羅阿東　王麗平　任艷玲　蔡秋　王艷

摘要針對辣椒中轉基因成分建立快速、高效、準確的實時熒光PCR檢測方法，以縮短檢測周期，提高檢出率。結果表明，針對轉基因辣椒的內源基因CaATLI和外源基因CMV建立的檢測方法，具有很好的特異性，二者檢測靈敏度均可達0.01%。本研究建立的檢測方法特異性、靈敏度和準確度高，也比較方便快速，同時使用的是全部閉管操作，大大降低了普通PCR帶來的污染，為轉基因辣椒的檢測提供了新的檢驗方法。

關鍵詞 轉基因辣椒;實時熒光PCR檢測方法;CaATLI基因;CMV基因

中圖分類號 S641.3

文獻標識碼 A

文章編號 1007-5739（2019）05-0067-03

辣椒是人們生活中必不可少的蔬菜作物，具有藥理、經濟、食用、營養(yǎng)等方面的價值。我國辣椒制品種類繁多，如油辣椒、糟辣椒、辣椒醬等，辣椒制品的多樣化推動了我國辣椒產業(yè)經濟的發(fā)展辣椒在世界各地廣泛種植，但同時也面臨著連作障礙、土壤傳播疫病、生長條件產量及質量等諸多問題，人們借助轉基因技術以及辣椒分子育種技術，對辣椒的生長條件、栽培技術、病蟲害防治等方面進行了研究。

隨著轉基因作物及其產品的大規(guī)模商業(yè)化，越來越多的轉基因農產品被制作成為人類消費的食品，轉基因食品在傳統(tǒng)食品市場中的份額正不斷加大，逐步走上餐桌，進入人們的食物鏈。由于其安全性及對人類健康和生態(tài)環(huán)境的潛在威脅受到國際社會和廣大民眾的廣泛關注B，作物轉基因成分的檢測越來越受到重視。

目前，對于轉基因成分檢測主要是針對重組DNA的核酸檢測，如聚合酶鏈式反應（PCR），包括定性PCR、多重PCR和實時熒光PCR等。其中，實時熒光PCR作為目前主要的檢測方法，有效避免了普通PCR方法存在的檢測靈敏度不高、費時且容易造成交叉污染等缺點，確保了檢測結果的快速、準確。

本文通過應用實時熒光PCR技術對抗CMV（Cucumber?mosaic?virus，黃瓜花葉病毒）轉基因辣椒進行檢測，旨在建立一種簡便、快速的辣椒轉基因成分檢測方法，以期為消費者食品安全及我國農業(yè)轉基因生物的監(jiān)管提供有力的技術支持。

1材料與方法

1.1試驗材料與儀器

1.1.1材料。轉基因辣椒陽性標準物質，非轉基因辣椒，非轉基因玉米、大豆、水稻油菜籽、番茄。

1.1.2試劑。Premix?Ex Taq（Probeq?PCR）（熒光PCR反應液）、MiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKit（DNA提取試劑）、引物及TaqMan探針，均購買于寶日醫(yī)生物技術有限公司。

1.1.3儀器。實時熒光PCR儀（7500Fast，美國Applied?Bio-systems）、高速冷凍離心機（Microfuge22R?Centrifuge，美國Beckman Coulter）、超純水儀（Milli?Q，美國Millipore）核酸蛋白測定儀（Nano?Drop2000，美國Thermo?Scientific）、冷凍研磨儀（MM400，德國Retsch）、移液器、渦旋振蕩器恒溫金屬浴、生物安全柜等。

1.1.4引物及探針。根據GenBank中轉基因辣椒的CaATLI（Capsicumannum?AT-hooklgene，編碼辣椒AT一hook1蛋白基因）和CMV基因序列，利用Primer?Express軟件設計引物和TaqMan探針序列，弓物和探針序列及擴增長度見表1，探針和引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2試驗方法

1.2.1DNA提取。取2%CTAB抽提緩沖液于65C金屬浴中預熱，取樣品約0.3g置于冷凍研磨儀（液氮處理）研磨，加入2%CTAB抽提緩沖液700μL，輕輕攪動，將磨碎液倒人1.5mL滅菌離心管中，于65C金屬浴加熱振蕩10min，加人5mol/L醋酸鉀溶液5μL，混勻，再金屬浴20min;取出離心管后放置在冰上，加人等體積的氯仿/異戊醇（24：1），輕輕來回顛倒，充分混勻;然后放人4C高速冷凍離心機中（12000r/min）離心15min，吸取上清液500μL放入另一離心管中，加入等體積的異戊醇，顛倒混勻;12000r/min離心10min后，棄上清，加入75%乙醇500μL，輕彈離心管，使沉淀與管底的DNA塊狀物浮游于液體中，放置30min，使DNA塊狀物上的不純物溶解;12000r/min離心5min后棄去上清，加入等量75%乙醇再洗30min，12000r/min離心5min后，棄上清液，并將離心管倒立于濾紙之上，自然風干，加入50μLTE溶液，使DNA溶解，利用核酸蛋白測定儀測定樣品DNA的OD260與OD280，其余于-20C冰箱冷凍保存待用。1.2.2熒光PCR反應體系。實時熒光PCR使用商品化專用熒光PCR反應液PremixExTaqP（內含經優(yōu)化過的Taq酶、Mg*、dNTP）;反應體系中的引物和TaqMan探t使用推薦濃度，具體見表2。

1.2.3熒光PCR反應程序。根據引物及TaqMan探針Tm值，確定熒光PCR反應的最佳反應程序，見表3。

1.2.4特異性試驗。以轉基因辣椒陽性標準品以及非轉基因辣椒、玉米、大豆、水稻、油菜籽、番茄的基因組DNA為模板，進行實時熒光PCR檢測，確定內源基因引物CaATLI和外源基因引物CMV的特異性。

1.2.5靈敏度試驗。測定轉基因辣椒陽性標準品DNA濃度，并對其進行10倍梯度稀釋，稀釋10個梯度，將稀釋液用上述反應體系和程序進行實時熒光PCR檢測，確定檢測靈敏度。

2結果與分析

2.1DNA提取結果

提取樣品總DNA，利用核酸蛋白測定儀測定樣品DNA的濃度與純度，DNA質量濃度可以達到100～200ng/uL，OD2x/OD280值在1.6～1.8之間，均達到后續(xù)試驗對DNA進行分析的要求。

2.2特異性試驗結果

以轉基因辣椒陽性標準品以及非轉基因辣椒、玉米、大豆、水稻油菜籽、番茄的基因組DNA為模板，進行實時熒光PCR檢測。

由圖1可知，針對內源基因CaATLI，只有轉基因辣椒陽性標準品和非轉基因辣椒有明顯擴增曲線，而其他對照物則無擴增曲線;針對外源基因CMV，只有轉基因辣椒陽性標準品有明顯擴增曲線，其余對照物則沒有。結果表明，針對內源基因CaATLI和外源基因CMV的檢測引物和探針具有較好的特異性。

2..3靈敏度試驗結果

測定陽性標準品DNA濃度為240ng/μL，并對其進行10倍梯度稀釋，用上述反應體系和程序進行實時熒光PCR檢測，確定檢測靈敏度。

由圖2可知，內源基因CaATLI和外源基因CMV到了10-5稀釋度（0.01%）仍然可以檢測出來，形成典型的“S"形擴增曲線。其中，內源基因CaATLI在106稀釋度有非典型的擴增曲線（CT值>35），在進行10次重復測試后，發(fā)現10-6稀釋度擴增曲線呈現不穩(wěn)定態(tài)勢，表明該稀釋度下的DNA含量極低，已達到方法檢測極限，容易出現波動，故將其靈敏度取10-5稀釋度（0.01%）。

3結論與討論

在分子生物學的標準上，判斷DNA純度的依據是OD20/OD280的比值，符合要求純度高的純化DNA其0D260/OD20在1.7～1.9之間，低于此范圍表示所提取的樣品DNA中含有蛋白質污染，高于此范圍表明樣品DNA中有RNA.污染。提取的辣椒樣品DNA中存在著較多的多酚、多糖，也是導致0D26/OD280比值偏低的原因之一。因此，在操作的過程中，需要注意多糖、多酚雜質的去除。

特異性試驗結果表明，針對辣椒內源基因CaATLI和外源基因CMV的檢測引物和探針具有較好的特異性;靈敏度測試結果表明，轉基因辣椒實時熒光PCR的靈敏度小于0.01%。目前，國際上設定的轉基因限量大多為1%，是本方法檢測靈敏度的100倍，認為0.01%的檢測靈敏度已完全能夠滿足基因檢測的需要。

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