馬逢時，劉家水，談永進(jìn)

(安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 藥學(xué)系，安徽 安慶 246052)

中藥資源是我國的民族瑰寶，也是中華民族的國家戰(zhàn)略資源[1-2]。中藥資源的研究已有千年歷史，藥學(xué)研究者們致力于從中藥資源中尋找高效、安全的藥物成分。隨著中藥現(xiàn)代化進(jìn)程的加快，中藥資源的利用率得到一定的提高，各種現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)也逐漸引入中藥資源的開發(fā)利用之中，進(jìn)一步促進(jìn)了中藥的發(fā)展[3-6]。

將微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)與中藥資源相結(jié)合，可以解決中藥資源水溶性差、毒性強(qiáng)、活性低、資源匱乏等問題，微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)是推動中藥資源開發(fā)、中藥現(xiàn)代化的重要途徑[7-8]。微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件溫和、特異性較強(qiáng)、轉(zhuǎn)化產(chǎn)率較高，且綠色無污染。應(yīng)用此技術(shù)(主要是轉(zhuǎn)化體系中產(chǎn)生的酶系)對已存在天然中藥資源進(jìn)行轉(zhuǎn)化，相比傳統(tǒng)化學(xué)方法更高效，同時能夠在一定程度上模擬藥物代謝，從而獲得更多新的活性化合物[9-11]。微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)包括環(huán)氧化、脫水、加脫氫、酯化以及糖基化等反應(yīng)，與傳統(tǒng)中藥活性成分研究方法相比，在轉(zhuǎn)化速度和轉(zhuǎn)化質(zhì)量等方面均表現(xiàn)出了顯著優(yōu)勢，在中藥資源開發(fā)應(yīng)用中具有廣闊的前景。在新藥開發(fā)以及藥物代謝研究等方面均需要以對微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)的應(yīng)用為支持。

1 微生物轉(zhuǎn)化應(yīng)用于中藥的優(yōu)勢

微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)的本質(zhì)是利用微生物所產(chǎn)生的酶以外源性的中藥化合物作為底物進(jìn)行結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的過程。相比傳統(tǒng)化學(xué)轉(zhuǎn)化而言，微生物所催化的反應(yīng)是很多化學(xué)合成難以進(jìn)行的反應(yīng)。隨著當(dāng)代生物技術(shù)的發(fā)展，中藥的微生物轉(zhuǎn)化研究中引入溶劑工程、誘變和基因重組等新技術(shù)，這為新的活性中藥衍生物提供更多的可能性。微生物轉(zhuǎn)化特點(diǎn)，見表1。

表1 微生物轉(zhuǎn)化中藥的優(yōu)勢

2 微生物轉(zhuǎn)化對天然藥物資源應(yīng)用

2.1 皂苷類資源微生物轉(zhuǎn)化

皂苷類化合物具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用、抗腫瘤作用、抗炎、抗過敏、抗菌、抗病毒、降膽固醇及心血管活性等藥理活性[12-13]。研究表明微生物轉(zhuǎn)化法可有效改變皂苷糖鏈結(jié)構(gòu)，提高皂苷的生理活性[14-15]。對于皂苷類的微生物轉(zhuǎn)化，研究最多的是人參皂苷[16]，Quan等[17]利用從韓國傳統(tǒng)發(fā)酵食品泡菜中分離出的類消化乳桿菌LH4 (LactobacillusparalimentariusLH4)將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為藥理學(xué)活性更強(qiáng)的CK。以TLC，HPLC和NMR分析酶反應(yīng)，類消化乳桿菌LH4無細(xì)胞酶在30 ℃、pH 6.0反應(yīng)72 h的最佳條件下，1.0 mg/mL的人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化得到0.52 mg/mL的CK，具有88%的摩爾轉(zhuǎn)化率。無細(xì)胞酶水解人參皂苷Rb1的C-3和C-20的兩個葡萄糖基。人參皂苷Rb1的水解途徑為：人參皂苷Rb1→股藍(lán)總苷XVII和人參皂苷Rd→人參皂苷F2→CK，類消化乳桿菌LH4具有應(yīng)用于工業(yè)制備CK的潛力。利用微生物刺囊毛霉菌對20(R)-人參二醇進(jìn)行轉(zhuǎn)化共分離鑒定出了5個化合物，對抑制HSC-T6細(xì)胞增值的作用也增強(qiáng)[18]。Lee[19]通過比較新鮮紅參以及發(fā)酵紅參(微生物菌株與不加入微生物菌株)中20種人參皂苷含量的變化，研究發(fā)現(xiàn)，相比新鮮紅參，紅參發(fā)酵后，人參皂苷Re、Rg1和Rb1含量下降，但是人參皂苷Rh1、F2、Rg3和CY的含量增高，而且加入微生物菌株進(jìn)行發(fā)酵后酚類物質(zhì)和還原糖的含量最高。菌株S329屬于溜曲霉(Aspergillustamarii)，人參皂苷Re轉(zhuǎn)化人參皂苷Rh1的轉(zhuǎn)化率為27.65%[20]。目前人參大多采用口服給藥，以傳統(tǒng)方法明確其體內(nèi)腸道代謝過程具有一定的困難性，采用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)模擬體內(nèi)代謝過程對明晰藥物療效和作用機(jī)理有很大意義。

此外，應(yīng)用微生物技術(shù)轉(zhuǎn)化絞股藍(lán)皂苷[21]、積雪草皂苷[22]、薯蕷皂苷元[23]、和芍藥苷[24]、連翹苷[25]、虎杖苷等[26]，以提高其皂苷含量、發(fā)現(xiàn)新化合物和提高作用效果的研究也多有報道。

2.2 黃酮類資源微生物轉(zhuǎn)化

黃酮類成分在體內(nèi)外具有不同的生物活性，但是由于天然黃酮資源限制以及混合物分離的難度，黃酮類成分的研究受到限制，應(yīng)用微生物技術(shù)轉(zhuǎn)化天然黃酮產(chǎn)物是目前黃酮類成分研究的新方向[27-28]。Jones等[29]通過大腸桿菌復(fù)合羥化酶HpaBC將柚皮素高效轉(zhuǎn)化為圣草酚，此外HpaBC能夠高效轉(zhuǎn)化各種鄰羥基黃酮類化合物和黃酮類衍生物。腸道菌群可能存在能夠?qū)⒋蠖管赵D(zhuǎn)化為雌馬酚的細(xì)菌，雌馬酚比大豆苷元生物學(xué)活性更強(qiáng)[30]。利用外源菌株改變大鼠雌馬酚產(chǎn)生能力，擬桿菌門細(xì)菌在轉(zhuǎn)化過程中起著十分重要的作用[31]。Parajuli等[32]在大腸桿菌BL21(DE3)發(fā)現(xiàn)區(qū)域?qū)Ｒ惶腔D(zhuǎn)移酶，其能轉(zhuǎn)化非瑟酮得到非瑟酮-3-O-葡萄糖苷和非瑟酮-3-O-鼠李糖苷，轉(zhuǎn)化率高達(dá)99%，另外大腸桿菌BL21(DE3)轉(zhuǎn)化槲皮素、山萘酚、楊梅素等黃酮醇到各自糖苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%以上。Wang等[33]從南京土壤中分離得到CGMCC 4913，其在10%乙醇條件下將葛根素轉(zhuǎn)化為7-O-果糖苷的葛根衍生物，轉(zhuǎn)化率達(dá)97.6%，其衍生物的水溶性和抗氧化活性得到較大改進(jìn)[34]。

多甲氧基黃酮 (PMF)是主要活性黃酮，它表現(xiàn)出抗癌、抗氧化損傷等多種生物活性。Kim等[35]首次以活性為向?qū)ШY選PMF代謝相關(guān)的人體腸道細(xì)菌來研究PMF的生物轉(zhuǎn)化和體外表征，最終篩選出Blautia屬M(fèi)RG-PMF1菌種，MRG-PMF1將PMF代謝至對應(yīng)的去甲基化黃酮，其中5，7-二甲氧基黃酮和5，7，4’-三甲氧基黃酮分別代謝為5，7-二羥基黃酮 (白楊素)和5，7，4’-三羥基黃酮 (芹菜素)，C-7位甲氧基優(yōu)先水解。此外，MRG-PMF1還具有去糖基化活性，轉(zhuǎn)化生成相應(yīng)的糖苷配基，該菌株的發(fā)現(xiàn)對于我們了解黃酮類化合物在人體腸道代謝過程以及發(fā)現(xiàn)新的生物活性黃酮化合物具有很大意義。微生物發(fā)酵處理方法可以改善酚酸、黃酮含量以及清除自由基的能力。比較芽孢桿菌菌種發(fā)酵、烤、蒸等工藝后菝葜葉的總酚酸和總黃酮的含量，結(jié)果表明微生物發(fā)酵過后菝葜葉的總酚酸和總黃酮含量顯著提高，尤其是釀酒酵母和米曲霉發(fā)酵過后氧自由基吸收能力最高[36]。雌性啤酒花球果廣泛應(yīng)用于釀造工業(yè)中，目前研究發(fā)現(xiàn)其對于制藥工業(yè)也有較大的應(yīng)用價值，啤酒花含有大量黃酮類成分，其具有抗癌、抗氧化、抗微生物、抗炎和雌激素作用。尤其啤酒花球果黃酮類化合物的生物轉(zhuǎn)化以及在胃腸微生物群相關(guān)的微生物酶促反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了該黃酮類成分的催化和轉(zhuǎn)換，所得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在制藥工業(yè)中具有很大的應(yīng)用潛力[37]。

鑒于異黃酮及其相關(guān)糖復(fù)合物在人類健康的重要作用，對于其酶促轉(zhuǎn)化引起藥學(xué)工作者相當(dāng)大的興趣。You等[38]將乳雙歧桿菌AD011中的β-葡萄糖苷酶基因轉(zhuǎn)載至兩歧雙歧桿菌BGN4中，構(gòu)建β-葡糖苷酶的活性和熱穩(wěn)定性高表達(dá)的重組兩歧雙歧桿菌B919G菌株，B919G粗酶提取液能在4 h內(nèi)轉(zhuǎn)化黃豆苷和染料木苷，其菌體本身轉(zhuǎn)化豆奶中黃豆苷和染料木苷也可在6 h內(nèi)完成，相比D011轉(zhuǎn)化效率更高。B919G菌株的構(gòu)建能將豆奶發(fā)酵產(chǎn)生更高價值的異黃酮類成分，同時也保留了本身益生菌的功效。Du等[39]也從新鞘氨醇桿菌GX9中分離得到一種新穎的β-葡糖苷酶，對黃豆苷和染料木苷的水解活性很高。革蘭氏陰性厭氧微生物MRG-1顯示去糖基化和還原黃豆苷的高活性，能定向轉(zhuǎn)化異黃酮、大豆苷元、染料木素、羥基異黃酮和芒柄花素，產(chǎn)生相應(yīng)的黃酮衍生物[34]。由于對食品安全和環(huán)境問題，黃酮類化合物生物合成的安全、廉價和基質(zhì)可再生性問題正日益引起人們的注意。Wu等[41]對L-酪氨酸合成(2S)-柚皮素的合成途徑進(jìn)行優(yōu)化以及從D-葡萄糖合成(2S)-柚皮素的異源途徑的構(gòu)建，提高了在大腸桿菌中合成(2S)-柚皮素的合成效率，實(shí)現(xiàn)了直接從D-葡萄糖合成(2S)-柚皮素的合成，為經(jīng)濟(jì)發(fā)展過程中微生物生產(chǎn)黃酮類化合物提供了新的方法。

2.3 生物堿類資源微生物轉(zhuǎn)化

生物堿是植物體內(nèi)一類含氮有機(jī)化合物，生物堿大多有較復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，多呈堿性，大多具有顯著的生理活性，如鎮(zhèn)痛、解痙、抗菌消炎、止咳平喘、抗癌等作用。利用微生物轉(zhuǎn)化對生物堿結(jié)構(gòu)改造或者合成其他藥物活性成分，有利于發(fā)現(xiàn)新的藥用價值的生物堿衍生物。微生物轉(zhuǎn)化涉及羥基化反應(yīng)、氧化反應(yīng)、水解反應(yīng)、去甲基反應(yīng)等。

原小檗堿是中藥植物中豐富的生物活性分子，通過應(yīng)用代謝工程與合成生物學(xué)策略可以將簡單的芐基異喹啉轉(zhuǎn)換至復(fù)雜的生物堿原小檗堿，通過優(yōu)化釀酒酵母等載體中生物合成途徑，實(shí)現(xiàn)原小檗堿類生物堿的高效合成[42]，這也為利用酶法合成或微生物細(xì)胞工廠從頭合成其他高價值的化合物奠定基礎(chǔ)。煙堿是在煙草中的主要生物堿，也是在煙草廢棄物中主要的有毒化合物。生物修復(fù)采用高效有力的微生物特定的酶和生化途徑降解煙草生物堿等劇毒雜環(huán)化合物，是清理環(huán)境污染最有前途的方法。煙堿代謝轉(zhuǎn)化后，這些嗜酸性微生物使用煙堿作為唯一碳、氮和其生長的能量來源[43]。煙堿可以由細(xì)菌通過經(jīng)吡啶途徑或吡咯烷途徑降解。6-羥基-3-琥珀吡啶(HSP)羥化酶是兩通路中共同的中間關(guān)鍵酶，其將煙堿轉(zhuǎn)化為2，5-二羥基吡啶[44]。Tang等[45]對惡臭假單胞菌降解煙堿的過程進(jìn)行解析，識別參與降解過程的煙堿代謝酶，3-琥珀吡啶轉(zhuǎn)化為6-羥基-3-琥珀吡啶是molybdopeterin結(jié)合氧化酶、molybdopterin脫氫酶和鐵氧還蛋白共同參與的結(jié)果，此外還發(fā)現(xiàn)了煙堿氧化還原酶 (nicA2)，并進(jìn)行基因的克隆表達(dá)。這對自然界中有毒化合物的降解有很大推動作用。由心果堿生物合成罌粟嗎啡需要P450氧化還原酶的參與[46]。

2.4 其他類型化合物微生物轉(zhuǎn)化

海蔥提取物應(yīng)用于心臟疾病的治療已有幾百年的歷史。德國順勢藥典中就有通過發(fā)酵步驟制備海蔥提取物的制備過程，Knittel等研究發(fā)現(xiàn)，海蔥存放一年后，由于微生物和植物酶活性下降，總的蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯含量減少了50%，蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯苷代謝和降解的速率也因糖苷配基結(jié)構(gòu)的差異而不同。在發(fā)酵過程中，黃酮類成分也發(fā)生脫水代謝反應(yīng)，這為醫(yī)療發(fā)酵海蔥提取強(qiáng)心苷類和酚類化合物以及兩者的穩(wěn)定性提供了有價值的信息[47]。納豆枯草芽孢桿菌能增加決明子活性成分蒽醌苷元的含量，從而增強(qiáng)決明子臨床療效[48]。Hadibarata等[49]以白腐真菌蜜環(huán)菌屬F022轉(zhuǎn)化蒽醌得到二氨基蒽醌、苯甲酸、2-羥基-3-萘甲酸和香豆素4種化合物，因此F022可應(yīng)用于多環(huán)芳烴的生物修復(fù)。Paludo等[50]以小克銀漢霉轉(zhuǎn)化β-拉帕醌獲得2種β-拉帕醌的糖基化衍生物，其抗乳腺癌活性雖然降低，但是細(xì)胞毒性也明顯降低。

3 結(jié)語

近年來中藥資源得到較大利用，其在分離純化、藥理研究以及加工技術(shù)等方面都取得了一定的進(jìn)展，但是天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在自然界中含量也有限，有些化合物利用化學(xué)合成并不能完成，或者其成本較大，污染也比較嚴(yán)重。利用微生物轉(zhuǎn)化可以有效制備化學(xué)合成難易完成的新型化合物。微生物轉(zhuǎn)化成為目前藥學(xué)研究者關(guān)注的熱點(diǎn)，但是要實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)還有一定難度，微生物群基因庫的探索、相關(guān)關(guān)鍵酶的合理設(shè)計、發(fā)酵和生物轉(zhuǎn)化介質(zhì)進(jìn)行深入研究探索，能提高生物轉(zhuǎn)化的效率。有的化合物代謝之后才能發(fā)揮藥效，利用微生物對化合物進(jìn)行代謝轉(zhuǎn)化研究，可以避免體內(nèi)代謝的損失。尋找耐酸堿、耐高壓和熱穩(wěn)定性好的極端微生物，結(jié)合高通量篩選技術(shù)平臺篩選高效新型生物催化劑，對微生物轉(zhuǎn)化底物選擇性及立體選擇性規(guī)律、生物轉(zhuǎn)化機(jī)制進(jìn)行深入研究，以能定向獲得目的產(chǎn)物或者發(fā)現(xiàn)高效的創(chuàng)新藥物。中藥微生物轉(zhuǎn)化研究對中藥資源的開發(fā)利用意義重大，通過對已有中藥資源微生物轉(zhuǎn)化處理，可以衍生大量的化合物，為新藥物的篩選奠定基礎(chǔ)，對藥物的研發(fā)和生產(chǎn)具有重要的理論價值和應(yīng)用前景。