xì)胞的表達(dá)，促進(jìn)骨細(xì)胞的分化和牙周組織的再生.形成的有序的短棒狀簇狀結(jié)構(gòu)，主要是釉原蛋白的磷酸化基團(tuán)對自組裝形成高度有序的結(jié)構(gòu)具有潛在的影響[10].磷酸化基團(tuán)的疏水結(jié)構(gòu)通過pH值、溫度及生理?xiàng)l件來調(diào)節(jié)，控制其離子強(qiáng)度和釉原蛋白的結(jié)構(gòu)，并進(jìn)一步加強(qiáng)蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)的相互作用.同時(shí)，磷酸化基團(tuán)的低溶解性易形成聚集物，并以固態(tài)或凝膠狀形式存在，這種溶解和未溶解的釉原蛋白共存在早期的釉質(zhì)礦化中，可形成“納米球"，為晶體的發(fā)生和成長方向提供了有機(jī)的微觀結(jié)構(gòu)[11].因此，釉原蛋白誘導(dǎo)礦化過程中，調(diào)控牙釉質(zhì)的礦物質(zhì)形成，且它與鈣離子較強(qiáng)的親和性使其對礦物的形成具有促進(jìn)和抑制的雙重調(diào)節(jié)功能，從而影響特定晶面發(fā)生擇優(yōu)取向，影響礦物的形核和形貌.在釉質(zhì)晶體形成的早期階段，釉原蛋白的濃度等因素影響著磷酸八鈣(OCP)的晶體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其晶體沿著c 軸快速生長，形成有序化的礦化相.

圖2仿生礦化層顯微結(jié)構(gòu)及對應(yīng)的Ca/P比

2.2 力學(xué)性能測試

通常，正常牙齒的維氏硬度值在240～350之間[12].本研究試樣的牙釉質(zhì)仿生礦化層力學(xué)結(jié)果如圖3所示.

FCS為氟基硅酸鈣處理； A-FCS為釉原蛋白誘導(dǎo)氟基硅酸鈣處理

圖3仿生礦化層的力學(xué)性能對比

由圖3可知，單純的氟基硅酸鈣(FCS)在仿生礦化液中誘導(dǎo)形成的礦化層力學(xué)性能,處理5 d后，其維氏硬度為290±10.而釉原蛋白誘導(dǎo)氟基硅酸鈣(A-FCS)在礦化液中，5 d后所形成的礦化層，其維氏硬度為320±10，力學(xué)性能優(yōu)于單一氟基硅酸鈣材料仿生所形成的礦化層.

2.3 細(xì)胞結(jié)果

牙釉質(zhì)試樣小片經(jīng)過仿生礦化處理24 h后，消毒，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)在體外共培養(yǎng)24、48、72 h后，其激光共聚焦顯微鏡圖片如圖4所示.

FCS為氟基硅酸鈣； A-FCS為釉原蛋白誘導(dǎo)氟基硅酸鈣

圖4牙釉質(zhì)小片經(jīng)過仿生礦化后，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

(MSCs)體外培養(yǎng)不同時(shí)間(a)及在48h細(xì)胞的活力(b)

由圖4可知，材料體外細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果隨著時(shí)間的延長，細(xì)胞逐漸增殖、分化，表現(xiàn)出良好的生物相容性與促進(jìn)細(xì)胞增殖能力(見圖4(a)).與單一的氟基硅酸鈣材料(FCS)相比，釉原蛋白誘導(dǎo)下的氟基硅酸鈣材料(A-FCS)細(xì)胞數(shù)量增加，密度較大，且細(xì)胞活力均較好(見圖4(b)).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，材料的表面結(jié)構(gòu)對細(xì)胞的增殖與分化有一定的影響，但兩種礦化結(jié)構(gòu)均表現(xiàn)出較好的生物相容性.

3 結(jié) 論

本研究表明，釉原蛋白誘導(dǎo)氟基硅酸鈣，采用正常的理化條件，如口腔的pH值和溫度等，在仿生礦化液中誘導(dǎo)晶體生長可形成仿生礦化層，其結(jié)構(gòu)類似于正常的牙齒的結(jié)構(gòu)，晶格有序排列且能等定向生長，力學(xué)性能較好，且仿生礦化層具有較好的生物相容性，細(xì)胞可貼壁生長，且增殖分化.本研究方法可構(gòu)建微納米結(jié)構(gòu)的釉質(zhì)組織，并修復(fù)受損的牙齒及促進(jìn)其再生.下一步的動(dòng)物模型需要進(jìn)一步評估該材料在牙槽骨中誘導(dǎo)釉質(zhì)的生成.