謝運(yùn)飛 李蕓霞 謝紅軍 彭成

中圖分類號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）20-2772-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.20.08

摘 要 目的：研究附子脂溶性生物堿與白芍總苷配伍治療風(fēng)寒濕痹證模型大鼠的增效作用。方法：取SD雄性大鼠100只，隨機(jī)分為空白組（水），模型組（水），羅通定組[陽性對(duì)照，10.0 mg/（kg·d）]、地塞米松組[陽性對(duì)照，0.3 mg/（kg·d）]，附子生物堿低、高劑量組[附子脂溶性生物堿浸膏12.5、25.0 mg/（kg·d）]，白芍總苷低、高劑量組[白芍總苷粉末200.0、400.0 mg/（kg·d）]，配伍低、高劑量組[附子脂溶性生物堿浸膏+白芍總苷粉末分別為12.5 mg/（kg·d）+400.0 mg/（kg·d）、25.0 mg/（kg·d）+800.0 mg/（kg·d）]，每組10只。除空白組外，其余各組大鼠均于右后足墊部位注射完全弗氏佐劑0.1 mL并輔以風(fēng)、寒、濕刺激來復(fù)制風(fēng)寒濕痹證模型。造模19 d后開始灌胃給藥或水，每日1次，持續(xù)14 d。分別于給藥第0（即給藥前）、3、6天時(shí)測(cè)定大鼠的關(guān)節(jié)壓痛閾值（地塞米松組除外）和關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)（羅通定組除外）;采用蘇木素-伊紅染色法，觀察大鼠（羅通定組除外）踝關(guān)節(jié)滑膜組織的病理學(xué)變化;采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定大鼠（羅通定組除外）血清中抗環(huán)瓜氨酸肽（CCP）抗體并計(jì)算增效指數(shù)（CI）。結(jié)果：與空白組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)壓痛閾值在不同給藥時(shí)間點(diǎn)均顯著降低，關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)則顯著升高（P<0.01）;滑膜組織炎性病變現(xiàn)象明顯;血清中抗CCP抗體含量顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠關(guān)節(jié)壓痛閾值、關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)、滑膜組織病變程度以及血清中抗CCP抗體含量均有不同程度的改善，大部分指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），且配伍組的指標(biāo)改善效果優(yōu)于單味組分給藥組;基于抗CCP抗體含量計(jì)算得CI值為0.213（>1），提示兩者配伍具有協(xié)同作用。結(jié)論：附子脂溶性生物堿與白芍總苷配伍治療風(fēng)寒濕痹證模型大鼠具有鎮(zhèn)痛、抗炎、保護(hù)滑膜組織等作用，并呈協(xié)同增效作用。

關(guān)鍵詞 附子脂溶性生物堿;白芍總苷;配伍;風(fēng)寒濕痹證;增效作用;抗環(huán)瓜氨酸肽抗體;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the efficacy enhancing effect of compatibility of Aconitum carmichaeli liposoluble alkaloids and total glucosides of peony in the treatment of wind-cold-dampness type bi-syndrome model rats. METHODS： Totally 100 SD male rats were randomly divided into blank group （water）， model group （water）， rotundine group [positive control， 10.0? ? mg/（kg·d）]， dexamethasone group [positive control， 0.3 mg/（kg·d）]，A. carmichaeli alkaloids low-dose and high-dose groups [A. carmichaeli? liposoluble alkaloid extract 12.5， 25.0 mg/（kg·d）]， total glucosides of peony low-dose and high-dose groups [total glucosides of peony powder 200.0，400.0 mg/（kg·d）]， compatibility low-dose and high-dose groups [A. carmichaeli? liposoluble alkaloid+total glucosides of peony powder were 12.5 mg/（kg·d）+400.0 mg/（kg·d）， 25.0 mg/（kg·d）+800.0 mg/（kg·d） respectively]， with 10 rats in each group. Except for blank group， other groups were given complete Freund’s adjuvant 0.1 mL on the right hind paw and wind-cold-dampness stimulation to induce wind-cold-dampness type bi-syndrome model. Nineteen days after modeling， they were given relevant medicine or water intragastrically， once a day， for consecutive 14 d. The joint tenderness threshold （except for dexamethasone group） and joint swelling index （except for rotundine group） were measured at 0 （before medication）， 3rd and 6th day after administration respectively. HE staining was used to observe the pathological changes of synovial membrane of ankle joint in rats （except for rotundine group）. ELISA assay was used to determine anti-cyclic citrullinated peptide （CCP） antibody in serum of rats （except for rotundine group）， and compatibility index （CI） were calculated. RESULTS： Compared with blank group， joint tenderness threshold of rats were decreased significantly in model group at different time points， while joint swelling index was increased significantly （P<0.01）. Inflammatory lesions in synovial tissue were obvious， and the content of anti-CCP antibody in serum was significantly increased （P<0.01）. Compared with model group， the joint tenderness threshold， joint swelling index， synovial tissue pathological changes and anti-CCP antibody content in serum of rats in medication groups were improved in varying degrees， most of the indicators had significant difference （P<0.05 or P<0.01）， and the improvement effect of the compatibility groups was better than single component treatment groups. CI value calculated based on anti-CCP antibody content was 0.213，suggesting that the compatibility of the two components had synergistic effect. CONCLUSIONS： The compatibility of A. carmichaeli liposoluble alkaloids and total glucosides of peony in the treatment of wind-cold-dampness type bi-syndrome model rats has analgesia，anti-inflammation and synovial tissue protection， with synergistic efficacy-enhancing effect.

KEYWORDS? ?Aconitum carmichaeli liposoluble alkaloids;Total glucosides of peony;Compatibility; Wind-cold-dampness type bi-syndrome; Efficacy-enhancing effect; Anti-cyclic citrullinated peptide antibody; Rat

附子為毛茛科植物烏頭（Aconitum carmichaeli Debx）的子根加工品，始載于《神龍本草經(jīng)》，其味辛、甘，性大熱，有毒，具有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、散寒止痛等功效，主治亡陽虛脫、肢冷脈微、心陽不足、胸痹心痛、虛寒吐瀉、脘腹冷痛、腎陽虛衰、陽痿宮冷、陰寒水腫、陽虛外感、寒濕痹痛等癥[1]。白芍為毛茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根，其最早收錄于《五十二病方》，《神龍本草經(jīng)》對(duì)其有詳細(xì)記載，其氣微，味微苦、酸，性微寒，歸肝、脾經(jīng)，有小毒，具有養(yǎng)血斂陰、柔肝止痛、平抑肝陽等功效[2-3]。

中醫(yī)理論將類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）歸屬為“痹證”的范疇，也稱其為“歷節(jié)風(fēng)”“鶴膝風(fēng)”“尪痹”等，并認(rèn)為痹證的發(fā)生發(fā)展是風(fēng)寒濕熱等外邪的侵襲，合并氣血虧虛、經(jīng)脈不通、情志失調(diào)等內(nèi)因?qū)е律眢w正氣缺失所致[4-5]。中藥配伍理論是傳統(tǒng)中醫(yī)的智慧結(jié)晶，恰當(dāng)?shù)呐湮椴粌H能使合用藥物產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)、增強(qiáng)療效，亦可降低毒性、減少藥物不良反應(yīng);其形式不僅包括藥對(duì)以及飲片的配伍，還包括中藥組分以及單體成分的配伍[6]。附子因其生物堿類成分毒性強(qiáng)烈，所以需要進(jìn)行適當(dāng)炮制和藥對(duì)配伍，以降低毒性、增加療效[7];白芍則藥性甘緩柔潤，與附子配伍，可緩和附子剛燥辛烈之性，起到剛?cè)嵯酀?jì)、溫陽祛寒的功效，而無耗傷陰血之弊[8]?，F(xiàn)代研究表明，附子與白芍配伍可有效降低有毒性的附子雙酯型生物堿在心、肝、腎等臟器中的蓄積，增加小鼠對(duì)附子毒性生物堿的耐受性，提高藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，降低佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清中部分促炎細(xì)胞因子的水平等[9-10]。

附子與白芍配伍是歷代醫(yī)家推崇的傳統(tǒng)藥對(duì)，主要用于治療風(fēng)寒濕痹痛、中風(fēng)麻木疼痛等，具有增效減毒的效果[11]。附子的脂溶性生物堿類成分是其重要的生物活性成分，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、強(qiáng)心、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理效應(yīng)，其中鎮(zhèn)痛、抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用與風(fēng)寒濕痹證的治療密切相關(guān)[12]。白芍總苷亦具有抗炎及免疫調(diào)節(jié)等作用，其成品已通過國家食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)，用于風(fēng)寒濕痹證的治療[13-14]。但兩種組分的配伍增效作用缺乏相關(guān)基礎(chǔ)性研究。因此，本研究采用關(guān)節(jié)壓痛閾值、關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)、組織病理學(xué)及增效指數(shù)（CI）等指標(biāo)，探討附子脂溶性生物堿與白芍總苷配伍治療風(fēng)寒濕痹證的增效作用，為兩者的臨床合理聯(lián)用提供理論支撐。

1 材料

1.1 儀器

AL204型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司];KDC-2046型低速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）;YLS-3E型壓痛儀（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站）;MNT-150型數(shù)顯游標(biāo)卡尺（上海美耐特實(shí)業(yè)有限公司）;3001型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國賽默飛世爾科技公司）;QL-9001型快速振蕩器（海門市麒麟醫(yī)用儀器廠）;Eclipse Ci型科研顯微鏡、DS-Fi2型顯微鏡攝像頭（日本尼康株式會(huì)社）。

1.2 藥品與試劑

羅通定片（成都市湔江制藥廠，批號(hào)：170921，規(guī)格：30 mg/片）;地塞米松片（重慶科瑞制藥有限公司，批號(hào)：348001，規(guī)格：0.75 mg/片）;完全弗氏佐劑（美國Sigma公司，批號(hào)：SLBV6895）;水合氯醛（成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：2016092901）;4%多聚甲醛通用型組織固定液（合肥新恩源生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：1808575）;10%乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣液、蘇木素-伊紅（HE）試劑（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號(hào)：YP184204、20180925）;大鼠抗環(huán)瓜氨酸肽（CCP）抗體酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào)：3JWZM4UWG5）;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為蒸餾水。

1.3 藥材

附子（四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：160901）;白芍（安徽亳州中藥材市場(chǎng)，批號(hào)：20160508）。藥材經(jīng)由成都中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室裴瑾教授鑒定，分別為毛茛科植物烏頭（A. carmichaeli Debx）子根的黑順片炮制品和毛茛科植物芍藥（P. lactiflora Pall.）的干燥根。

1.4 動(dòng)物

SD大鼠100只，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，購自四川省中醫(yī)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2018-19。大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 附子脂溶性生物堿和白芍總苷的制備

按本課題組前期研究方法[15]提取附子脂溶性生物堿和白芍總苷，原藥材及所獲提取物均為同一批次。

2.1.1 附子脂溶性生物堿的制備 取黑順片5 kg，粉碎，用二氯甲烷、5%Na2CO3溶液先后浸泡，再以二氯甲烷為溶劑加熱回流提取2次;合并提取液，回收溶劑并濃縮后，以0.05 mol/L硫酸溶液萃取2次;合并酸水萃取液，加氨水調(diào)pH至9～10，再以二氯甲烷萃取3次;合并有機(jī)相萃取液，回收溶劑并濃縮，得附子脂溶性生物堿浸膏（12.5 g）。

2.1.2 白芍總苷的制備 取白芍藥材5 kg，粉碎，以70%乙醇為溶劑加熱回流提取2次;合并提取液，回收溶劑并濃縮至無醇味;取濃縮液，過D101型大孔樹脂，先后以水、25%乙醇洗脫;收集25%乙醇洗脫部位，回收溶劑并濃縮至無醇味，噴霧干燥，得白芍總苷粉末（200.0 g）。

2.2 分組、造模與給藥

取大鼠100只，隨機(jī)分為空白組，模型組，羅通定組[陽性對(duì)照，10.0 mg/（kg·d）;按等效劑量系數(shù)折算法[16]制定給藥劑量]，地塞米松組[陽性對(duì)照，0.3 mg/（kg·d）;按羅通定組同法制定給藥劑量]，附子生物堿低、高劑量組[附子脂溶性生物堿浸膏12.5、25.0 mg/（kg·d）;按前期研究結(jié)果[17]制定劑量]，白芍總苷低、高劑量組[白芍總苷粉末200.0、400.0 mg/（kg·d）;按前期研究結(jié)果[15]制定劑量]，配伍低、高劑量組[附子脂溶性生物堿和白芍總苷分別為12.5 mg/（kg·d）+400.0 mg/（kg·d）、25.0 mg/（kg·d）+800.0 mg/（kg·d）;按前期研究結(jié)果[15]制定配伍比例，相當(dāng)于附子與白芍原藥材配伍比例為1 ∶ 2]，每組10只。羅通定片、地塞米松片、附子脂溶性生物堿浸膏、白芍總苷粉末均在臨用前以水配制成適當(dāng)濃度的藥液，每次給藥體積均為20 mL/kg。

根據(jù)文獻(xiàn)方法[17]進(jìn)行造模：模型組和各給藥組大鼠均于右后足墊部位注射完全弗氏佐劑0.1 mL以建立佐劑性關(guān)節(jié)炎（AIA）模型，然后每天將大鼠雙后足踝關(guān)節(jié)以下部位浸泡于涼水15 min，同時(shí)吹電風(fēng)扇刺激，即在AIA模型的基礎(chǔ)上，輔以“風(fēng)、寒、濕”等外因刺激，以建立符合中醫(yī)病證結(jié)合特點(diǎn)的風(fēng)寒濕痹證模型;空白組大鼠在在相同部位注射生理鹽水0.1 mL，并避免風(fēng)、寒、濕的刺激。自注射之日起第19天時(shí)，各給藥組大鼠分別灌胃相應(yīng)藥液，每日1次，連續(xù)14 d;空白組和模型組大鼠均同法灌胃相應(yīng)體積水。

2.3 大鼠關(guān)節(jié)壓痛閾值測(cè)定

分別于給藥第0（即給藥前）、3、6天時(shí)，取“2.2”項(xiàng)下除地塞米松組外的各組大鼠，采用電子壓痛儀進(jìn)行其左、右踝關(guān)節(jié)疼痛情況測(cè)定。壓痛閾值以大鼠產(chǎn)生疼痛掙扎時(shí)的儀器計(jì)數(shù)為準(zhǔn)。

2.4 大鼠關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)測(cè)定

分別于給藥第0（即給藥前）、3、6天時(shí)，取“2.2”項(xiàng)下除羅通定組外的各組大鼠，采用游標(biāo)卡尺測(cè)量其左、右足踝關(guān)節(jié)直徑，計(jì)算腫脹指數(shù)[18]：腫脹指數(shù)（cm/kg）=關(guān)節(jié)直徑（cm）/體質(zhì)量（g）×10-3。

2.5 樣本采集及處理

末次給藥后2 h，取除羅通定組外的各組大鼠，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，用含促凝劑的真空采血管從其腹主動(dòng)脈采集血樣，靜置30 min后，在4 ℃條件下以1 000×g離心10 min，收集上層血清。血樣采集完畢后，迅速斷頸處死大鼠，收集注射足的對(duì)側(cè)足（左足）關(guān)節(jié)樣本，置于4%多聚甲醛通用型組織固定液中固定。

2.6 大鼠滑膜組織病理學(xué)檢查

取“2.5”項(xiàng)下固定的大鼠左足踝關(guān)節(jié)組織，在4 ℃條件下以10%EDTA脫鈣液進(jìn)行脫鈣60 d，期間定期更換脫鈣液;脫鈣完成后取關(guān)節(jié)組織進(jìn)行石蠟包埋，制作切片（厚度：4 μm）;采用HE法染色后，置于顯微鏡下觀察。以結(jié)締組織增生、炎性細(xì)胞浸潤、新生血管形成等情況評(píng)價(jià)滑膜組織病變程度。

2.7 大鼠血清中抗CCP抗體含量測(cè)定及配伍增效作用評(píng)價(jià)

取“2.5”項(xiàng)下大鼠血清樣本，按酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定血清抗CCP抗體含量。根據(jù)文獻(xiàn)方法[19]，計(jì)算附子脂溶性生物堿與白芍總苷配伍治療風(fēng)寒濕痹證的CI。首先，按公式計(jì)算各組大鼠血清抗CCP抗體抑制率：抗體抑制率=[（模型組抗CCP抗體含量-空白組抗CCP抗體含量）-（給藥組抗CCP抗體含量-空白組抗CCP抗體含量）]/（模型組抗CCP抗體含量-空白組抗CCP抗體含量）;然后，采用CompuSyn 1.0軟件錄入附子生物堿各劑量組、白芍總苷各劑量組、配伍各劑量組大鼠的給藥劑量及其抗CCP抗體抑制率，由軟件自動(dòng)計(jì)算得到CI值。按以下標(biāo)準(zhǔn)判斷附子脂溶性生物堿與白芍總苷配伍的增效作用：CI<1，表明兩者配伍具有協(xié)同作用;CI=1，表明兩者配伍具有相加作用;CI>1，表明兩者配伍具有拮抗作用[20]。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料均以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠關(guān)節(jié)壓痛閾值測(cè)定結(jié)果

與空白組比較，給藥前及給藥第3、6天時(shí)，模型組大鼠左、右足關(guān)節(jié)壓痛閾值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，給藥前，各給藥組大鼠左、右足關(guān)節(jié)壓痛閾值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;給藥第3、6天時(shí)，羅通定組大鼠、附子生物堿各劑量組和配伍各劑量組大鼠上述指標(biāo)均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），而白芍各劑量組上述指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠關(guān)節(jié)壓痛閾值測(cè)定結(jié)果見表1。

3.2 大鼠關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)測(cè)定結(jié)果

與空白組比較，給藥前及給藥第3、6天時(shí)，模型組大鼠左、右足關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，給藥前，各給藥組大鼠左、右足關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;給藥第3天時(shí)，地塞米松組、白芍總苷高劑量組和配伍各劑量組大鼠左、右足關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)，附子生物堿各劑量組和白芍總苷低劑量組大鼠右足關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）;給藥第6天時(shí)，地塞米松組、附子生物堿高劑量組、白芍總苷各劑量組和配伍各劑量組大鼠左、右足關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)，附子生物堿低劑量組左足關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）;其余指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)測(cè)定結(jié)果見表2。

3.3 大鼠滑膜組織病理學(xué)檢查結(jié)果

空白組大鼠滑膜未見明顯增生，也未見炎性細(xì)胞大量浸潤或炎癥變化;模型組大鼠滑膜組織呈重度增生，伴有大量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及少量多核巨細(xì)胞浸潤，存在較多壞死細(xì)胞碎片，并可見較多囊腔結(jié)構(gòu)及新生血管;各給藥組大鼠的滑膜病變情況均有不同程度的改善，滑膜增生較輕微，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，少見囊腔結(jié)構(gòu)及新生血管，其中以地塞米松組和配伍高劑量組改善程度最明顯。各組大鼠左足關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)顯微圖見圖1。

3.4 大鼠血清中抗CCP抗體含量及CI

與空白組比較，模型組大鼠血清中抗CCP抗體含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，地塞米松組大鼠血清中抗CCP抗體含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），抗體抑制率為0.898 5;附子生物堿低、高劑量組，白芍總苷低、高劑量組大鼠血清中抗CCP抗體含量均有不同程度降低，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），抗體抑制率分別為0.186 1、0.293 7、0.441 8、0.478 9;配伍低、高劑量組大鼠血清中抗CCP抗體含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），抗體抑制率分別為0.578 1、0.615 8。附子脂溶性生物堿與白芍總苷配伍的CI值為0.213（<1），表明兩者配伍具有協(xié)同作用。各組大鼠血清中抗CCP抗體含量及抗體抑制率測(cè)定結(jié)果見表3。

4 討論

烏頭類中藥與白芍配伍，具有散寒止痛、通經(jīng)活絡(luò)之功效，是中醫(yī)治療風(fēng)寒濕痹證的經(jīng)典藥對(duì)之一，且沿用至今。風(fēng)寒濕痹證患者常常伴隨關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、畸形等臨床癥狀，且隨著病程延長(zhǎng)，其滑膜、骨、軟骨及韌帶等重要組織不斷被侵蝕與破壞，對(duì)患者生活造成嚴(yán)重影響[21]。本研究考察了附子脂溶性生物堿與白芍總苷配伍對(duì)風(fēng)寒濕痹證模型大鼠關(guān)節(jié)壓痛閾值、關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)、組織病理學(xué)及CI等指標(biāo)的影響，旨在為這兩種活性組分臨床聯(lián)用治療風(fēng)寒濕痹證提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

傳統(tǒng)的佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎或膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型，不能完全反映中醫(yī)“證”的特征，故近年來國內(nèi)學(xué)者在其基礎(chǔ)上，結(jié)合“風(fēng)、寒、濕”等外因刺激，建立了病證結(jié)合的風(fēng)寒濕痹證模型[22]。研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)關(guān)節(jié)炎模型比較，風(fēng)寒濕痹證模型動(dòng)物在關(guān)節(jié)腫脹、滑膜病變以及細(xì)胞凋亡程度方面表現(xiàn)更為嚴(yán)重[23];且關(guān)節(jié)表面溫度較低、血流量減少，低剪切率下全血黏度、血漿黏度以及紅細(xì)胞壓積均明顯增高，符合風(fēng)寒濕痹證“寒凝血瘀”的特征[24]。因此，本研究采用符合中醫(yī)病證結(jié)合特點(diǎn)的風(fēng)寒濕痹證模型，更符合附子與白芍在臨床應(yīng)用的實(shí)際情況。

羅通定是非甾體抗炎藥，能通過抑制環(huán)氧合酶活性、減少前列腺素合成從而顯著緩解風(fēng)寒濕痹證患者的關(guān)節(jié)疼痛，但對(duì)疾病的發(fā)展無控制作用[25]，故本研究在大鼠的關(guān)節(jié)壓痛實(shí)驗(yàn)中選取羅通定作為陽性對(duì)照藥。而糖皮質(zhì)激素作用強(qiáng)大且藥效廣泛，可通過減少炎癥組織中單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等的數(shù)量，抑制促炎性細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶的釋放，減少滑膜及周圍組織的炎性滲出，從而產(chǎn)生強(qiáng)效的抗炎、免疫抑制作用，是風(fēng)寒濕痹證治療中用于緩解炎性損傷的一類重要藥物[26]。因此，本研究中的大鼠關(guān)節(jié)腫脹實(shí)驗(yàn)、組織病理學(xué)檢查以及基于抗CCP抗體抑制率的CI計(jì)算，均選取經(jīng)典的糖皮質(zhì)激素藥地塞米松作為陽性對(duì)照藥。

大鼠關(guān)節(jié)壓痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，羅通定、附子脂溶性生物堿單用以及其與白芍總苷配伍均具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用，且配伍組的鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于單味組分給藥組。大鼠關(guān)節(jié)腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，地塞米松、附子脂溶性生物堿、白芍總苷以及二者配伍均具有較強(qiáng)的抗炎作用，且配伍組的抗炎效果優(yōu)于單味組分給藥組。組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，地塞米松組與配伍組的滑膜保護(hù)效果優(yōu)于其它單味組分給藥組。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，附子脂溶性生物堿與白芍總苷配伍可顯著緩解風(fēng)寒濕痹證患者的關(guān)節(jié)疼痛、降低關(guān)節(jié)腫脹程度、保護(hù)滑膜組織、減少炎性損傷，且二者配伍具有明顯的增效作用。

類風(fēng)濕因子（RF）和抗CCP抗體是臨床用于診斷RA的兩個(gè)重要的檢測(cè)指標(biāo)。其中，RF雖因最初在RA疾病中被發(fā)現(xiàn)而以此命名，且檢測(cè)敏感性可達(dá)70%以上，但由于其在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化癥、多肌炎或真皮炎、冷球蛋白血癥及混合型結(jié)締組織病等疾病中亦有陽性表達(dá)，所以其對(duì)RA的特異性相對(duì)較差[27]。2000年，Schellekens GA等[28]首次使用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定了RA患者血清抗CCP抗體并逐漸應(yīng)用于臨床。該抗體檢測(cè)敏感性與RF相似，但對(duì)RA疾病的特異性高達(dá)90%以上[29]。臨床研究表明，不同的RA中醫(yī)證型中，患者的血清抗CCP抗體表達(dá)亦出現(xiàn)一定的差異性，尤其以在風(fēng)寒濕型患者中的表達(dá)最高[30]。本課題組前期通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，風(fēng)寒濕痹證模型大鼠的血清RF與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但抗CCP抗體則較空白組顯著升高（P<0.01）。因此，本研究在進(jìn)行CI值計(jì)算時(shí)，采用血清抗CCP抗體作為特征性參考指標(biāo)，用于量化不同藥物的治療效果及協(xié)同作用?？笴CP抗體測(cè)定及CI值計(jì)算結(jié)果顯示，配伍組的血清抗CCP抗體抑制率顯著高于單味組分給藥組，且CI值為0.213，這提示附子脂溶性生物堿與白芍總苷配伍可能具有顯著降低風(fēng)寒濕痹證患者體內(nèi)異常升高的特異性指標(biāo)的作用。CI值的計(jì)算，為兩種組分配伍治療風(fēng)寒濕痹證的增效作用提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

綜上所述，附子脂溶性生物堿與白芍總苷配伍治療風(fēng)寒濕痹證模型大鼠的鎮(zhèn)痛、抗炎作用更強(qiáng)，對(duì)滑膜組織的保護(hù)作用更強(qiáng)，并表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)，具有明顯的增效作用。本研究為附子與白芍這一中醫(yī)經(jīng)典藥對(duì)的臨床合理聯(lián)用提供了更多的證據(jù)支持，然而中藥配伍增效的復(fù)雜作用機(jī)制還需通過更多的技術(shù)手段深入研究，以進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)論。

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（收稿日期：2019-05-16 修回日期：2019-08-11）

（編輯：段思怡）