Hasan Nihal　郭世輝　楊洪一

摘要以大鼠糞便樣品為試材，經(jīng)多次分離培養(yǎng)，獲得了8個特異菌落，其直徑為1～2mm，革蘭氏染色陰性。以分離菌株的基因組DNA為模板，利用細(xì)菌16SrRNA通用引物對菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。結(jié)果表明，測序結(jié)果與Gen?Bank中已報道的奇異變形桿茵（Proteus?mirabikis）菌株的序列相似性為100%;結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，初步鑒定菌株32N、36N、20A為奇異變形桿菌。奇異變形桿菌為條件致病菌，應(yīng)注意避免動物糞便對水及食物的污染。

關(guān)鍵詞 奇異變形桿菌;PCR;測序;大鼠糞便

中圖分類號 R446.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 1007-5739（2019）05-0196-01

變形桿菌（Proteus）廣泛分布于水、土壤腐敗的有機(jī)物以及人和動物的腸道中，為條件致病菌，多為繼發(fā)感染，如慢性中耳炎、創(chuàng)傷感染等，也可引起嬰兒腹瀉、食物中毒等”。變形桿菌屬包括普通變形桿菌（Proteus?vulgaris）、奇異變形桿菌（Proteus?mirabilis）、莫根變形桿菌（Proteus?morganii）等。奇異變形桿菌廣泛分布于自然界、人和動物體表及腸道中，在人或動物體內(nèi)或體表的適宜環(huán)境中生長并大量繁殖時，可誘發(fā)泌尿系統(tǒng)炎癥、中耳炎、菌血癥及小兒急性、慢性腹瀉等多種疾病。

奇異變形桿菌可污染動物性食品，特別是肉類，是引起食物中毒的重要因素叫。因此，對其進(jìn)行鑒定極為重要。本研究自大鼠糞便中分離出了3株細(xì)菌，并經(jīng)鑒定其為奇異變形桿菌。

1材料與方法

1.1細(xì)菌分離

取約1g大鼠糞便樣品，加入10mL生理鹽水，攪拌，使糞便分散到溶液中，并對溶液進(jìn)行10～100倍稀釋。取100μL稀釋液，接種到哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上。在37C厭氧箱中培養(yǎng)24～48h。對培養(yǎng)出的菌落進(jìn)行多次純化，之后將純化的菌株保存于-80C條件下。

1.2鏡檢及染色

挑取單個菌落鏡檢，觀察菌體的形態(tài)特征，并進(jìn)行革蘭氏染色。具體操作如下：①取潔凈的載玻片并進(jìn)行消毒，滴加10μLPBS緩沖液。②用接種環(huán)挑取單個菌落與PBS緩沖液充分混勻，然后利用火焰固定菌體。③滴加結(jié)晶紫染色液，1min后沖洗。④滴加碘液媒染，1min后水洗。⑤滴加95%乙醇脫色，30s后水洗。⑥滴加沙黃復(fù)染，30s水洗。⑦吸千多余水分，自然風(fēng)干，鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.3細(xì)菌總DNA提取

取1.5mL無菌離心管，加入200μL菌液，在12000r/min轉(zhuǎn)速下離心1min，棄上清液;加入50μL滅菌水，充分混勻。利用Invitrogen基因組DNA分離試劑盒進(jìn)行細(xì)菌總DNA提取。

1.4PCR反應(yīng)

以提取的基因組DNA為模板，利用細(xì)菌通用引物27F（5-AGAGTYTGATCCTGGCTCAG-3）、1492R（5'-GGTTACCTI'GTI'ACGACTT-3）進(jìn)行PCR反應(yīng)。

PCR反應(yīng)的條件為：94C、5min預(yù)變性;94C、60s變性，58C、60s退火，72C、120s延伸，31個循環(huán);最終72C延伸反應(yīng)8min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將電泳片段切膠、純化回收并檢測回收片段的質(zhì)量和濃度，由吉林省庫美生物科技有限公司進(jìn)行測序。對測序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析（http：//blat.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），并且利用軟件ClusterW進(jìn)行多序列比對，生成系統(tǒng)進(jìn)化樹。2結(jié)果與分析

糞便樣品經(jīng)多次分離培養(yǎng)，獲得了8個特異菌落，其直徑為1～2mm，表面光滑、濕潤，邊緣整齊。菌株革蘭氏染色呈紅色，為桿菌。

以分離菌株的基因組DNA為PCR模板，利用細(xì)菌16SrRNA通用引物對菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示目的條帶大小約為1500bp，與預(yù)期相符。對3個菌株的特異性PCR產(chǎn)物進(jìn)行了測序，結(jié)果顯示菌株32N、20A的測序結(jié)果與GenBank中已報道的奇異變形桿菌菌株ALK044的序列相似性為100%，菌株36N的測序結(jié)果與GenBank中已報道的奇異變形桿菌菌株WWi82的序列相似性為100%。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，本研究中的3個菌株（36N、32N、20A）與奇異變形桿菌菌株WWi82、ALK044聚集在一個進(jìn)化枝上（圖1）。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，初步鑒定菌株32N、36N、20A為奇異變形桿菌。

3結(jié)論與討論

動物腸道是一個營養(yǎng)豐富的微環(huán)境，適于微生物生存。在人體中，腸道細(xì)菌數(shù)量高達(dá)百萬億，推測有500～1000種微生物，總重量達(dá)1.5kg，基因數(shù)達(dá)500萬4。在鼠腸道中，腸道菌群可分為3類5：共生菌，主要有擬桿菌、梭菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌等，該類菌群數(shù)量龐大，是腸道菌群中的主體，可調(diào)節(jié)宿主代謝，并保護(hù)腸道;條件致病菌，主要包括腸桿菌、腸球菌等，盡管該類菌種較少，當(dāng)宿主菌群代謝失調(diào)或免疫力～下降時，該類菌群可引發(fā)多種腸道疾病，且治療較困難致病菌，如沙門氏菌致病大腸桿菌等，此類菌群類別較多樣，通過食物或呼吸道進(jìn)人腸道后，可引發(fā)疾病，是腹瀉及食物中毒的主要病因。

奇異變形桿菌作為腸道中條件致病菌中的重要類群，對人類健康具有一定的潛在危害。本研究在大鼠糞便中分離出了奇異變形桿菌，目前也有較多在人及其他動物糞便中分離出該菌的報道。因此，需要關(guān)注奇異變形桿菌在自然環(huán)境中的分布，并注意避免動物糞便對水及食物的污染問。此外，要加大對食品中奇異變形桿菌的檢測，控制其經(jīng)食物進(jìn)人人體并引發(fā)疾病。

傳統(tǒng)奇異變形桿菌的檢測主要基于生理生化反應(yīng)進(jìn)行鑒定"”。本研究基于細(xì)菌核糖體16SrRNA測序并結(jié)合形態(tài)學(xué)特點(diǎn)對奇異變形桿菌進(jìn)行了檢測，試驗(yàn)流程較長，但靈敏度、準(zhǔn)確性皆較高。

4參考文獻(xiàn)

[1]李文建.奇異變形桿菌的毒力因子[J].中國人獸共患病學(xué)報，2001，17（2）：80-82.

[2]袁紅，張國權(quán)，王衛(wèi)紅，等一起由奇異變形桿菌、副溶血性弧菌污染引起的食物中毒的調(diào)查[J].中華醫(yī)學(xué)研究雜志，2005（12）：1309.

[3]許騰林.腸外致病性大腸桿菌的分離鑒定及比較基因組學(xué)分析[D].大慶：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，2018.

[4]郭晗，張捷，楊碩，等腸道微生物與人類疾病關(guān)系的研究進(jìn)展[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2017，32（12）：1165-1172.

[5]高淑芳，曹瑜.腹瀉糞便中變形桿菌的分離鑒定與耐藥分析[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2007，4（24）：112.

[6]鄧群，雷云雪，鄭慧妮.變形桿菌感染特征及藥敏分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2007（7）：618-619.

[7]孫翰昌，孫沖，劉迪.臺灣泥鰍奇異變形桿菌的分離與鑒定[J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2018，24（7）：25-27.