許天陽 董坤園 宋鳳媛 錢圳 熊金璐 于澎

中圖分類號 R283.3 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）20-2845-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.20.21

摘 要 目的：優(yōu)化炒赤芍的炮制工藝，為該炮制品的質(zhì)量控制提供參考。方法：采用高效液相色譜法對炒赤芍中的芍藥苷進行含量測定。色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18，流動相為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（15 ∶ 85，V/V），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為230 nm，進樣量為10 μL。以表面顏色、斷面顏色、硬度、氣味考察炒赤芍的外觀性狀;以外觀性狀評分和芍藥苷含量評分的綜合評分為考察指標，分別對投藥量、炒制溫度、炒制時間進行單因素考察，并根據(jù)單因素試驗結(jié)果對上述3個因素進行Box-Behnken響應面法優(yōu)化，并對優(yōu)化后的炮制工藝進行驗證。結(jié)果：芍藥苷檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為0.02～4.15 mg/mL（r=0.999 9）;精密度、穩(wěn)定性、重復性、加樣回收率均符合要求。炒赤芍的最優(yōu)工藝為投藥量374.60 g、炒制溫度101.61 ℃、炒制時間20 min。在最優(yōu)工藝條件下，6次平行驗證試驗所得炒赤芍的綜合評分為97.39～98.82分，RSD為0.54%，與預測值（98.18分）相接近;炒赤芍顏色較赤芍生品略有加深，質(zhì)脆，有香味。結(jié)論：優(yōu)化所得炒赤芍的炮制工藝穩(wěn)定、可行，適用于該炮制品的制備。

關鍵詞 炒赤芍;芍藥苷;外觀性狀;響應面法;Box-Behnken設計

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To optimize the processing technology of fried Radix Paeoniae， and to provide reference for quality control of the processed products. METHODS： The content of paeoniflorin in fried Radix Paeoniae was determined by HPLC. The determination was performed on Agilent ZORBAX SB-C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution （15 ∶ 85， V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and detection wavelength was set at 230 nm. The sample size was 10 μL. The appearance character of fried Radix Peaoniae were investigated by appearance color， crosssection color， hardness and smell. Taking the comprehensive score of appearance character and paeoniflorin content as evaluation index， the dosage， stir-frying temperature and stir-frying time were investigated. According to the results of single factor test， Box-Behnken response surface methodology was used to optimize above 3 factors. The optimized processing technology was validated. RESULTS： The linear range of paeoniflorin were 0.02-4.15 mg/mL （r=0.999 9）; precision， stablity， repeatability and sample recovery rate meet the requirements. The optimal technology of fried Radix Paeoniae included the dosage of 374.60 g， frying temperature of 101.61 ℃， frying time of 20 min. Under optimal technology， comprehensive score of fried Radix Paeoniae ranged 97.39-98.82 in 6 times of parallel verification tests （RSD=0.54%）， which was close to predicted value 98.18. The color of fried Radix Paeoniae was slightly deeper than Radix Paeoniae， which was crisp and fragrant. CONCLUSIONS： The optimized processing technology of fried Radix Paeoniae is stable and feasible， and is suitable for the preparation of the processed products.

KEYWORDS? ?Fried Radix Paeoniae; Paeoniflorin; Appearance character; Response surface method; Box-Behnken design

赤芍為毛茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）或川赤芍（P. veitchii Lynch）的干燥根[1]。赤芍飲片炮制方法包括炒赤芍、酒赤芍等，其中炒赤芍是舒經(jīng)活絡、祛風行血的常用藥參桂再造丸的重要藥味之一。目前，全國有34家藥品生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)參桂再造丸，其中吉林省有9家[2]。但2015年版《中國藥典》（一部）以及《吉林省中藥炮制標準》（1986年版）中并未收載炒赤芍的炮制規(guī)范及質(zhì)量標準，因此對于吉林省中藥生產(chǎn)企業(yè)而言，炒赤芍尚無明確標準可依?！度珖兴幣谥埔?guī)范》（1988年版）雖然規(guī)定炒赤芍為“取赤芍片置鍋內(nèi)，用文火加熱，炒至顏色加深，偶有焦斑，取出放涼”[3]，但具體工藝參數(shù)并不明確，僅以炮制品表面顏色判斷炮制終點，無法有效控制炒赤芍質(zhì)量。本課題組在參與《吉林省中藥飲片炮制規(guī)范》編制項目過程中，嘗試建立了炒赤芍的炮制規(guī)范與質(zhì)量標準，并通過吉林省炮制規(guī)范項目定點中試企業(yè)對結(jié)果進行了驗證。

由于炒赤芍的炮制工藝涉及炒制時間、炒制溫度、投藥量等因素的交互作用，而Box-Behnken響應面設計法適用于多因素、多水平的工藝考察試驗，其可通過指標量化和非線性擬合建立直觀的數(shù)學模型，預測科學客觀、準確性較高[4]，因此本研究采用該設計法優(yōu)化炒赤芍的炮制工藝，以期為該炮制品的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-2030型高效液相色譜儀，包括四元梯度泵、自動進樣器、紫外檢測器（日本 Shimadzu公司）;KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市江南儀器廠）;DE-100型高速萬能粉碎機（浙江紅景天工貿(mào)有限公司）;JM-A5002型電子天平（諸暨市超澤衡器設備有限公司）;MS-5型炒貨機（常州市金壇邁斯機械有限公司）;DT-810迷你型紅外測溫儀（深圳華盛昌機械實業(yè)有限公司）。

1.2 藥材與試劑

赤芍飲片（批號：20171031）購于長春市北京同仁堂大藥房，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學藥學院蔡廣知副教授鑒定為毛茛科植物芍藥（P. lactiflora Pall.）的根，并經(jīng)實驗室檢測符合2015年版《中國藥典》（一部）赤芍飲片項下規(guī)定，芍藥苷含量高于1.5%[1];芍藥苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110736-201741，純度：95.7%）;乙腈、甲醇為色譜純，磷酸二氫鉀為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 炒赤芍飲片樣品的制備

按《全國中藥炮制規(guī)范》（1988年版）赤芍項下炒赤芍相關規(guī)定，取赤芍飲片適量，用文火加熱，炒至顏色加深，偶有焦斑，取出放涼，即得炒赤芍飲片[3];參照2015年版《中國藥典》（一部）赤芍項下方法[1]，取炒赤芍飲片經(jīng)粉粹機粉碎，過篩得到粗粉。

2.2 炒赤芍飲片質(zhì)量評分規(guī)則

中藥飲片炮制過程中，炮制的程度及終點的判斷對飲片質(zhì)量優(yōu)劣有著重要影響。《全國中藥炮制規(guī)范》（1988年版）僅以炒赤芍飲片的外觀性狀判斷炮制程度，不夠客觀。綜合考慮《全國中藥炮制規(guī)范》（1988年版）對炒赤芍炮制程度及2015年版《中國藥典》（一部）對赤芍飲片質(zhì)控指標的有關要求，本研究擬從外觀性狀及芍藥苷含量兩方面評價炒赤芍飲片質(zhì)量。

2.2.1 外觀性狀評分規(guī)則 根據(jù)《全國中藥炮制規(guī)范》（1988年版）赤芍項下對炒赤芍炮制程度的要求[3]，炒赤芍外觀性狀評價應包括表面顏色、斷面顏色、硬度以及氣味的評分，分別記為W1～W4，即外觀性狀評分W=W1+W2+W3+W4，評分高者為佳，具體規(guī)則見表1。

2.2.2 含量測定評分規(guī)則 赤芍中含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、兒茶素、沒食子酰葡萄糖、丹皮酚、沒食子酸等活性成分，其中芍藥苷含量較高，歷版《中國藥典》中也一直以芍藥苷作為藥材質(zhì)量檢測的指標。因此，本研究參照2015年版《中國藥典》（一部）赤芍項下的含量測定指標[1]，以芍藥苷作為炒赤芍含量測定的指標性成分，并以同批次生品中芍藥苷含量值為參照將數(shù)據(jù)進行歸一化處理。

2.2.3 綜合評分 為使試驗結(jié)果能夠全面反映炒赤芍質(zhì)量，本研究對外觀性狀分值與含量測定分值分別賦予了一定的權重。由于外觀性狀依靠個人感官判斷，客觀性不足，權重不宜過高，因此筆者根據(jù)經(jīng)驗賦予外觀性狀評分權重為30%、芍藥苷含量評分權重為70%。綜合評分（Y）=[Wi Wmax] ×30+[Hi

Hr] ×70，滿分為100分。其中，Wi為某批次炒赤芍外觀性狀得分，Wmax為其外觀性狀最大值;Hi是指該批次炒赤芍中芍藥苷含量，Hr是指該批次生品中芍藥苷的含量。

2.3 芍藥苷的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（15 ∶ 85，V/V）;流速：1.0 mL/min;柱溫：30 ℃;檢測波長：230 nm;進樣量：10 μL。

2.3.2 對照品溶液的制備 取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥器中干燥36 h的芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得。

2.3.3 炒赤芍供試品溶液的制備 取“2.1”項下的炒赤芍粗粉約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，浸泡4 h，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）處理20 min，放冷;再次稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過;取續(xù)濾液1 mL，用甲醇定容至10 mL，搖勻，即得。

2.3.4 赤芍供試品溶液的制備 以炒赤芍同批次生品制備赤芍供試品溶液。參照2015年版《中國藥典》（一部）赤芍項下方法[1]，取赤芍飲片經(jīng)粉粹機粉碎，過篩得到粗粉。 取上述赤芍粗粉約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，浸泡4 h，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）處理20 min，放冷;再次稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過;取續(xù)濾液1 mL，用甲醇定容至10 mL，搖勻，即得。

2.3.5 陰性對照溶液的制備 以甲醇為陰性對照溶液。

2.3.6 系統(tǒng)適用性試驗 精密吸取上述對照品溶液、炒赤芍供試品溶液、赤芍供試品溶液以及陰性對照溶液各10 μL，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可見，在該色譜條件下，理論板數(shù)按芍藥苷峰計不低于3 000，芍藥苷與其他成分的分離度均大于1.5，陰性對照無干擾。

2.3.7 方法學考察 取“2.3.2”項下對照品溶液適量，加甲醇稀釋，制得系列對照品工作溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，mg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為y=13 905 683.93x+119 418.553 2（r=0.999 9），結(jié)果表明芍藥苷質(zhì)量濃度在0.02～4.15 mg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。另經(jīng)方法學驗證，精密度（芍藥苷峰面積RSD=1.08%，n=6）、穩(wěn)定性（芍藥苷峰面積RSD=3.51%，n=8）、重復性（芍藥苷峰面積RSD=3.65%，n=6）、加樣回收率（芍藥苷平均加樣回收率為99.91%，RSD=1.68%，n=6）均符合2015年版《中國藥典》（四部）要求[4]。

2.4 炒赤芍炮制工藝單因素試驗

中藥飲片炒制過程中，由于投藥量（A）、炒制溫度（B）、炒制時間（C）對炒制結(jié)果有著重要影響，因此本研究根據(jù)“2.2”項下評分規(guī)則，對上述因素進行考察。

2.4.1 投藥量 根據(jù)試驗所用的炒貨機容量以及樣品物理性狀，經(jīng)預試驗考察，發(fā)現(xiàn)炒貨機正常工作的最大投藥量為600 g，最小投藥量為200 g。因此，取凈赤芍飲片5份，每份不同質(zhì)量（200、300、400、500、600 g），分別于110 ℃下炒制15 min，考察投藥量對外觀性狀及芍藥苷含量的影響，結(jié)果見表2、表3（注：同批次赤芍飲片生品中芍藥苷的含量為4.30%，下同，表中“△”越多說明硬度/氣味越大）。

由表2、表3結(jié)果可知，投藥量對炒赤芍外觀性狀影響較為明顯，對芍藥苷含量影響不大;投藥量為300～500 g時炒赤芍的外觀性狀評分較高。考慮到炒藥機容量，確定投藥量的優(yōu)化范圍為300～500 g。

2.4.2 炒制溫度 取凈赤芍飲片5份，每份400 g，分別于不同溫度（60、90、110、130、150 ℃）下炒制15 min，考察炒制溫度對外觀性狀及芍藥苷含量的影響，結(jié)果見表4、表5。

由表4、表5結(jié)果可知，炒制溫度對炒赤芍外觀性狀及芍藥苷含量皆有顯著影響。因此，確定炒制溫度的優(yōu)化范圍為90～130 ℃。

2.4.3 炒制時間 取凈赤芍飲片5份，每份400 g，分別于110 ℃下炒制不同時間（5、10、15、20、25 min），考察炒制時間對外觀性狀及芍藥苷含量的影響，結(jié)果見表6、表7。

由表6、表7結(jié)果可知，炒制時間對炒赤芍的外觀性狀及芍藥苷含量皆有顯著影響，當炒制時間為10～20 min時，其綜合評分較高。因此，確定炒制時間的優(yōu)化范圍為10～20 min。

2.5 Box-Behnken響應面優(yōu)化炒赤芍炮制工藝

2.5.1 Box-Behnken試驗設計 在單因素試驗的基礎上，根據(jù)中心組合試驗設計原理，采用響應面法在3因素3水平上對炒赤芍炮制工藝進行優(yōu)化。因素與水平見表8。以投藥量（A）、炒制溫度（B）、炒制時間（C）為自變量，以外觀性狀評價和芍藥苷含量的綜合評分（Y）為因變量，Box-Behnken試驗設計見表9。

2.5.2 模型擬合 參照表9進行響應面法工藝優(yōu)化試驗，并按“2.2”項下綜合評分公式進行評分，結(jié)果見表10、表11，回歸模型方差分析結(jié)果見表12。

由表12可知，失擬項F值為4.07，表明該回歸方程對試驗的擬合較好?；貧w模型的F值為34.23，表明回歸模型具有高度顯著性。回歸方程具有顯著性，相關系數(shù)為0.949 2，說明響應值的變化有94.92%來源于可選變量，因此回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可以利用此模型對炒赤芍炮制質(zhì)量的綜合評分進行分析。通過擬合，得到響應值水平的二次方程為：Y=94.78+0.23×A-8.92×B+2.22×C+0.39×AB-0.56×AC-2.06×BC-1.41×A2-13.19×B2-1.19×C2。

2.5.3 各因素交互作用分析 根據(jù)回歸分析結(jié)果作相應的響應曲面圖及其等高線圖，以確認投藥量（A）、炒制溫度（B）、炒制時間（C）等3個因素對炒赤芍質(zhì)量綜合評分（Y）的影響，結(jié)果見圖2。

依據(jù)各因素對響應值所構成的三維空間的曲面圖，可直觀地反映各因素對響應值的影響，曲線越陡則表明該因素對響應值的影響越大。由圖2可見，投藥量與炒制溫度、炒制溫度與炒制時間的曲面較陡，說明炒制溫度與炒制時間對炒赤芍的質(zhì)量綜合評分有顯著影響;而投藥量與炒制時間曲面較平，說明投藥量影響較小。

2.5.4 最優(yōu)制備工藝的確定 基于Design-Expert V8.0.6.1

實驗設計軟件對所建模型進行參數(shù)最優(yōu)分析，得最優(yōu)制備工藝為投藥量374.60 g、炒制溫度101.61 ℃、炒制時間20 min;炒赤芍的性狀外觀評分為29.22，芍藥苷含量評分為68.96，綜合評分為98.18。

2.5.5 工藝驗證 取“1.2”項下赤芍飲片適量，按上述最優(yōu)制備工藝進行驗證，平行操作6次，結(jié)果見表13。

由表13可知，6次驗證試驗所得炒赤芍的顏色較其生品略有加深，質(zhì)脆，有香味;綜合評分平均值為97.86，RSD值為0.54%;與預測分值（98.18）相對誤差較小。這說明該工藝條件穩(wěn)定可行，模型擬合效果好。

3 討論

近些年，國內(nèi)學者將Box-Behnken響應面法廣泛應用于藥學研究領域[5-7]。該方法突破了傳統(tǒng)數(shù)理統(tǒng)計不能在已有“點”的基礎上對整體的“面”數(shù)據(jù)進行預測的局限性[8]，具有實驗次數(shù)少、精密度高、預測性好、科學可行的優(yōu)點。

研究中發(fā)現(xiàn)，以甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（40 ∶ 65，V/V）為流動相時，色譜峰分離度與拖尾因子都不符合要求。因此，優(yōu)化流動相比例，分別以甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（35 ∶ 65、40 ∶ 60，V/V）、甲醇-水（40 ∶ 60、35 ∶ 65，V/V）以及乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（20 ∶ 80、15 ∶ 85，V/V）為流動相進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（15 ∶ 85，V/V）為流動相時，色譜峰分離度更好，因此最終確定以該流動相進行含量測定。

本研究采用Box-Behnken響應面法優(yōu)化了炒赤芍的炮制工藝，提出了具體可控的工藝參數(shù)，經(jīng)吉林省炮制規(guī)范研究中試定點生產(chǎn)企業(yè)吉林省國安藥業(yè)有限公司在本研究結(jié)果的基礎上進行相應的調(diào)整，經(jīng)實際生產(chǎn)驗證，該工藝穩(wěn)定、可靠。

炒制后芍藥苷的減少，可能是因炒制造成的損失。炒赤芍中芍藥苷較生品在不同程度上有所降低，有可能起到稍緩其藥性的作用，使其功效以養(yǎng)血斂陰為主，但具體內(nèi)在關聯(lián)需后續(xù)開展相關研究進行探索。赤芍中含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、兒茶素、丹皮酚、沒食子酸等多種活性成分[9]，經(jīng)炒制后含量發(fā)生變化的成分不僅只有芍藥苷。因此，本研究僅以芍藥苷作為炒赤芍唯一活性成分含量檢測指標不夠全面，后續(xù)工作中可建立多種活性成分同時檢測或采用指紋圖譜[10]等相關方法，對炒赤芍進一步進行全面的質(zhì)量控制。

在以往的研究中，更多的是關注藥材指標性成分含量而忽視對外觀性狀的考察[11]，本試驗將外觀性狀評價與指標性成分含量測定結(jié)果賦予分值和不同權重后，共同作為工藝考察指標，是中藥現(xiàn)代化研究的一種探索。但外觀性狀評價易受感官因素影響，建議在類似的研究中引入色度儀、硬度計、電子鼻等設備[12-13]，使外觀評價指標更加可視化、數(shù)據(jù)化，以避免主觀因素的干擾。

綜上所述，本研究優(yōu)化了炒赤芍的炮制工藝，得到了具體的炮制溫度、炮制時間以及相應設備的投藥量;經(jīng)驗證，優(yōu)化所得炒赤芍炮制工藝穩(wěn)定、可行，適用于該炮制品的制備。

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（收稿日期：2018-11-16 修回日期：2019-09-11）

（編輯：余慶華）