梁翠 方英倫 趙芳 侯宇希 謝謹(jǐn)捷 馬駿 趙麗云

隨著我國二胎政策的開放及高齡產(chǎn)婦的增多，妊娠合并心臟的病患呈逐年增多趨勢，而妊娠合并肺動(dòng)脈高壓是妊娠期致死率最高的疾病之一。肺動(dòng)脈高壓患者就診時(shí)間較晚，臨床孕早中期資料不足，本研究通過超聲心動(dòng)圖評(píng)估野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠在不同妊娠時(shí)期的右心功能，彌補(bǔ)臨床資料的不足，為臨床診治該類患者提供參考依據(jù)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 6 周，雌性，SD 大鼠，購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，依照首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)與使用指南，飼養(yǎng)于北京安貞醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心。提供充足的食物和水源，飼養(yǎng)環(huán)境為24 h 的亮暗光照循環(huán)，空氣濕度50% ～60%，溫度20 ～22 ℃。由于野百合堿注射后大鼠的存活率下降及誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓大鼠妊娠的成功率較低，故采用隨機(jī)數(shù)字分組法將55 只大鼠不對(duì)等分為三組：①肺動(dòng)脈高壓組(A 組，n=18)，②妊娠合并肺動(dòng)脈高壓組(B 組，n=25)，③空白對(duì)照組(C 組，n=12)。

2.建立肺動(dòng)脈高壓模型 適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，A組和B 組大鼠頸背部注射野百合堿60 mg/kg(MCT Sigma-Aldrich，美國)，空白對(duì)照組注射同等容量的鹽酸氯化鈉溶液。

3.誘導(dǎo)PAH 大鼠 妊娠在注射MCT 2 周后，將B 組雌鼠與雄鼠 2 ∶1 ～3 ∶1 合籠，于每晚 20：00 到早8：00 合籠，早上結(jié)束合籠時(shí)觀察陰栓，觀察到陰栓則結(jié)束合籠，否則繼續(xù)合籠，日期不超過3 d。

4.超聲監(jiān)測 觀察到陰栓的當(dāng)天記為妊娠第一天。在 B 組誘導(dǎo)妊娠前 1 天(T0)，妊娠第 3 天(T3)、第 9 天(T9)、第 15 天(T15)對(duì)各組大鼠進(jìn)行麻醉(10%水合氯醛0.3 mL/100 mg)，當(dāng)翻正反射消失后，胸前區(qū)脫毛，仰臥位固定，用小動(dòng)物超聲診斷儀(VisualSonics：VEVO2100)，探頭頻率為 30 MHz，將取樣容積置于肺動(dòng)脈瓣上測量肺動(dòng)脈瓣上流速(pulmonary valve velocity，PVV)，對(duì)頻譜進(jìn)行分析，測量加速時(shí)間(acceleration time，AT)、減速時(shí)間 (deceleration time，DT)，加速度 (acceleration speed，AS)，減速度(deceleration speed，DS)，肺動(dòng)脈內(nèi)徑(pulmonary artery inner diameter，PAID)，主動(dòng)脈內(nèi)徑(aortic diameter，AD)，右心室游離壁厚度(RVWT)及右心室舒張末期內(nèi)徑(RVEDD)；在主動(dòng)脈根部大動(dòng)脈短軸切面測量舒張期主動(dòng)脈內(nèi)徑(AD)；計(jì)算其比值(PAID/AD)。每一超聲測定值取3 個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期測量的均值。

5.體肺循環(huán)壓力測定 在B 組大鼠妊娠第18天，各組大鼠禁食水12 h 后經(jīng)10%水合氯醛0.3 mL/100 mg 麻醉，待翻正反射消失后，調(diào)整小動(dòng)物呼吸機(jī)(奧爾科特 ALC-V8，上海)潮氣量：2 mL，頻率50 次/min，吸呼比 1 ∶1，氣管切開后行機(jī)械通氣。后左股動(dòng)脈穿刺置管(BD Insyte-W 24G，美國)測量股動(dòng)脈壓力(SAP)，開胸后直視下經(jīng)右心室穿入肺動(dòng)脈并置管，測量肺動(dòng)脈壓力(PAP)(換能器：Edwards，美國；監(jiān)護(hù)儀：Spacelabs-YZB/USA3926)。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均通過SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，超聲測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析，成對(duì)比較采用LSD 法，股動(dòng)脈和肺動(dòng)脈壓力采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK 法。非正態(tài)分布資料采用中位數(shù)(M)及四分位數(shù)間距(P25，P75)表示。采用Kruskal-Wallis H 秩和檢驗(yàn)，兩兩比較采用Nemenyi法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.動(dòng)物存活情況 超聲各測量時(shí)點(diǎn)的動(dòng)物存活情況如表1。在T18 時(shí)間點(diǎn)，麻醉后最后分組情況①A 組(n=9)，②B 組(n=7)，③C 組(n= 11)。除去B 組未妊娠的13 只，在整個(gè)研究過程中A 組死亡 9 只，B 組死亡 5 只，C 組亡 1 只。

圖1 肺動(dòng)脈高壓大鼠超聲測量值； 圖2 母鼠子宮內(nèi)胎鼠

表1 三組大鼠各測量時(shí)點(diǎn)的超聲指標(biāo)值[，M(QR)]

表1 三組大鼠各測量時(shí)點(diǎn)的超聲指標(biāo)值[，M(QR)]

時(shí)間 組別 PVV/(cm/s) AT/ms RVWT/mm RVEDD/mm PAID/mm AD/mm PAID/AD T0 A 組(n=17) 791±112 23.7±2.42 0.429±0.088 3.44±0.838 2.83±0.0754 2.58±0.678 1.10(1.02，1.16)B 組(n=23) 780±73.0 24.8±1.17 0.427±0.051 3.52±0.355 2.94±0.0775 2.67±0.0540 1.11(1.06，1.17)C 組(n=12) 870±97.9 27.3±4.61 0.415±0.053 2.84±0.449 2.62±0.0970 2.80±0.0600 0.97(0.96，1.09)T3 A 組(n=17) 776±72.0 22.8±2.84 0.487±0.102 3.57±0.601 2.96±0.0676 2.59±0.0791 1.16(1.10，1.24)B 組(n=10) 727±94.5 23.7±0.67 0.464±0.048 3.60±0.267 3.11±0.0962 2.76±0.0729 1.12(1.10，1.20)C 組(n=12) 875±74.2 26.9±4.08 0.424±0.046 2.90±0.366 2.68±0.0698 2.81±0.0560 0.99(0.91，1.01)T9 A 組(n=17) 661±90.7 19.5±2.25 0.699±0.215 3.98±0.547 3.00±0.106 2.58±0.0694 1.17(1.02，1.35)B 組(n=10) 688±95.5 21.8±1.34 0.497±0.078 3.66±0.346 3.05±0.119 2.84±0.110 1.12(0.97，1.27)C 組(n=12) 835±128 27.8±3.87 0.448±0.062 2.78±0.393 2.74±0.0637 2.81±0.0961 0.98(0.92，1.03)T15 A 組(n=14) 559±119 17.7±3.25 0.759±0.245 4.71±1.134 3.02±0.116 2.45±0.100 1.15(1.08，1.38)B 組(n=8) 695±82.4 21.4±2.59 0.567±0.155 3.75±0.548 3.26±0.077 2.95±0.0733 1.10(1.03，1.15)C 組(n=12) 872±84.8 27.6±5.86 0.402±0.070 2.91±0.400 2.68±0.0513 2.77±0.0994 0.96(0.87，1.06)

2.超聲心動(dòng)圖測量數(shù)值及比較結(jié)果 超聲心動(dòng)圖示肺動(dòng)脈高壓組大鼠出現(xiàn)PVV 降低、AT 減少，PAID/AD、RVWT 和 RVEDD 增加，見圖1。妊娠合并肺動(dòng)脈高壓組大鼠子宮內(nèi)可見胎鼠(圖2)，證實(shí)建立妊娠合并肺動(dòng)脈高壓模型。三組大鼠不同測量時(shí)點(diǎn)的超聲指標(biāo)見表1，三組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)成對(duì)比較結(jié)果見表2，各時(shí)點(diǎn)三組間成對(duì)比較見表3。

表2 三組內(nèi)各時(shí)點(diǎn)間成對(duì)P 值比較的結(jié)果

表3 各時(shí)點(diǎn)三組間成對(duì)P 值比較的結(jié)果

3.三組內(nèi)各測量時(shí)點(diǎn)比較的結(jié)果及變化趨勢A 組大鼠隨時(shí)間的進(jìn)展，其PVV 明顯降低、AT 明顯減少、RVWT 和 RVEDD 明顯增加；B 組大鼠隨妊娠天數(shù)的增加，PVV 降低、AT 減少的程度較A 組有所緩解，其 T9 較 T0 的 PV 明顯降低，T9、T15 較 T0 的AT 明顯減少，T9 較 T3 的 AT 明顯減少，RVWT 和RVEDD 無明顯差異；C 組隨時(shí)間增加各測量值無明顯差異(表2)。各組隨時(shí)間進(jìn)展超聲測量指標(biāo)的變化趨勢不同(肺動(dòng)脈瓣上流速F=10.565，P＜0.05；加速時(shí)間F=28.844，P＜0.05；右心室游離壁厚度F=6.651，P＜0.05，圖3～6)。

圖3 各組PVV 變化趨勢；圖4 各組AT 變化趨勢

圖5 各組PRVWT 變化趨勢；圖6 各組RVEDD 變化趨勢

4.各測量時(shí)點(diǎn)三組間比較的結(jié)果 T0 時(shí)間點(diǎn)，三組間 PVV、AT、RVWT、RVEDD 無明顯差異，而 A組、B 組較 C 組的 PAID/AD 明顯增加。T3 時(shí)間點(diǎn)，A 組較 C 組 PVV 降低、AT 延長、RVEDD 增加、PAID/AD 升高，B 組較 C 組 PVV 降低、RVEDD 增加、PAID/AD 升高。T9 時(shí)間點(diǎn)，A 組較 B 組RVEDD 增加，A 組較 C 組 PVV 降低，AT 延長、RVWT 增厚、RVEDD 增加、PAID/AD 升高，B 組較 C組的 PVV 降低、AT 延長、RVEDD 增加。T15 時(shí)間點(diǎn)，A 組較 B 組 PVV 降低、RVEDD 增加，A 組較 C組 PVV 降低，AT 延長、RVWT 增厚、RVEDD 增加、PAID/AD 升高，B 組較 C 組的 PVV 降低、AT 延長、PAID/AD 升高。

5.妊娠晚期股動(dòng)脈和肺動(dòng)脈壓力的比較 三組間的 SAP 無明顯差異。A 組(34.11±4.62)、B 組(28.71±4.19)較 C 組(18.45±3.01)PAP 明顯升高；且B 組較A 組明顯降低(圖7)。

討 論

由于妊娠合并肺動(dòng)脈高壓患者的生理狀態(tài)不斷改變，對(duì)孕婦及胎兒造成嚴(yán)重影響，給臨床工作帶來了巨大挑戰(zhàn)[1-2]，而目前尚未有一套完整的處理流程，因此亟需大量針對(duì)此類疾病的研究。目前監(jiān)測肺動(dòng)脈高壓的金標(biāo)準(zhǔn)是右心導(dǎo)管，但技術(shù)創(chuàng)傷大，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活率低，不利于后續(xù)觀察，本研究首次采用多普勒超聲來評(píng)價(jià)妊娠對(duì)野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠右心功能的影響[3-4]，具有簡便、快捷及重復(fù)性好等優(yōu)勢[5-8]，證實(shí)超聲心動(dòng)圖可以代替右心導(dǎo)管診斷和評(píng)估肺動(dòng)脈高壓。

圖7 各組SAP 和PAP 比較

由于肺動(dòng)脈高壓使右心后負(fù)荷加重，超聲心動(dòng)圖常表現(xiàn)為PVV 降低，峰值前移，呈匕首狀，AT 縮短，DT 延長，RVWT 增厚，RVEDD 增加，PAID 增寬，嚴(yán)重者可出現(xiàn)室間隔左移，左右心射血分?jǐn)?shù)減少，右心衰竭[8]。大鼠注射野百合堿后，超聲心動(dòng)圖出現(xiàn)上述典型現(xiàn)象，且在妊娠第18 天，直視下經(jīng)右心室穿刺進(jìn)入肺動(dòng)脈測壓顯示PAP 明顯增加，母鼠子宮內(nèi)可見胎鼠，證實(shí)本研究成功建立妊娠合并肺動(dòng)脈高壓模型。

本研究發(fā)現(xiàn)野百合堿使大鼠右心功能不斷惡化，而在妊娠后，惡化程度減輕，包括RVWT(T9)、PVV(T15)、RVEDD(T15)的惡化較單純肺高壓組明顯減輕。在妊娠第18 天，妊娠合并肺動(dòng)脈高壓大鼠的PAP 較肺高壓組降低，右心后負(fù)荷減少，導(dǎo)致右心功能惡化減輕，且肺動(dòng)脈高壓組病死率較妊娠合并肺高壓組更高，證實(shí)妊娠過程對(duì)PAH 存在保護(hù)作用。在妊娠期，母體內(nèi)雌激素不斷增加，雌激素可通過受體啟動(dòng)eNOS 酶表達(dá)導(dǎo)致NO 合成酶增加、抑制內(nèi)皮素ET-1 mRNA 的表達(dá)、促進(jìn)前列環(huán)素PGI2的增加，保護(hù)和調(diào)節(jié)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞舒縮功能、促進(jìn)血管擴(kuò)張及抑制平滑肌細(xì)胞增殖，改善肺動(dòng)脈高壓中的血流動(dòng)力學(xué)和氣體交換[9]。故本研究結(jié)果可能與孕期雌激素的增長有關(guān)。目前研究表明外源性雌激素對(duì)肺動(dòng)脈高壓有保護(hù)作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明雌激素能抑制 PAH 的進(jìn)展，對(duì)低氧或 MCT 誘導(dǎo)的PAH 均能起到緩解作用，改善PAH 嚴(yán)重程度，緩解右心室肥厚[10-12]，卵巢切除術(shù)后會(huì)使PAH 惡化[13]，且Olsson 等[14]發(fā)現(xiàn)雌激素可以增加右心室射血分?jǐn)?shù)來治療肺動(dòng)脈高壓。

Lahm 等[15]發(fā)現(xiàn)雌激素也能促進(jìn)PAH 的發(fā)生和進(jìn)展，流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)女性PAH 患病率比男性高，但女性患者預(yù)后較好，雌激素對(duì)肺血管的保護(hù)作用與肺動(dòng)脈高壓患者中女性多發(fā)相矛盾[14.16]?？赡苁窃擃惢颊叽萍に厥荏w不足或者細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)異常，減弱了雌激素對(duì)肺血管系統(tǒng)的保護(hù)作用，也可能與血栓形成有關(guān)。在妊娠期，血中雌激素的微小波動(dòng)也能對(duì)血管功能產(chǎn)生巨大影響，雌激素對(duì)肺血管的影響較復(fù)雜且尚不明確[17]。

PAH 患者在妊娠后，出現(xiàn)血容量增加、心輸出量增加、血管阻力降低等的生理改變[18]，大量臨床資料統(tǒng)計(jì)顯示，死亡事件多發(fā)生于終止妊娠之后，分娩后的第一周內(nèi)和直到產(chǎn)后6 周被認(rèn)為是臨床上最危險(xiǎn)的時(shí)間段，比妊娠期病死率高[17]，是否與分娩后雌激素水平下降有關(guān)不得而知。本研究結(jié)果的出現(xiàn)可能是在早中期雌激素的保護(hù)作用可以拮抗妊娠對(duì)心臟的沖擊作用，而在晚期雌激素的保護(hù)作用不足以拮抗心臟負(fù)荷的加重。

本研究的局限性是注射野百合堿后隨時(shí)間進(jìn)展大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的肺高壓，麻醉后體循環(huán)壓力降低，低于肺循環(huán)壓力，出現(xiàn)肺動(dòng)脈高壓危象甚至右心衰竭[17]，超聲觀察可見右心室顯著變大，室間隔向左移動(dòng)，左右心室射血減少，導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)死亡。由于個(gè)體差異，大鼠的心率對(duì)麻醉藥的反應(yīng)不同導(dǎo)致注射野百合堿后大鼠的DT、AS 和DS 與空白組無明顯差異。在之后的實(shí)驗(yàn)過程中，應(yīng)選擇合適的麻醉藥及注意監(jiān)測麻醉深度，減少大鼠病死率。

綜上，妊娠過程對(duì)PAH 存在保護(hù)作用，可以一定程度上緩解野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠右心功能的惡化，為進(jìn)一步研究雌激素對(duì)妊娠合并肺動(dòng)脈高壓患者的保護(hù)作用及雌激素的替代療法奠定基礎(chǔ)。