武師良 張立斌 劉興偉 張興會(huì) 王曉銘 李鳳軍 張曉鷹

摘要：試驗(yàn)以3個(gè)細(xì)管凍精稀釋液配方為基礎(chǔ)，進(jìn)行配方初選試驗(yàn)、不同防凍劑比較試驗(yàn)、同一防凍劑不同含量比較試驗(yàn)，比較了不同條件下細(xì)管凍精的制作效果，進(jìn)而篩選出效果較好的遼西驢細(xì)管凍精稀釋液配方。

關(guān)鍵詞：遼西驢;冷凍精液;稀釋液配方

中圖分類號(hào)：S822 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

doi： 10.3969/j.issn.2096-3637.2019.21.008

0 引言

隨著遼西驢飼養(yǎng)數(shù)量的增加，對遼西驢肉用品種進(jìn)行種源選育、加強(qiáng)保種工作提上日程，為防止近交退化、雜交亂配造成的群體退化、生產(chǎn)性能下降，項(xiàng)目組于2019年6-8月開展遼西驢細(xì)管冷凍精液的制作研究，為提高遼西驢細(xì)管凍精的制作效果，在試驗(yàn)初期開展了遼西驢細(xì)管冷凍精液稀釋液配方篩選試驗(yàn)，結(jié)果、結(jié)論如下。

1 材料與方法

1.1 精液來源

研究中使用的精液來源于建平縣芮林牧業(yè)有限公司的4頭種公驢。

1.2 試驗(yàn)藥品

主要為分析純無機(jī)鹽、糖類、乙二醇、甘油[1]等試劑及抗菌素等。

1.3 試驗(yàn)器材

400～600倍光學(xué)顯微鏡[2]、離心機(jī)、恒溫水浴鍋、超低溫溫度儀、控溫冰箱、電子天平、0.5 mL與0.25 mL細(xì)管[3]等。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 篩選冷凍稀釋液

冷凍稀釋液包括以乙二醇為防凍劑的初選配方;以等量甘油替代乙二醇為防凍劑的二次篩選配方;不同含量的防凍劑的優(yōu)化配方。各配方具體成分如表1、表2、表3。

1.4.2 稀釋溶液配制

原精離心液配制：蔗糖分析純試劑110g，加蒸餾水1000mL煮沸至蔗糖全部溶解。

冷凍稀釋液配制：準(zhǔn)桷稱量各配方中的基礎(chǔ)試劑煮沸溶解制成溶液，常溫冷卻后加入抗菌素和卵黃，攪拌均勻。

1.4.3 精液離心與稀釋2

原精經(jīng)紗布（6～8層）過濾后，按1：1體積比例加入離心液，緩慢均勻混合后，裝入離心管，在（30±4） ℃范圍內(nèi)以2000r/min離心10 min;離心后精液棄去上清液后在干凈的容器內(nèi)按1：1～1：2比例加入冷凍稀釋液，等溫緩慢混勻。

1.4.4 降溫平衡

稀釋后的精液放入緩沖容器內(nèi)，封口，進(jìn)行降溫平衡。

1.4.5 精液冷凍溫度

初凍溫度分別設(shè)置為（90±5）℃，凍精細(xì)管變成乳白色時(shí)全部浸入液氮中。

1.4.6 細(xì)管凍精解凍及質(zhì)量檢測

解凍后，在37℃環(huán)境下檢查活力、頂體完整率和存活時(shí)間。

1.4.7 分析方法

采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用LSD法多重比較各處理的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同稀釋液初選配方冷凍效果比較

3個(gè)稀釋液配方A1， B1， C1中，B1解凍后活力最低，其次為Al， C1， Cl與Al比較，差異顯著（P<0.05） ， B1與A1、C1比較，差異極顯著（P<0.01） ;解凍后頂體完整率從高到低依次為C1、A1、B1，其中，C1、A1之間差異顯著（P<0.05），B1與A1，C1比較，差異極顯著（P<0.01）;解凍后38℃下存活時(shí)間，從長到短依次為C1、A1、B1，其中，C1、A1之間差異顯著（P<0.05），B1與A1、C1比較，差異極顯著（P<0.01）。據(jù)此，以C1配方為首選配方。

2.2 凍精稀釋液配方第2次篩選

用等量的甘油替代乙二醇作為防凍劑，冷凍后精子活力A2>Al， B2>B1， C2>C1，并且A2>Al， B2>B1達(dá)到了顯著水平（P<0.05） ，解凍后精子的解凍完整率A2>A1， B2>B1， C2>C1，并且均達(dá)到了顯著水平（P<0.05），凍精解凍后在38℃下存活時(shí)間A2>A1， B2>B1， C2>C1，各比較組P>0.05，差異不顯著。采用用等量的甘油替代乙二醇作為防凍劑可提高遼西驢細(xì)管凍精的綜合質(zhì)量。

2.3 優(yōu)化稀釋液配方中不同甘油濃度對凍精質(zhì)量的影響

C23配方（甘油含量為5mL）時(shí)，冷凍后活力，凍后的頂體完整率、存活時(shí)間都比其它各組高，其中，C23的精子冷凍后活力較C21相比，差異極顯著（P<0.01 ） ，與C22、C25相比較，差異達(dá)顯著水平（P<0.05），與C24比較，差異不顯著（P>0.05）;C23方的凍后頂體完整率，與C21、C22、C25相比較，差異顯著（P<0.05 ），與24比較差異不顯著（P>0.05）;精子解凍后在38℃下存活時(shí)間以C23組最高，C23與C21比較，差異達(dá)極顯著水平（P<0.01），C23與C22、C25比較，差異達(dá)顯著水平，C23與C24比較，差異不顯著（P>0.05）。甘油的添加量以5mL最為適宜。

3 討論與結(jié)論

（1）以甘油為冷凍劑的配方（葡萄糖1.2g、檸檬酸1.3g、Tris2.4g、甘油5mL、卵黃20mL、雙蒸餾水100mL、青鏈霉素各1×105IU）可為制作遼西驢細(xì)管冷凍精液的首選配方。

（2）試驗(yàn)是以含有乙二醇或甘油為防凍劑的凍精稀釋液采取一次性稀釋精液的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，沒有進(jìn)行精液二次稀釋試驗(yàn)，而凍精稀釋液最終配方為含有甘油防凍劑的稀釋液，據(jù)相關(guān)報(bào)導(dǎo)，甘油對精子最有一定的毒性作用，而采取二次稀釋法可以降低甘油對精子的毒副作用。與一次稀釋相比，二次稀釋可能使遼西驢細(xì)管凍精的冷凍效果進(jìn)一步提升，因此，尚需開展二次稀釋試驗(yàn)，以驗(yàn)證篩選出凍精稀釋液配方的冷凍效果。

（3）試驗(yàn)是在3個(gè)初選配方的篩選后更換防凍劑的基礎(chǔ)上進(jìn)行，由于不同的稀釋液的滲透壓、pH值及對精細(xì)胞的保護(hù)作用都是不同的，因此，試驗(yàn)結(jié)論尚不能作為最終結(jié)論，還需進(jìn)一步開展試驗(yàn)進(jìn)行完善。

參考文獻(xiàn)

[1] 楊莉，于杰，李海靜，等.驢精液低溫冷凍技術(shù)及應(yīng)用進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2016（20）：80-81.

[2] 古麗海a，高斐.驢精液常溫保存的研究[J].新疆畜牧業(yè)，2014 （11）：14-16.

[3] 王慧偉.驢精液保存技術(shù)研究[D].烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

基金項(xiàng)目：遼寧省中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專項(xiàng)-遼西驢品種種系發(fā)生、分子鑒定及保種研究（2019416032）

作者簡介：武師良（1985-），男，農(nóng)業(yè)推廣碩士.畜牧師，研究方向：動(dòng)物育種。

通信作者：劉興偉（1965-） ，男，教授，研究員，畜牧師，研究方向：選育繁殖飼養(yǎng)。