戴漢軍

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(Retinoblastoma,RB)是1類多發(fā)于嬰幼兒時(shí)期的眼內(nèi)惡性腫瘤[1]。MicroRNA是非編碼小RNA(21～23個(gè)核苷酸)，可調(diào)節(jié)許多生物學(xué)過程，其主要表現(xiàn)為在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)[2]。TAR DNA結(jié)合蛋白43(TDP-43)是1種肌萎縮側(cè)索硬化癥相關(guān)蛋白，研究表明，TDP-43的降解可能是導(dǎo)致肌萎縮側(cè)索硬化癥的原因[3]；于此同時(shí)，TDP-43在癌癥發(fā)生中也起著至關(guān)重要的作用[4]。第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白的同源基因(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)是1種抑癌基因；PTEN的突變可導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生[5]。在細(xì)胞生長信號中PTEN起著至關(guān)重要的作用，其作用機(jī)制主要涉及PI3K信號途徑、FAK信號途徑、MAPK信號途徑[6-8]。本研究在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞中，通過調(diào)節(jié)miRNA-26b調(diào)節(jié)PTEN/TDP-43信號通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)Y79細(xì)胞的增殖。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及其培養(yǎng)

人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。將Y79細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中(每ml含青霉素和鏈霉素個(gè)100 U)，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 材料和處理

MiRNA-26b激活劑(agomir)、激活劑陰性對照(agomir control)、抑制劑(antagomir)和抑制劑陰性對照(antagomir control)購置于銳博生物(中國)，播種細(xì)胞時(shí)即刻處理。

pcDNA 3.1/hygro(+)、pcDNA 3.1/hygro(+) PTEN由中美泰和公司合成；NsiRNA、siRNATDP-43購自吉?jiǎng)P基因。當(dāng)細(xì)胞密度長到60%～70%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染,處理NsiRNA、siRNATDP-43、EV、或PTEN-cDNA 8 h后換液，總體24小時(shí)后收取細(xì)胞。

1.3 Q-PCR

定量miRNA的測定。將2 μg RNA模板和500 nM RT引物(2 μl)加入無RNA酶的水中至11 μl體積，在70 ℃(10min)然后在冰上(2min)溫育， 然后將5×RT緩沖液(5 μl)，2.5 mM dNTP Mix(2 μl)，100U RT酶(1 μl)加入無RNA酶的水中至25 μl的體積。 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在42 ℃(60 min)然后在70 ℃(10 min)下孵育。 MiRNA qPCR反應(yīng)由SYBR Green qPCR Master混合物(10 μl)，cDNA模板(2 μl)，5 μm Bulge-Loop miRNA正向引物(0.8 μl)和5 μm Bulge-Loop miRNA反向引物(0.8 μl)組成 倒入無RNA酶的水中至20 μl的體積。 將反應(yīng)物在95 ℃(20 s)溫育，接著在95 ℃(10 s)，60 ℃(20 s)和70 ℃(10 s)下進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)行解鏈曲線分析。

1.4 免疫印跡

10% SDS-PAGE分離膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加一抗4 ℃孵育過夜。TBST洗3次后，加入相應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗后加入ECL顯色液，熒光成像儀成像。蛋白檢測所用一抗：anti-TDP-43(Rabbit,1∶3000,三鷹生物)，anti-PTEN(Rabit,1∶1000,Cell signaling technology)。

1.5 細(xì)胞計(jì)數(shù)

采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的數(shù)量。用無水乙醇擦拭細(xì)胞計(jì)數(shù)板，進(jìn)而用絲布將計(jì)數(shù)盤和蓋玻片擦試干凈，將蓋玻片蓋在細(xì)胞計(jì)數(shù)板的頂部。以1∶1的比例將0.4%臺(tái)盼藍(lán)染料溶液移入細(xì)胞懸液中，充分混勻，將混合液從擠塑板邊緣慢慢滴下，使液體充滿計(jì)數(shù)區(qū)，勿產(chǎn)生氣泡。稍等片刻，在低倍下(10×10倍)觀察計(jì)數(shù)板四個(gè)大方格(每個(gè)大方格分成16個(gè)小方格)內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。對于壓線細(xì)胞只計(jì)算壓上線和壓左線的，進(jìn)行兩次。兩次計(jì)數(shù)誤差不應(yīng)超過±5%。鏡下觀察：有強(qiáng)烈的折射的、透亮的而不染色的為活細(xì)胞，染上藍(lán)色的為死細(xì)胞。計(jì)數(shù)完成后，計(jì)算每毫升懸浮液中細(xì)胞的數(shù)量。細(xì)胞數(shù)量計(jì)算公式如下：細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)/ml=4個(gè)大方格細(xì)胞總數(shù)×2/4×10 000。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，單因素方差分析進(jìn)行組間比較，P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抑制miRNA-26b可抑制Y79細(xì)胞增殖

Y79細(xì)胞接種于6 cm的培養(yǎng)皿后(初始密度：1.0×105±0.2×105個(gè)/ml)，處理miRNA-26b抑制劑(1 μM)，3 h后收取細(xì)胞。Q-PCR結(jié)果顯示，處理miRNA-26b抑制劑后miRNA-26b水平顯著下調(diào)(圖1A)。與此同時(shí)，我們在處理miRNA-26b抑制劑后0 h、12 h、24 h測定Y79細(xì)胞的密度，我們發(fā)現(xiàn)抑制miRNA-26b后，細(xì)胞生長速度顯著減緩(圖1B～D)。進(jìn)一步我們在Y79細(xì)胞上處理miRNA-26b激活劑(圖1E)，我們發(fā)現(xiàn)Y79細(xì)胞生長速度顯著加快(圖1F～H)。這個(gè)記過顯示抑制miRNA-26b可抑制Y79細(xì)胞的生長。

2.2 抑制miRNA-26b可下調(diào)TDP-43水平

研究表明，TDP-43在細(xì)胞生長中起著至關(guān)重要的作用[4]。Western blot檢測miRNA-26b抑制劑處理24 h后的Y79細(xì)胞中的TDP-43水平，結(jié)果顯示抑制miRNA-26b可下調(diào)Y79細(xì)胞中的TDP-43水平(圖2A)。進(jìn)一步確定TDP-43在Y79細(xì)胞中的作用，我們通過轉(zhuǎn)染siRNATDP-43下調(diào)Y79細(xì)胞中的TDP-43水平(圖2B)；與此同時(shí)，我們在處理siRNATDP-43后8 h收取細(xì)胞重新播種，并在播種后0 h、12 h、24 h測定Y79細(xì)胞的密度，我們發(fā)現(xiàn)抑制下調(diào)TDP-43后，細(xì)胞生長速度顯著減緩(圖2C～E)。

A為Q-PCR檢測Y79細(xì)胞在處理miRNA-26b抑制劑后的miRNA-26水平；B-D為細(xì)胞計(jì)數(shù)測定處理miRNA-26抑制劑后0 h(B)，12 h(C)，24 h(D) 時(shí)Y79細(xì)胞的密度；E為Q-PCR檢測Y79細(xì)胞在處理miRNA-26b激活劑后的miRNA-26的水平；F-H為細(xì)胞計(jì)數(shù)測定處理miRNA-26抑制劑后0 h(F)，12 h(G)，24 h(H) 時(shí)Y79細(xì)胞的密度。圖1 抑制miRNA-26b可抑制Y79細(xì)胞的生長

A為Western blot檢測Y79細(xì)胞在處理miRNA-26b抑制劑后的TDP-43水平；B為Western blot檢測Y79細(xì)胞在抑制TDP-43后的TDP-43水平；C-E為細(xì)胞計(jì)數(shù)測定抑制TDP-43后0 h(C)，12 h(D)，24 h(E) 時(shí)Y79細(xì)胞的密度。圖2 抑制miRNA-26b可下調(diào)TDP-43水平

2.3 抑制miRNA-26b可上調(diào)PTEN水平

PTEN為1種抑癌基因，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[5]。Western blot檢測miRNA-26b抑制劑處理24 h后的Y79細(xì)胞中的PTEN水平，結(jié)果顯示抑制miRNA-26b可上調(diào)Y79細(xì)胞中的PTEN水平(圖3A)。進(jìn)一步確定PTEN在Y79細(xì)胞中的作用，我們通過在Y79細(xì)胞中過表達(dá)PTEN(圖3B)；與此同時(shí)，我們在轉(zhuǎn)染后8 h收取細(xì)胞重新播種，并在播種后0 h、12 h、24 h測定Y79細(xì)胞的密度，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PTEN后，細(xì)胞生長速度顯著減緩(圖3C～E)。

A為Western blot檢測Y79細(xì)胞在處理miRNA-26b抑制劑后的PTEN水平；B為Western blot檢測Y79細(xì)胞在過表達(dá)PTEN后的PTEN水平；C-E為細(xì)胞計(jì)數(shù)測定過表達(dá)PTEN后0 h(C)，12 h(D)，24 h(E) 時(shí)Y79細(xì)胞的密度。圖3 抑制miRNA-26b可上調(diào)PTEN水平

2.4 MiRNA-26b調(diào)節(jié)的Y79細(xì)胞生長由PTEN/TDP-43介導(dǎo)

在抑制TDP-43或上調(diào)PTEN的情況下再處理miRNA-26b抑制劑，結(jié)果顯示Y79細(xì)胞在處理miRNA-26b抑制劑后與未處理組對比，細(xì)胞生長速度無顯著差異。這個(gè)結(jié)果揭示TDP-43和PTEN介導(dǎo)miRNA-26b調(diào)節(jié)的細(xì)胞生長作用。此外，Western blot檢測過表達(dá)PTEN后的TDP-43水平，顯示TDP-43顯著下調(diào)；Western blot檢測抑制TDP-43后的PTEN水平，結(jié)果顯示無顯著差異。進(jìn)一步，Western blot檢測過表達(dá)PTEN后進(jìn)一步處理miRNA-26b抑制劑后的TDP-43水平，顯示無顯著差異。這個(gè)結(jié)果表明MiRNA-26b調(diào)節(jié)的Y79細(xì)胞生長由PTEN/TDP-43介導(dǎo)。

3 討論

近年來miRNA與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma,RB)的關(guān)系已被廣泛關(guān)注[9-10]。不同的miRNA在不同的腫瘤組織中具有一定的特異性表達(dá)，既可表現(xiàn)出癌基因作用，也可有抑癌基因作用。有研究報(bào)道，miRNA-26b在乳腺癌發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用[11]，但在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的作用上不確定。本研究揭示，抑制miRNA-26b可抑制Y79細(xì)胞的增殖，且這個(gè)過程由上調(diào)PTEN反向調(diào)節(jié)TDP-43水平介導(dǎo)。

Y79細(xì)胞系是第1個(gè)培養(yǎng)成功的人視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤細(xì)胞系，來源于1位2歲半白種女性RB患兒[12]。當(dāng)我們在Y79細(xì)胞中抑制miRNA-26b后，顯著觀察到Y(jié)79細(xì)胞生長減慢；與此同時(shí)，激活miRNA-26b得到了相反的結(jié)果。這個(gè)結(jié)果表明，miRNA-26b可正向調(diào)節(jié)Y79細(xì)胞的生長。與miRNA-26b在乳腺癌正的促癌作用相吻合[11]，但是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長得作用機(jī)制尚不明確。我們發(fā)現(xiàn)，在抑制miRNA-26b后，Y79細(xì)胞內(nèi)TDP-43水平顯著下調(diào)。研究表明，TDP-43與腫瘤生長氣息相關(guān)。我們進(jìn)一步證實(shí)，下調(diào)TDP-43的情況下，可抑制Y79細(xì)胞的生長。研究表明，miRNA-26b在巨噬細(xì)胞中可負(fù)向調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)[13]。我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抑制miRNA-26b的情況下，Y79細(xì)胞中的PTEN水平顯著上調(diào)。PTEN是1種抑癌基因，上調(diào)PTEN可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

進(jìn)一步探索miRNA-26b調(diào)節(jié)的Y79細(xì)胞增長是否與TDP-43或PTEN直接相關(guān)。我們在抑制TDP-43或過表達(dá)PTEN的情況下，進(jìn)一步處理miRNA-26b抑制劑，Y79細(xì)胞的生長狀況未發(fā)現(xiàn)顯著差異。這個(gè)結(jié)果證實(shí)，miRNA-26b介導(dǎo)的Y79細(xì)胞的生長作用于TDP-43和PTEN直接介導(dǎo)。有研究表明，在缺血性腦損傷后，PTEN可負(fù)向調(diào)節(jié)TDP-43發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[14]。我們猜測，在Y79細(xì)胞中是否PTEN與TDP-43存在相似的關(guān)系。我們揭示，在Y79細(xì)胞中PTEN可負(fù)向調(diào)節(jié)TDP-43表達(dá)。并進(jìn)一步揭示，miRNA-26b調(diào)節(jié)的TDP-43水平變化由PTEN介導(dǎo)。這個(gè)結(jié)果說明，miRNA-26b介導(dǎo)的Y79細(xì)胞生長作用，是通過PTEN調(diào)節(jié)TDP-43介導(dǎo)。

總而言之，我們揭示，在人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞中，抑制miRNA-26b可抑制細(xì)胞的生長；且這個(gè)過程是由抑制miRNA-26b導(dǎo)致PTEN上調(diào)，進(jìn)一步引起TDP-43下調(diào)介導(dǎo)。miRNA-26b調(diào)節(jié)的PTEN /TDP-43變化可能成為治療視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的潛在靶點(diǎn)。