江蕾 李蜜 李智 易湘茜 高程海 周桂

摘 ?要 ?分離純化廣西怪石灘海域海綿可培養(yǎng)共附生細(xì)菌，分析其多樣性并研究共附生細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)甘蔗鞭黑粉菌的抑制活性，為研發(fā)新型生物農(nóng)藥提供參考依據(jù)。采用8種培養(yǎng)基分離純化海綿共附生細(xì)菌，運(yùn)用16S rDNA測(cè)序方法進(jìn)行菌種鑒定及多樣性分析，采用牛津杯法測(cè)試細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)甘蔗鞭黑粉菌的抑制效果。經(jīng)形態(tài)學(xué)分析及16S rDNA比對(duì)，海綿中共獲得34株共附生細(xì)菌，隸屬于18科24屬?；钚詸z測(cè)結(jié)果表示，存在14株對(duì)甘蔗鞭黑粉菌有抑制效果的菌株。海綿中可培養(yǎng)共附生細(xì)菌物種多樣性豐富，部分菌株的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)甘蔗鞭黑粉菌具有較強(qiáng)的抑制效果，有成為新型生物農(nóng)藥的潛力。

關(guān)鍵詞 ?海綿;共附生細(xì)菌;物種多樣性;甘蔗鞭黑粉菌;抑菌活性

中圖分類號(hào) ?S566.1 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Abstract ?The purpose of this study was to investigate the distribution and the diversity of co-bacteria of Siphonochalina flexa isolated from Guaishi sea beach and to study its antifungal activities of the fermentation liquids against Sporisorium scitamineum. Eight different isolation media were used to isolate and purify the co-bacteria from S. flexa. The 16S rDNA was employed to explore the diversity of the isolated strains. The effects of the fermentation liqiuds against S. scitamineum were tested with the method of Oxford cup. After the morphological analysis and 16S rDNA alignment， 34 strains of co-bacteria were isolated from S. flexa， belonging to 18 families and 24 genera. Through testing the antifungal activities， we screened 14 kinds of bacteria that had the inhibitory effect on S. scitamineum. The cultivated bacteria in S. flexa were rich in species and most of them showed strong activity of against S. scitamineum.

Keywords ?Siphonochalina flexa; co-bacteria; species diversity; Sporisorium scitamineum; antifungal activities

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.07.025

甘蔗是廣西主要的經(jīng)濟(jì)作物，也是該地區(qū)的支柱產(chǎn)業(yè)，但其產(chǎn)量往往受制于甘蔗黑穗病[1]。甘蔗鞭黑粉菌（Sporisorium scitamineum）是引起甘蔗黑穗病的主要原因，目前世界上對(duì)其防治主要集中在強(qiáng)化育種、加強(qiáng)檢疫和抗性基因研究，但這些對(duì)于遏制甘蔗黑穗病的發(fā)生都沒(méi)有很好的作用[2]。嘧菌酯、啶酰菌胺等化學(xué)農(nóng)藥常被用于防治甘蔗黑穗病[3-4]。雖然化學(xué)農(nóng)藥可用于防控甘蔗黑穗病，但會(huì)嚴(yán)重污染大氣和水環(huán)境，同時(shí)增強(qiáng)甘蔗鞭黑粉菌抗藥性。因此尋找防治甘蔗鞭黑粉菌的生物農(nóng)藥，對(duì)蔗種消毒、宿根及枝葉防治，降低初次侵染率和減少孢子傳播，對(duì)甘蔗優(yōu)化種植、提高產(chǎn)量等有著重要意義。

生物防治作為植物病害防治的重要組成部分，越來(lái)越得到世界各國(guó)的重視并發(fā)揮著重要的作用[5]。廖詠梅等[6]從甘蔗根際土壤及其不同組織內(nèi)分離出的928株菌中，篩選得到18株菌對(duì)甘蔗黑穗病菌有強(qiáng)拮抗作用，其中12株為芽孢桿菌。熊國(guó)如等[7]在海南蔗區(qū)甘蔗根際土壤微生物中篩選得到1種能抑制甘蔗黑穗病菌的菌株，并在盆栽試驗(yàn)的防效表現(xiàn)也很好，該株細(xì)菌為枯草芽孢桿菌。李菲等[8]對(duì)分離自廣西北海金海灣紅樹(shù)植物秋茄中的50株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行抑制甘蔗鞭黑粉菌的活性篩選，結(jié)果顯示有37株對(duì)甘蔗鞭黑粉菌有抑制活性。

廣西海域地處亞熱帶，蘊(yùn)藏著豐富的海洋微生物資源[9]，但關(guān)于該海域海綿共附生細(xì)菌方面的研究報(bào)道較少，而利用菌株發(fā)酵產(chǎn)物抑制甘蔗鞭黑粉菌的海洋細(xì)菌更是鮮見(jiàn)。對(duì)廣西防城港怪石灘海域的海綿中可培養(yǎng)共附生細(xì)菌進(jìn)行多樣性分析，并利用甘蔗鞭黑粉菌對(duì)細(xì)菌次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行活性的初步篩選，為該海域細(xì)菌資源的開(kāi)發(fā)利用及研發(fā)生物類農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?海綿樣本來(lái)源、預(yù)處理及其共附生細(xì)菌的分離純化 ?海綿樣品于2016年10月采集自廣西防城港怪石灘（E 108°22， N 21°49）水下5 m，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)高程海研究員鑒定為彎曲管指海綿（Siphonochalina flexa）。海綿表面用無(wú)菌水沖洗三遍，取1 cm1 cm新鮮海綿大約2 g加入1?mL無(wú)菌水研磨，研磨后液體保存于1.5 mL離心管中，待用。將研磨后液體作為樣品原液，依次稀釋到103濃度，取稀釋后102、103樣液0.2 mL，分別接種于M4、M5、M6、M7、M9、2216E、Gause No. 1、AGG這8種不同分離培養(yǎng)基中培養(yǎng)基配方如表1所示（所有培養(yǎng)基需加入復(fù)合鹽溶液10 mL，瓊脂20 g，并調(diào)節(jié)pH 7.2，于115?℃滅菌30 min，待溫度降到55?℃時(shí)加入0.5 mL 25 mg/L的重鉻酸鉀以抑制真菌生長(zhǎng)），28?℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)15 d，通過(guò)形態(tài)觀察挑選菌落，記錄菌落形態(tài)特征及數(shù)量，并挑選形態(tài)各異的菌落進(jìn)行劃線純化。純化后的菌株制成凍干牛奶管于4?℃低溫保藏，同時(shí)制成20%甘油管于80?℃冷凍保藏。

1.1.2 ?供試菌采集及保存 ?甘蔗鞭黑粉菌冬孢子于2017年5月采自廣西金光農(nóng)場(chǎng)，采集新鮮甘蔗黑鞭（冬孢子），輕輕敲打黑鞭，將冬孢子裝于封口袋中，4?℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 ?共附生細(xì)菌16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

采用Chelex-100法[10]提取菌種的DNA，參照Walsh等[11]的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像儀檢驗(yàn)條帶，合格樣品測(cè)序委托上海美吉生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司廣州分公司進(jìn)行。測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNA Star軟件整理，利用EzTaxon服務(wù)器（http：//www.eztaxon.org/）[12]及Blast網(wǎng)站進(jìn)行在線比對(duì);選取高同源性序列作為參比對(duì)象，運(yùn)用MEGA5.0軟件，Neighbor- Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)并分析各菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位[13]。

1.3 ?共附生細(xì)菌對(duì)甘蔗鞭黑粉菌的抑制實(shí)驗(yàn)

1.3.1 ?細(xì)菌粗提物的制備 ?參照覃媚等[14]的方法，將34株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌接種發(fā)酵7 d，破壁處理后萃取濃縮得到細(xì)菌粗提物，并置于干燥器低溫保存。

1.3.2 ?甘蔗鞭黑粉菌擔(dān)孢子與菌絲的制備 ?參照Singh等[15]和朱桂寧等[3]的方法，取少量（綠豆大?。┒咦优c10 mL無(wú)菌水混勻，稀釋涂布多個(gè)濃度梯度，觀察其萌發(fā)狀況，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)103濃度萌發(fā)最佳。用接種環(huán)挑取適量（芝麻大?。┟劝l(fā)后冬孢子與1 mL無(wú)菌水混勻，稀釋涂布多個(gè)梯度，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證105濃度最佳，取200 μL 105濃度液涂布于PDA培養(yǎng)基，于28?℃培養(yǎng)3～5 d，觀察其生長(zhǎng)狀況，孢子萌發(fā)過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌滋生。選取5～7個(gè)酵母形態(tài)菌落，分別接種于YEPS液體培養(yǎng)基中，180 r/min，28?℃培養(yǎng)2 d，取少量菌液于PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行交叉配型，運(yùn)用排列組合方式兩兩交叉培養(yǎng)，菌落為白色絨毛狀，則兩菌株為異型（+、）交配型單倍體擔(dān)孢子。若菌落為酵母形態(tài)，則兩菌株為同型（+、+或、）交配型單倍體擔(dān)孢子[3]。

1.3.3 ?抑制甘蔗鞭黑粉菌擔(dān)孢子及菌絲生長(zhǎng)活性鑒定 ?（1）待試菌板的制備：分別挑取2種異型擔(dān)孢子接種于50 mL YEPS液體培養(yǎng)基，于28?℃、180 r/min的搖床中培育36～48 h。參照李菲等[8]的方法制備待試菌板。

（2）抑菌活性測(cè)定：采用牛津杯法[16]檢測(cè)34株細(xì)菌抑制甘蔗鞭黑粉菌活性。用一定量生物級(jí)DMSO溶解配制細(xì)菌粗提物樣品，粗提物樣品濃度為10 mg/mL，再用一次性過(guò)濾器過(guò)濾樣品?？瞻讓?duì)照為DMSO溶劑，陽(yáng)性對(duì)照為5 μg/mL啶酰菌胺溶液。每個(gè)牛津杯加入藥液100 μL，置于28?℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后，利用垂直十字交叉法測(cè)量各抑菌圈的直徑。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?海綿中可培養(yǎng)共附生細(xì)菌多樣性分析

本研究采用8種分離培養(yǎng)基，從海綿中分離到48株共附生細(xì)菌，根據(jù)菌落的大小、形態(tài)、顏色和出現(xiàn)時(shí)間等特征進(jìn)行排重。大部分菌株呈現(xiàn)淺色系、白色、淺紅色和淺黃色等，少數(shù)為黃褐色、棕褐色和橘黃色，多出現(xiàn)于3～4 d，直徑大小主要集中在1～6 mm。經(jīng)過(guò)形態(tài)特征與16S rDNA排除重復(fù)后得到34株菌株，其形態(tài)特征詳情如表2所示。獲得34株共附生細(xì)菌，隸屬于4門18科24屬，詳情見(jiàn)表3。其中，菌株BGMRC03076 Gordonia bronchialis相似度為97%，極有可能為潛在新種。根據(jù)共附生菌株與相似菌株的16S

2.2 ?海綿中細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物抑制甘蔗鞭黑粉菌的活性分析

34株細(xì)菌的發(fā)酵代謝產(chǎn)物經(jīng)抑制甘蔗鞭黑粉菌的活性篩選，結(jié)果顯示存在10株細(xì)菌具有抑制鞭黑粉菌菌絲生長(zhǎng)活性，6株細(xì)菌能抑制鞭黑粉菌“+”擔(dān)孢子，7株細(xì)菌能抑制鞭黑粉菌“”型擔(dān)孢子，部分抑菌結(jié)果如圖（圖2A，圖2B，圖2C）。其中，有2株同時(shí)具有抑制3種甘蔗鞭黑粉菌形態(tài)的活性（表4）。陽(yáng)性對(duì)照組（5?μg/mL啶酰菌胺溶液100?μL）出現(xiàn)明顯抑菌圈，抑菌圈直徑為（23.0±2.0） mm，陰性對(duì)照組未出現(xiàn)抑菌圈?；钚跃曛蟹謩e包含12個(gè)屬，放線菌屬（Acineto bacter）2株，分枝桿菌屬（Mycobacterium）2株，節(jié)細(xì)菌屬（Arthr obacter），芽孢桿菌屬（Bacillus），檸檬酸桿菌屬（Citr obacter），埃希氏桿菌屬（Escherichia），戈登氏菌屬（Gordonia），細(xì)桿菌屬（Microb acterium），小單孢菌屬（Micro monos po ra），根瘤菌屬（Rhiz obium），紅球菌屬（Rhodo coc cus），Sphingopyxis菌屬分別1株。其中菌株BGM RC03066芽孢桿菌屬的Bacillus siamensis對(duì)“+”擔(dān)孢子的抑制活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)到（25.40±0.85）mm，和陽(yáng)性組比較具有顯著抑制活性。

3 ?討論

海綿生活在海洋環(huán)境，常常與共附生微生物共同生存，以互惠互利或一方受益的方式共生、寄生或共棲[17]。李菲等[8]、王偉[17]與劉歡等[18]先后報(bào)道了關(guān)于海綿共附生細(xì)菌多樣性的研究進(jìn)展。目前，關(guān)于海綿的研究偏重于自身[19]與其共附生真菌代謝產(chǎn)物[20]的化學(xué)成分及活性研究，針對(duì)其共附生細(xì)菌的多樣性及發(fā)酵產(chǎn)物的活性研究較少。

本研究選擇廣西防城港怪石灘海域的海綿進(jìn)行其共附生細(xì)菌多樣性分析。采用8種不同的分離培養(yǎng)基分離純化海綿中的共附生細(xì)菌，分離培養(yǎng)共附生細(xì)菌34株，隸屬于18科24屬。采用牛津杯法測(cè)定34株共附生細(xì)菌對(duì)甘蔗鞭黑粉菌的抑制活性，結(jié)果顯示，14株細(xì)菌具有良好的抑菌活性，總陽(yáng)性率為41.2%。其中，BGMRC03066與BGMRC03081對(duì)甘蔗鞭黑粉菌菌絲及擔(dān)孢子（+、）都有不同程度的抑制作用，且抑制效果較好。BGMRC03066與BGMRC03081分別隸屬芽孢桿菌屬和微桿菌屬，其中尤以芽孢桿菌屬的抑菌效果最好，此結(jié)果與李菲等[8]和廖詠梅等[6]的結(jié)果相似。由此可見(jiàn)芽孢桿菌屬具有較強(qiáng)的抑菌活性，下一步將對(duì)抑菌活性較好的菌株進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，并分析其發(fā)酵代謝產(chǎn)物的化學(xué)組成及其抑菌機(jī)理，以期為新型生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)與利用奠定基礎(chǔ)。

廣西防城港海域海洋生物多樣化，海洋生物蘊(yùn)藏著豐富的細(xì)菌資源，且活性菌株較多，因此從海綿共附生細(xì)菌中尋找具有抗農(nóng)業(yè)病原真菌的活性菌株，利用海洋可再生資源解決農(nóng)業(yè)實(shí)際問(wèn)題可成為新的研究方向。

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