閻 利 劉 穎 張華北 陳建斌 李志琛 梅偉群 錢(qián)佳麗 歐陽(yáng)建

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)和糖尿病腎病(DN)是糖尿病的兩個(gè)主要微血管并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。糖尿病患者同時(shí)伴有DN的情況普遍，本研究應(yīng)用Label-free蛋白質(zhì)組定量技術(shù)，篩選DR伴DN患者血漿中差異表達(dá)蛋白，結(jié)合生物信息學(xué)分析，尋找DR、DN共病的機(jī)制和共同的干預(yù)靶點(diǎn)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究經(jīng)解放軍第903醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。選擇2型糖尿病患者14例，其中8例伴DR和DN(DNDR組)，6例不伴DN和DR(DM組)，兩組間患者的年齡、糖化血紅蛋白、病程的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。所有患者均符合1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，血糖控制穩(wěn)定。DNDR組納入標(biāo)準(zhǔn)：①依據(jù)2002年DR國(guó)際分期標(biāo)準(zhǔn)，雙眼眼底彩色照相檢查符合中度以上非增殖性DR(NPDR)或增殖性DR(PDR)；②依據(jù)2012年美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)(ADA)篩查和診斷標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定即時(shí)尿白蛋白/肌酐(uACR)≥30 mg/g，3個(gè)月內(nèi)3次ACR至少有2次升高。DM組納入標(biāo)準(zhǔn)：眼底照相除外DR，uACR<30 mg/g。排除標(biāo)準(zhǔn)：①高血壓病、冠狀動(dòng)脈性心臟病(簡(jiǎn)稱(chēng)冠心病)、慢性阻塞性肺疾病、惡性腫瘤、腦卒中；②1型糖尿病(T1DM)、妊娠糖尿病和特殊類(lèi)型糖尿病；③嚴(yán)重角膜病變、白內(nèi)障等影響眼底檢查；④葡萄膜炎、閉角型青光眼；⑤除DR外的其他視網(wǎng)膜疾??；⑥劇烈運(yùn)動(dòng)、發(fā)熱、尿路感染、腎病綜合征等其他原因?qū)е翧CR升高。查肌電圖、血糖、血脂、肝腎功能、纖維蛋白原、血壓、心電圖、心臟超聲、頸動(dòng)脈和下肢血管超聲，兩組患者上述檢查結(jié)果的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。所有入選患者均了解研究方案并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法 由深圳華大基因公司對(duì)14例患者的血漿標(biāo)本進(jìn)行質(zhì)檢和Label-free定量蛋白組學(xué)質(zhì)譜檢測(cè)，每份標(biāo)本檢測(cè)2次，總蛋白、肽段、譜圖數(shù)目均合格。

1.2.1 主要試劑和儀器 強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱(SCX)、Luna SCX購(gòu)自美國(guó)Phenomenex公司；質(zhì)譜儀(Triple TOF 5600)購(gòu)自美國(guó)AB CSIEX公司。酶聯(lián)免疫吸附Human PDI ELISA Kit(LM-PDI-Hu)購(gòu)自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；KRT1 ELISA試劑盒(H-EL-KRT1)購(gòu)自上海澤葉生物科技有限公司(ZYbscience)。

1.2.2 蛋白質(zhì)提取和定量 取100 μg血漿，按蛋白質(zhì)分離標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行操作，考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)定量。

1.2.3 SD電泳 使用12% SDS-PAGE。14份血漿樣本的電泳圖均合格。

1.2.4 蛋白質(zhì)酶解 每個(gè)樣品取100 μg蛋白。按蛋白∶酶為20∶1的比例加入胰蛋白酶，37 ℃酶解4 h。按上述比例再補(bǔ)加胰酶1次，37 ℃繼續(xù)酶解8 h。

1.2.5 SCX 應(yīng)用島津LC-20AB液相系統(tǒng)、UltremexSCX分離柱(4.6 mm×250 mm)對(duì)樣品進(jìn)行液相分離，經(jīng)篩選得到12個(gè)組分。

1.2.6 液相串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS) 通過(guò)島津LC-20AD納升液相色譜儀進(jìn)行分離。掃描模式為反射模式，分辨率≥30 000，每次掃描的粒子信號(hào)以4個(gè)通道分別記錄，共4次后合并轉(zhuǎn)化成數(shù)據(jù)。

1.3 生物學(xué)信息分析

1.3.1 MS/MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索和定量 應(yīng)用MASCOT搜索引擎檢索，所用數(shù)據(jù)庫(kù)為Swissprot人的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，鏈接地址為http:∥www.uniprot.org。應(yīng)用PeakView1.1中的Protein Quantitation 1.0 MicroApp軟件進(jìn)行定量，搜索相應(yīng)的人數(shù)據(jù)庫(kù)IPI_human_3.87.fasta，IPI數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果與Swissprot相匹配。

1.3.2 差異蛋白質(zhì)界定 取DNDR、DM組樣品豐度值的均數(shù)和中位數(shù)，分別計(jì)算兩組間各個(gè)蛋白質(zhì)相應(yīng)的比值。設(shè)定均數(shù)和中位數(shù)差異倍數(shù)上下調(diào)均≥2.5倍為差異表達(dá)蛋白質(zhì)。

1.3.3 基因本體(GO)、生化代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路注釋(Pathway) GO注釋包括3個(gè)本體，分別描述分子功能(GO-F)、生物過(guò)程(GO-P)、細(xì)胞組分(GO-C)。

1.3.4 GO、Pathway功能顯著性富集分析 應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與所有蛋白質(zhì)背景相比，在差異蛋白質(zhì)中顯著富集的GO條目，明確差異蛋白質(zhì)與哪些生物學(xué)功能顯著相關(guān)。以京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)中的Pathway為單位，找出與所有鑒定到的蛋白質(zhì)背景相比，在差異蛋白質(zhì)中顯著性富集的Pathway，通過(guò)Pathway顯著性富集確定差異蛋白質(zhì)參與的最主要的生化代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

1.3.5 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析使用 應(yīng)用Medusa.jar軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析，網(wǎng)址為http:∥ftp.ncbi.nlm.nih.gov/gene/GeneRIF/。

1.3.6 差異蛋白質(zhì)驗(yàn)證 采用ELISA法檢測(cè)兩組血漿中角蛋白1(KRT1)和蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)的表達(dá)，按試劑盒說(shuō)明在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室完成，驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 Label-free血漿蛋白質(zhì)譜檢測(cè)和鑒定 比較DNDR組與DM組樣品的豐度值，共篩選出差異表達(dá)蛋白質(zhì)49個(gè)，其中上調(diào)35個(gè)，下調(diào)14個(gè)。見(jiàn)表1。

表1 差異表達(dá)蛋白質(zhì)

2.2 GO注釋和富集分析 GO富集分析顯示，差異表達(dá)蛋白質(zhì)涉及22種GO-P，包括生物粘連、生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生、細(xì)胞過(guò)程、發(fā)育過(guò)程、建立定位、生長(zhǎng)、免疫系統(tǒng)過(guò)程、定位、運(yùn)動(dòng)、代謝過(guò)程、多生物過(guò)程、多細(xì)胞生物過(guò)程、生物過(guò)程的負(fù)調(diào)節(jié)、生物過(guò)程的正調(diào)節(jié)、生物過(guò)程的調(diào)節(jié)、再生、再生過(guò)程、對(duì)刺激的響應(yīng)、韻律過(guò)程、信號(hào)傳遞、單一生物過(guò)程，其中單一生物過(guò)程占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；涉及13種GO-C，包括細(xì)胞、細(xì)胞部分、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)、ECM部分、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞外區(qū)域部分、大分子復(fù)合物、膜、膜部分、腔上內(nèi)膜、類(lèi)核、細(xì)胞器、細(xì)胞器部分、抗氧化活性，其中細(xì)胞外區(qū)域占比最高；涉及9種GO-F，包括結(jié)合或催化活性、電子載體活性、酶調(diào)節(jié)劑活性、分子換能器活性、受體活性、結(jié)構(gòu)分子活性、載體活性，其中結(jié)合蛋白占比最高。

2.3 Pathway注釋和富集分析 Pathway富集到了多個(gè)代謝通路。Papilin(PAPLN)為上調(diào)最明顯的蛋白質(zhì)，但未富集到相關(guān)代謝通路。下調(diào)最明顯的PDI在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工Pathway，PDI和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶1(ERO-1)驅(qū)動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)二硫鍵的形成。ERO-l借助黃素腺嘌呤二核苷酸依賴(lài)性反應(yīng)將電子從PDI經(jīng)歷幾種硫醇-二硫化物交換反應(yīng)轉(zhuǎn)移到分子氧，氧的不完全還原導(dǎo)致超氧陰離子自由基形成，后者可以轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫或其他活性氧，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)折疊誘發(fā)的氧化應(yīng)激，進(jìn)而在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工中起作用。

2.4 差異蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 APOC2、CST3、ADAMTSL4、KRT1、GP5、IGJ、ECM1、CPS1、GAPDH、SERPINA3之間有相互作用。

2.5 ELISA法驗(yàn)證血漿KRT1、PDI水平 DNDR組血漿KRT1水平顯著高于DM組(P<0.05)，血漿PDI水平顯著低于DM組(P<0.05)，見(jiàn)表2。ELISA法驗(yàn)證結(jié)果與Label-free蛋白組質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果基本一致。

組別NKRT1 PDIDNDR85.78±0.46①2.55±0.21①DM6 2.02±0.1216.38±1.83

與DM組比較：①P<0.05

3 討 論

Christensen等[1]報(bào)道215例伴微量白蛋白尿的糖尿病患者中80%伴DR，El-Asrar等[2]的研究發(fā)現(xiàn)，87%的PDR患者伴有DN，表明糖尿病患者中DR與DN共患病的比例很高。DR和DN是致盲和終末期腎病最重要的病因之一，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。研究[3]結(jié)果表明，嚴(yán)格控制血糖可降低DR和DN的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，但并不能完全阻止其發(fā)生與進(jìn)展。臨床中也發(fā)現(xiàn)不少糖尿病患者持續(xù)高血糖卻不發(fā)生微血管并發(fā)癥。在單卵雙生雙胞胎中，DRDN有一致的患病率[4]，表明兩者的發(fā)生具有一定的遺傳傾向和家族聚集性。Label-free蛋白質(zhì)組定量技術(shù)根據(jù)質(zhì)譜的豐度來(lái)對(duì)肽段或蛋白質(zhì)進(jìn)行相對(duì)定量，能夠同時(shí)對(duì)多種蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，血漿中特定蛋白質(zhì)組及其濃度的變化對(duì)多基因病的發(fā)生和發(fā)展有著重要的預(yù)警作用。本研究以DR伴DN的患者作為研究對(duì)象，行血漿蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)，篩選DN伴DR的相關(guān)蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)DR、DN共病的血漿標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

本研究共篩選出49個(gè)DR伴DN差異表達(dá)蛋白質(zhì)，以均數(shù)和中位數(shù)差異倍數(shù)作為篩選條件，避免了因樣本量較少所致的數(shù)據(jù)偏倚。蛋白質(zhì)組研究中一般以差異倍數(shù)1.2～3.0倍作為篩選條件，為了在大量蛋白質(zhì)中過(guò)濾出差異顯著的蛋白質(zhì)，避免剔除有意義的蛋白質(zhì)，本研究選擇差異倍數(shù)上下調(diào)均≥2.5倍作為篩選標(biāo)準(zhǔn)[5]。本研究在GO功能富集的基礎(chǔ)上，通過(guò)GO、Pathway顯著性富集分析確定了相關(guān)蛋白質(zhì)的功能和參與的生化代謝途徑。差異表達(dá)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析顯示多個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)有相互作用，富集性分析發(fā)現(xiàn)一種蛋白質(zhì)可以參與多個(gè)GO或Pathway，也可以多種蛋白質(zhì)屬于一個(gè)GO或Pathway，表明DNDR的發(fā)生和發(fā)展是多種蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)果。在49個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)中，少數(shù)蛋白質(zhì)已有文獻(xiàn)報(bào)道與DR、DN有關(guān)，如RBP4與DR發(fā)病有關(guān)[6]， CysC與DN有關(guān)[7]，S100A9與DR、DN有關(guān)[8]，本研究也發(fā)現(xiàn)上述蛋白質(zhì)存在差異表達(dá)。

除上述蛋白質(zhì)以外，本研究還發(fā)現(xiàn)其他一些差異蛋白質(zhì)，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。KRT1存在于表皮的上層、內(nèi)皮細(xì)胞的表面和神經(jīng)母細(xì)胞瘤NMB7的細(xì)胞膜中，與皮膚的結(jié)構(gòu)完整性有關(guān)。KRT1可調(diào)節(jié)蛋白激酶C的活性，參與凝集素途徑的補(bǔ)體激活、纖維蛋白溶解、血管生成和對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)。KRT1基因變異可引起表皮松解性魚(yú)鱗病等皮膚病變。研究[9]發(fā)現(xiàn)，中國(guó)漢族人群KRT1的變異和KRT1的特異性多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡和系統(tǒng)性硬化癥有關(guān)。另有研究[10]發(fā)現(xiàn)，玻璃體內(nèi)注射雷珠單抗治療的PDR患者，玻璃體中KRT1水平升高。本研究發(fā)現(xiàn)DNDR組患者血漿中KRT1水平明顯升高，可能通過(guò)炎性反應(yīng)、纖維蛋白溶解、血管生成和對(duì)氧化應(yīng)激等機(jī)制參與DR、DN的發(fā)病。

ECM1是一種糖蛋白，參與許多生物過(guò)程，與乳腺癌、肝細(xì)胞癌等腫瘤有關(guān)。有學(xué)者收集了10例2型糖尿病患者的尿液樣本，分為正常、微量和大量白蛋白尿，將他們的尿蛋白質(zhì)組與10名健康個(gè)體進(jìn)行比較，在大量白蛋白尿患者尿液中檢測(cè)到ECM1[11]。還有研究發(fā)現(xiàn)，ECM1可影響系膜細(xì)胞增殖，但其與DR的關(guān)系鮮見(jiàn)報(bào)道，本研究檢測(cè)到DNDR組中ECM1上調(diào)，其在DN、DR中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

SERPINA3蛋白又名α1-抗胰蛋白酶，是人血漿中蛋白酶抑制劑——組織蛋白酶G的抑制劑，參與ECM蛋白質(zhì)的降解。SERPINA3可降低細(xì)胞間的黏附，抑制細(xì)胞凋亡，因此與惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)， SERPINA3蛋白是典型的急性炎性反應(yīng)蛋白質(zhì)，在炎性反應(yīng)時(shí)明顯增加[12]。研究發(fā)現(xiàn)，炎性反應(yīng)和ECM的重建在動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血中起作用。本研究中，DNDR組SERPINA3表達(dá)上調(diào)，且差異表達(dá)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析顯示SERPINA3與ECM有相互作用。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析提示，APOC2、CST3、ADAMTSL4、KRT1、GP5、IGJ、ECM1、CPS1、GAPDH、SERPINA3有相互作用，結(jié)合上述蛋白質(zhì)的功能分析，推測(cè)在DR伴DN的發(fā)生和發(fā)展中，上述蛋白質(zhì)可能通過(guò)致動(dòng)脈粥樣硬化、促進(jìn)新生血管形成、影響凝血系統(tǒng)、炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)等機(jī)制共同作用導(dǎo)致DN伴DR的發(fā)生和發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)最明顯的蛋白質(zhì)為Papilin，在Pathway富集性分析中未發(fā)現(xiàn)其參與代謝通路。目前對(duì)Papilin的研究較少，發(fā)現(xiàn)其主要存在于基底膜中。Papilins與幾種ECM成分和ADAMTS酶相互作用，對(duì)胚胎發(fā)育至關(guān)重要。下調(diào)最明顯的蛋白質(zhì)PDI是普遍存在的氧化還原酶，主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在蛋白質(zhì)折疊中起關(guān)鍵作用。血小板和內(nèi)皮細(xì)胞在血管損傷時(shí)分泌PDI，分泌的PDI激活脈管系統(tǒng)中的多個(gè)ECM，從而啟動(dòng)血栓形成[13]。PDI的過(guò)表達(dá)可以保護(hù)移植細(xì)胞免于缺氧和其他可能發(fā)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并因此增強(qiáng)其再生特性[14]。本研究DNDR組患者PDI表達(dá)明顯下調(diào)，其機(jī)制需進(jìn)一步研究。

本研究基于Label-free定量技術(shù)，結(jié)合生物信息分析，篩選出血漿中49個(gè)DN伴DR差異表達(dá)蛋白質(zhì)，這些差異蛋白質(zhì)提供了DR伴DN候選血漿標(biāo)志物，并可能成為干預(yù)的新靶點(diǎn)。DR伴DN的發(fā)生和發(fā)展是多種因素相互作用的結(jié)果，通過(guò)相互作用網(wǎng)絡(luò)和GO、Pathway富集分析，挑選出KRT1、ECM1、SERPINA3、PAPLN、PDI等差異表達(dá)蛋白質(zhì)可能在DR伴DN共同發(fā)病中發(fā)揮重要作用。本研究采用ELISA法對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)KRT1、PDI進(jìn)行驗(yàn)證的結(jié)果與質(zhì)譜分析結(jié)果一致，提示采用Label-free定量技術(shù)尋找DR伴DN相關(guān)血漿標(biāo)志物是有效和可行的。本研究樣本量較少，差異表達(dá)蛋白質(zhì)需要在擴(kuò)大樣本的患者中進(jìn)行驗(yàn)證后確定其在DN伴DR發(fā)病中的作用。