張宇華 王曉彬 劉 佳 穆 鵬

絨毛膜癌是1種高度惡性的腫瘤，多繼發(fā)于葡萄胎、流產(chǎn)或足月分娩以后。早期絨毛膜癌癥狀不典型甚至無(wú)癥狀，隨著瘤體增大而表現(xiàn)不規(guī)則陰道流血、子宮變大而軟等癥狀，此時(shí)多已進(jìn)展到中晚期[1]。目前，絨毛膜癌的篩查手段主要包括血清學(xué)指標(biāo)人絨毛膜促性腺激素β亞基(β-Human chorionic gonadotropin，β-HCG)和超聲。然后，血清β-HCG缺乏特異性，其在多種生理、病理狀態(tài)下均會(huì)增高[2-3]；報(bào)道也指出B超對(duì)絨毛膜癌的診斷率僅為67.4%左右[4]。

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類(lèi)重要的非編碼RNA，其與癌癥的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是近年研究的熱點(diǎn)[5]。研究發(fā)現(xiàn)多種非編碼RNA在絨毛膜癌患者體內(nèi)存在異常表達(dá)，且與癌細(xì)胞增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[6-7]，但關(guān)于circRNA在絨毛膜癌中的臨床價(jià)值卻尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討絨毛膜癌患者血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3聯(lián)合β-HCG的診斷及預(yù)后價(jià)值，以期為絨毛膜癌的診療提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象的納入

收集本院2014年2月到2015年5月確診的絨毛膜癌患者140例，患者均為首次住院且經(jīng)內(nèi)鏡組織學(xué)檢查確診。絨毛膜癌的診斷和分期依據(jù)西班牙醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)會(huì)(SEOM)發(fā)布的2017版妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病臨床管理指南[8]。其中Ⅰ～Ⅱ期患者77例，Ⅲ～Ⅳ期患者63例；發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移54例(陰道轉(zhuǎn)移39例、肺轉(zhuǎn)移7例、腦轉(zhuǎn)移4例、肝脾轉(zhuǎn)移4例)，未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移86例。同期選取我院體檢的健康女性140例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①語(yǔ)言表達(dá)能力正常，能與調(diào)查人員進(jìn)行正常的溝通；②研究對(duì)象自愿參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有其他腫瘤疾病史者；②排除腦卒中、老年癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)疾病導(dǎo)致的無(wú)法采集相關(guān)信息和精神分裂癥的患者；③孕婦或哺乳期女性。本研究的開(kāi)展經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有納入對(duì)象均簽署了項(xiàng)目知情同意書(shū)。

1.2 臨床資料與樣本的采集

由專(zhuān)業(yè)的研究人員記錄所有研究對(duì)象年齡、體重指數(shù)(body mass index，BMI)、吸煙史、飲酒史等基本信息。兩組間在年齡、BMI、吸煙史及飲酒史的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明兩組間具有可比性，見(jiàn)表1。

使用促凝采血管收集經(jīng)禁食10 h以上絨毛膜癌患者接受治療前及健康對(duì)照者入院體檢時(shí)的靜脈血5 ml。收集的標(biāo)本在1 h內(nèi)于4 ℃條件下以3 500 g離心力(離心半徑為10 cm)離心10 min，收集上層血清，并放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)錂z測(cè)。

表1 兩組間臨床資料比較

1.3 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG水平的檢測(cè)

按照血清RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行血清總RNA提取。取上述提取的RNA，使用去除基因組逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，RT-PCR)。RT-PCR按照SYBR GREEN說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，反應(yīng)體系為：Mix 10 μl，上下游引物各0.8 μl，cDNA 2 μl，DEPC水6.4 μl。熒光定量PCR循環(huán)條件：95 ℃變性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。應(yīng)用PrimerPremier5.0進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)，使用的circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3與GAPDH引物序列見(jiàn)表2，引物合成由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司提供。采用2-ΔΔCt法計(jì)算circRNAs的相對(duì)表達(dá)量，△Ct值=樣本Ct值-GAPDH Ct值。血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和GAPDH基因熔解曲線峰型單一，說(shuō)明引物沒(méi)有形成引物二聚體，也沒(méi)有非特異性擴(kuò)增。

血清β-HCG的檢測(cè)采用化學(xué)發(fā)光法，試劑由上海百蕊生物科技有限公司提供。質(zhì)控品采用英國(guó)朗道公司腫瘤高、低值質(zhì)控品，質(zhì)控判斷標(biāo)準(zhǔn)為Westgard多規(guī)則分析。

同時(shí)計(jì)算血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG檢測(cè)的批內(nèi)、批間變異系數(shù)值，以評(píng)估實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和精確度。

表2 circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3與GAPDH的引物序列

1.4 隨訪

依據(jù)患者納入研究的時(shí)間，對(duì)患者進(jìn)行40個(gè)月電話隨訪，并記錄患者的生存時(shí)間。隨訪終點(diǎn)為：①40個(gè)月內(nèi)患者死亡；②40個(gè)月內(nèi)患者退出該項(xiàng)研究；③40個(gè)月隨訪結(jié)束。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG水平比較

本次實(shí)驗(yàn)血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG的批內(nèi)變異系數(shù)分別為2.7%、2.6%、2.5%，批間變異系數(shù)分別為3.0%、2.8%、2.9%，均小于5%，提示樣本檢測(cè)具有良好的重復(fù)性和精確度。絨毛膜癌患者血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG水平顯著高于健康對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 兩組間血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG水平比較

2.2 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG與絨毛膜癌臨床特征的關(guān)系

如表4所示，血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG水平與絨毛膜癌患者年齡、吸煙史、飲酒史和BMI等因素均無(wú)明顯關(guān)系(P>0.05)。此外，血清circRNA-PTENP1和circRNA-HIPK3水平與絨毛膜癌TNM分期(PTENP1：γ=0.514，P=0.004；HIPK3：γ=0.465，P=0.009)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(PTENP1：γ=0.501，P=0.005；HIPK3：γ=0.449，P=0.013)呈線性關(guān)聯(lián)。

表4 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG與絨毛膜癌臨床特征的關(guān)系

2.3 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG對(duì)絨毛膜癌的鑒別價(jià)值

ROC曲線分析顯示，血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG在區(qū)分絨毛膜癌與健康對(duì)照的AUC分別為0.841(95%CI：0.754～0.927，P<0.001)、0.815(95%CI：0.672～0.908，P<0.001)和0.612(95%CI：0.558～0.706，P=0.002)；在各指標(biāo)約登指數(shù)為最大值時(shí)對(duì)應(yīng)的靈敏度/特異度分別為：73.7%/90.7%、78.5%/86.9%和70.2%/59.3%；診斷界值分別為78.6(-log)、29.0(-log)和7.5 mIU/ml。聯(lián)合血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG在區(qū)分絨毛膜癌與健康對(duì)照的AUC為0.923(95%CI：0.893～0.974，P<0.001)，靈敏度92.3%，特異度83.4%，見(jiàn)圖1。

圖1 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG對(duì)絨毛膜癌鑒別價(jià)值

2.4 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG對(duì)絨毛膜癌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

二元logistic回歸分析結(jié)果，見(jiàn)表5。單因素分析顯示，血清高circRNA-PTENP1和高circRNA-HIPK3水平是絨毛膜癌發(fā)病的危險(xiǎn)因素(P<0.05)；多因素分析顯示，在校正年齡、BMI、吸煙、飲酒等因素后，血清高circRNA-PTENP1和高circRNA-HIPK3水平仍是絨毛膜癌發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。

2.5 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG水平與絨毛膜癌預(yù)后的關(guān)系

經(jīng)40個(gè)月隨訪，共48例絨毛膜癌患者死亡，0例失訪。140例絨毛膜癌患者分別依據(jù)PTENP1、HIPK3和β-HCG水平的中位數(shù)分為高PTENP1與低PTENP1組、高HIPK3與低HIPK3組和高β-HCG與低β-HCG組。相比低PTENP1組，高PTENP1組生存率顯著降低(χ2=5.694，P=0.006，圖2A)；相比低HIPK3組，高HIPK3組生存率顯著降低(χ2=17.859，P<0.001，圖2B)；而低β-HCG組和高β-HCG組間生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.173，P=0.216，圖2C)。

3 討論

絨毛膜癌的惡性程度高，侵襲能力強(qiáng)，是威脅女性人群健康的主要疾病之一。生物標(biāo)志物是血液、尿液或者組織中能檢測(cè)疾病狀態(tài)的分子指標(biāo)，可用于疾病的檢測(cè)[9]。它們?cè)隗w液中的濃度變化可以提供疾病的進(jìn)展情況，理想情況下，生物標(biāo)志物應(yīng)具有檢測(cè)早期小塊腫瘤的高敏感性、高特異性，并且在非腫瘤中不會(huì)增加。目前，絨毛膜癌診斷仍缺乏有效指標(biāo)。β-HCG是絨毛膜癌輔助診斷的重要指標(biāo)，但多種病理、生理狀態(tài)下β-HCG均可出現(xiàn)升高[10-11]：正常懷孕、雙胞胎，葡萄胎、或在內(nèi)分泌疾病中如腦垂體疾病、甲狀腺功能亢進(jìn)、婦科疾病如卵巢囊腫、子宮癌等；此外，其他系統(tǒng)實(shí)體瘤畸胎瘤、胰腺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等β-HCG亦可升高。值得注意的是，本次研究我們也發(fā)現(xiàn)β-HCG用于鑒別絨毛膜癌與健康女性對(duì)照的特異度不高，僅為59.3%，這與早前報(bào)道β-HCG缺乏特異性相一致[10-11]。

circRNA是1類(lèi)新型的基因調(diào)控因子，能與DNA、RNA或蛋白質(zhì)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平，以順勢(shì)調(diào)控或反式調(diào)控的方式，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，參與幾乎人類(lèi)所有的生理及病理性生物學(xué)過(guò)程，已被證實(shí)在多種腫瘤如肝癌、胃癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、前列腺癌等中存在異常表達(dá)。血清circRNA-PTENP1和circRNA-HIPK3是近年研究發(fā)現(xiàn)的在女性乳腺癌及多個(gè)生殖系統(tǒng)腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用的促癌基因。研究先后指出，circRNA-PTENP1和circRNA-HIPK3的差異表達(dá)可直接對(duì)靶基因如miR-17、P53等轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移，并抑制細(xì)胞凋亡[12-15]。Zheng等[12]通過(guò)收集并提取膀胱癌與健康者血清外泌體PTENP1發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者PTENP1水平顯著高于健康對(duì)照，且高水平PTENP1與膀胱癌患者不良預(yù)后相關(guān)。Yu等[13]的機(jī)制研究同樣證實(shí)，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染PTENP1 mimics于膀胱癌T24細(xì)胞以上調(diào)T24細(xì)胞中PTENP1的表達(dá)水平，觀察到上調(diào)PTENP1后可顯著下調(diào)下游靶基因miR-17的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)T24細(xì)胞的增殖與遷移能力，并抑制癌細(xì)胞凋亡，提示PTENP1對(duì)膀胱癌癌細(xì)胞的生物學(xué)活性具有促進(jìn)作用。近期，Chen等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，PTENP1可通過(guò)AKT-MAPK通路促進(jìn)乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。HIPK3作為促癌基因，有關(guān)價(jià)值研究也很深入。Li等[15]利用二代測(cè)序技術(shù)與生物信息學(xué)分析，在膀胱癌患者中篩選出了HIPK3，機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)HIPK3在膀胱癌組織和細(xì)胞系中顯著上調(diào)，并分別與膀胱癌分級(jí)、浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，且過(guò)量表達(dá)HIPK3能有效促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞在體外的遷移、侵襲和血管生成，促進(jìn)膀胱癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。然而，關(guān)于circRNA-PTENP1和circRNA-HIPK3在絨毛膜癌中的表達(dá)情況未見(jiàn)報(bào)道，其是否具有成為早期腫瘤診斷標(biāo)志物的潛力是本次研究需要探討的。本研究通過(guò)對(duì)140例絨毛膜癌患者血清學(xué)的分析發(fā)現(xiàn)，血清circRNA-PTENP1和circRNA-HIPK3在絨毛膜癌中顯著增高，此外，血清circRNA-PTENP1和circRNA-HIPK3水平與絨毛膜癌患者分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，兩者在Ⅲ～Ⅳ期及發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者中的水平增高最為顯著，提示兩者與絨毛膜癌的進(jìn)展相關(guān)，該部分結(jié)果與前期研究基本相符[13-15]。

表5 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG對(duì)絨毛膜癌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

注：a為校正年齡、BMI、吸煙、飲酒等因素。

圖2 血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG水平與絨毛膜癌預(yù)后的關(guān)系

進(jìn)一步ROC曲線分析顯示，血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG在區(qū)分絨毛膜癌與健康對(duì)照的靈敏度/特異度分別為73.7%/90.7%、78.5%/86.9%和70.2%/59.3%；而聯(lián)合三者后在區(qū)分絨毛膜癌與健康對(duì)照的靈敏度顯著提高，達(dá)到92.3%，提示聯(lián)合血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG具有較高的診斷價(jià)值。進(jìn)一步二元logistic回歸分析顯示，在校正了年齡、BMI、吸煙、飲酒后，血清高circRNA-PTENP1和高circRNA-HIPK3水平仍是絨毛膜癌發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，證實(shí)了血清miR-145、miR-29和miR-217水平差異可作為絨毛膜癌的診斷指標(biāo)。生存分析結(jié)果提示，高PTENP1組和高HIPK3組患者的預(yù)后更差，這與前期多個(gè)研究結(jié)果相符[13-15]。然而，本次研究仍有如下不足：①本次研究納入的研究對(duì)象均來(lái)自于本院，這可能會(huì)對(duì)研究結(jié)果造成一定的偏倚影響，今后需要多中心的隊(duì)列研究來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證我們的結(jié)果；②本研究納入140例絨毛膜癌患者，納入的例數(shù)仍然是有限的，后期需要更大樣本量的研究來(lái)證實(shí)血清circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG的臨床價(jià)值。

綜上所述，本次研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合circRNA-PTENP1、circRNA-HIPK3和β-HCG對(duì)絨毛膜癌的潛在診斷價(jià)值，并發(fā)現(xiàn)circRNA-PTENP1與circRNA-HIPK3在絨毛膜癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和預(yù)后評(píng)價(jià)中有重要意義，有望為絨毛膜癌的臨床診治提供新的途徑。