(浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)是早產(chǎn)兒最常見的一種疾病，常在沒有任何預(yù)兆的情況下出現(xiàn)，并且迅速演變?yōu)槟c道壞死，嚴(yán)重者直接導(dǎo)致死亡。自60多年前，現(xiàn)代新生兒重癥監(jiān)護(hù)開始以來，NEC已被廣泛認(rèn)可[1]。但至今NEC的發(fā)病機(jī)制還沒完全明了，這嚴(yán)重限制了NEC的預(yù)防和治療。

神經(jīng)介素 U 是從豬脊髓分離的一種神經(jīng)肽，由于它在體外可使大鼠的子宮肌收縮，因此加后綴 U(英語子宮 uterus 的首字母) 命名為 NMU。隨著深入研究，NMU 主要分布于胃腸道、泌尿生殖系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。在胃腸道中，黏膜和腸肌層的神經(jīng)細(xì)胞體和纖維中存在NMU-LIR[2]。但神經(jīng)介素U的其他功能，是否抑制細(xì)胞凋亡、能否通過抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞分裂來治療或緩解NEC至今尚未見報道。本研究將從NMU促進(jìn)腸粘膜細(xì)胞分裂增殖和抑制細(xì)胞凋亡等方面進(jìn)行探索。

1 材料與方法

1.1材料 新生SD大鼠由上海斯萊克有限公司提供[SCXK(滬)2017-0005]。NMU、TUNEL試劑盒、PCNA、免疫組化試劑和配方奶分別由Peprotech、碧云天公司、PCNA、中杉金橋和Petag公司提供。

1.2方法

1.2.1動物實驗 30只新生大鼠，性別不限，平均體重6 g，隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為正常對照組(A)、NEC模型組(B)和NMU治療組(C)。A組小鼠采用母鼠正常喂養(yǎng)，B組和C組小鼠采用人工配方奶粉喂養(yǎng)、低高氧暴露和冷刺激方法，即新生大鼠在100% CO2高氧艙環(huán)境中保持10 min，4 ℃環(huán)境中5 min，然后保持97% O2環(huán)境中5 min，每天早晚兩次，連續(xù)3 d。第4 d開始，B組注射等量的生理鹽水，C組腹腔注射NMU(1 mg/kg·d)，每天一次，連續(xù)3 d。第 7 d對所有大鼠實施安樂死后，取胃腸道組織行組織病理學(xué)檢測。

1.2.2腸道組織病理學(xué)檢查 將腸道組織樣品用 4%多聚甲醛固定24 h，再進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋切片和HE染色。腸道組織病理結(jié)果采用新標(biāo)準(zhǔn)雙盲法計分[3]：無組織學(xué)損害為0分；輕度粘膜下層和固有層分離為1分；粘膜下層和固有層中度分離，粘膜下層及肌層水腫為2分；粘膜下層和固有層嚴(yán)重分離，嚴(yán)重水腫，局部絨毛脫落為3分；絨毛全部丟失或壞死為4分。分?jǐn)?shù)≥2被定義為NEC。

1.2.3免疫組織化學(xué)法 免疫組織化學(xué)法檢測大鼠腸道上皮組織中增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)的表達(dá)變化，具體而言，先進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋切片并脫蠟至水，用3%雙氧水滅活內(nèi)源性酶10 min，用pH 9.0的EDTA微波爐中高火20 min修復(fù)抗原，經(jīng)5% BSA室溫封閉20 min后，一抗4℃孵育過夜，PBS洗滌后加二抗于37℃孵育20 min，再經(jīng)DAB顯色及蘇木素復(fù)染，酒精脫水，用中性樹脂膠封片并鏡檢。

1.2.4細(xì)胞凋亡檢測 按常規(guī)方法進(jìn)行石蠟的包埋切片并脫蠟至水，利用原位末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測腸道上皮細(xì)胞的凋亡情況,具體按照試劑盒說明書上步驟進(jìn)行操作，最后用抗熒光淬滅劑封片液封片并鏡檢。

1.2.5圖像分析 隨機(jī)抽取 5 張免疫組化結(jié)果圖，并用IPP 6.0進(jìn)行半定量分析，統(tǒng)計PCNA陽性率；細(xì)胞凋亡統(tǒng)計方法為每個切片隨機(jī)選取5個視野計數(shù)每200個細(xì)胞中凋亡細(xì)胞數(shù),計算細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1生長發(fā)育情況 A組大鼠無異常，生長發(fā)育良好。B組大鼠在NEC造模3 d后精神萎靡，并出現(xiàn)明顯的腹瀉癥狀，體重顯著下降。C組大鼠活動量減少，體重略有下降，腹瀉癥狀比B組輕。

2.2腸道組織病理學(xué)比較 三組大鼠腸道組織HE染色結(jié)果，如圖1所示。A組：組織結(jié)構(gòu)清晰正常，上皮完整連續(xù)，絨毛無水腫，黏膜層、黏膜下層及固有層無充血水腫及斷裂分離；B組：腸組織壞死嚴(yán)重，絨毛變性水腫，排列不規(guī)則，肌層變薄甚至斷裂，固有層與黏膜下層重度水腫。C組腸組織出現(xiàn)部分壞死，部分絨毛變性水腫，黏膜下和固有層水腫也較輕。三組大鼠雙盲法病理評分及組間比較結(jié)果顯示(表1): NEC模型組較正常對照組腸道損傷顯著加重 (P<0.01)，治療組腸道損傷較模型組顯著減輕 (P<0.01)。

圖1 大鼠腸道組織HE染色光鏡觀察(HE,×200)

表1 大鼠病理學(xué)比較

注：B和C與A比較，aP<0.01，C與B比較，bP<0.01

2.3PCNA 在腸上皮細(xì)胞的表達(dá)變化 如圖2所示，PCNA蛋白主要在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，A組腸上皮和腸絨毛細(xì)胞核中表達(dá)強(qiáng)陽性，B組腸上皮有表達(dá)，腸絨毛中表達(dá)較低，呈弱陽性，C組較B組明顯腸上皮和腸絨毛表達(dá)增強(qiáng)，呈陽性，表達(dá)強(qiáng)度較對照組略低。半定量分析結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

2.4腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡 原位末端標(biāo)記的檢測結(jié)果，如圖3所示，TUNEL陽性的細(xì)胞核呈紅色, 主要分布在腸絨毛的頂部和腸黏膜上皮。計數(shù)結(jié)果顯示,B組小腸黏膜上皮細(xì)胞TUNEL陽性的細(xì)胞數(shù)明顯多于A組(P<0.01)；C組小腸黏膜上皮細(xì)胞TUNEL陽性的細(xì)胞數(shù)少于B組(P<0.01)(表2)。

表2 腸黏膜 PCNA表達(dá)和腸黏膜凋亡

注：B和C與A比較，aP<0.01，C與B比較，bP<0.01

圖2 PCNA 在腸上皮細(xì)胞的表達(dá)變化(SP，×200)

圖3 新生大鼠腸道上皮細(xì)胞凋亡變化(TUNEL，×200)

3 討論

NEC是一種十分嚴(yán)重的新生兒腸道炎性疾病，發(fā)病兒童中估計有20%～40%需要手術(shù)治療,其中死亡率高達(dá)45%[4]。目前NEC的預(yù)防和治療都沒有明確的方法。然而腸道功能的維護(hù)主要是通過腸黏膜的快速更新來完成的,而細(xì)胞增殖是維護(hù)腸黏膜的結(jié)構(gòu)與功能的重要機(jī)制之一[5]。 PCNA 在細(xì)胞DNA復(fù)制、細(xì)胞增殖及細(xì)胞調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[6]。在小腸缺血再灌注損傷時，PCNA 的表達(dá)變化與腸道上皮細(xì)胞增殖分化相一致，腸道上皮PCNA的表達(dá)先降后升，可能與損傷后的腸粘模自身修復(fù)相關(guān)[7]。NMU的功能主要是刺激平滑肌收縮，影響胃腸功能，調(diào)節(jié)攝食和能量平衡，然而，NMU是否能通過促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡來緩解或治療NEC尚未見報道。

本研究發(fā)現(xiàn)：與正常新生大鼠腸上皮中PCNA表達(dá)強(qiáng)陽性相比，NEC模型組PCNA陽性細(xì)胞率大幅降低，說明上皮組織的細(xì)胞增殖受到顯著抑制，而NMU治療后細(xì)胞增殖功能得到明顯增強(qiáng)，表明NMU對腸粘膜發(fā)揮較好的保護(hù)作用。

同時，正常新生大鼠腸道上皮細(xì)胞凋亡率極低，NEC模型組凋亡率顯著升高，而NMU治療后上皮細(xì)胞凋亡率得到了降低，表明NMU能很好的抑制腸道上皮細(xì)胞的凋亡?？傊?，NEC時腸道細(xì)胞凋亡增加，應(yīng)用NMU治療后能減輕腸道凋亡，促進(jìn)腸道增殖。