孫宇飛　方宇婷　鄧冬梅

摘??? 要：研究微波快速提取可用于qPCR分析的酵母基因組DNA的方法.在微波作用下分別采取干法和濕法制備酵母基因組DNA樣品提取物與試劑盒法制備的提取物進(jìn)行比較，通過(guò)紫外分光法、瓊脂糖凝膠電泳、常規(guī)PCR及qPCR等方法檢測(cè)提取物濃度與純度.結(jié)果表明微波法提取物可用于常規(guī)PCR分析，其中微波干法提取物用于qPCR分析可獲得準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果.

關(guān)鍵詞：微波;qPCR;基因拷貝數(shù);酵母基因組DNA

中圖分類號(hào)：Q78;Q503??????????? DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2019.02.011

0??? 引言

畢赤酵母是目前廣泛使用的一種重組蛋白表達(dá)宿主，具有生長(zhǎng)速度快、培養(yǎng)方便、培養(yǎng)基廉價(jià)且適合表達(dá)真核生物的重組蛋白等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在科學(xué)研究和生產(chǎn)實(shí)踐中得到廣泛應(yīng)用[1-3].然而在畢赤酵母工程菌株構(gòu)建過(guò)程中，有部分重組子細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒與基因組DNA發(fā)生多次整合，導(dǎo)致這些重組子攜帶了多拷貝外源基因.多拷貝外源基因?qū)τ诋叧嘟湍讣?xì)胞表達(dá)外源蛋白具有影響，通?？墒雇庠吹鞍妆磉_(dá)量增加[4]，但也有部分情況會(huì)使外源蛋白表達(dá)量降低[5].另外，多拷貝重組子面臨遺傳穩(wěn)定性的風(fēng)險(xiǎn)，后代容易發(fā)生丟失高量表達(dá)的性狀，影響工程菌株在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用.而且多拷貝現(xiàn)象也會(huì)影響對(duì)外源基因在畢赤酵母宿主上表達(dá)量的正確評(píng)估：如果未進(jìn)行拷貝數(shù)鑒定，將無(wú)從判斷重組子的高表達(dá)量是由于自身表達(dá)調(diào)控因素引起的還是由于具有多基因拷貝數(shù)引起.因此在使用畢赤酵母作為外源蛋白表達(dá)宿主的研究中，對(duì)重組畢赤酵母菌株基因組DNA內(nèi)外源基因拷貝數(shù)的鑒定顯得非常必要.

定量PCR（Quantitative PCR，qPCR）方法是一種可準(zhǔn)確鑒定核酸樣品中目的片段數(shù)量的方法，可用于畢赤酵母重組子的外源基因拷貝數(shù)鑒定[6-7].然而qPCR分析對(duì)樣品純度有一定要求，而常規(guī)高純度樣品制備需要價(jià)格昂貴的基因組提取試劑盒.微波法制備分子生物學(xué)樣品已有較多實(shí)例[8-10]，具有簡(jiǎn)便快捷的特點(diǎn)，但用于qPCR樣品的制備仍未見(jiàn)報(bào)道.本文利用微波爐開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)便、廉價(jià)的快速制備可用于qPCR分析的酵母基因組DNA樣品的方法，使畢赤酵母的外源基因拷貝數(shù)鑒定時(shí)間縮短且費(fèi)用降低.

1??? 材料與方法

1.1?? 菌株、儀器及試劑

畢赤酵母（Pichia pastoris GS115）重組菌株KC-5，整合雙拷貝外源CALB基因，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建.Nanodrop1000微量核酸蛋白測(cè)定儀（Thermo），GeneAmp9700 PCR擴(kuò)增儀（ABI），7500 Real-time PCR擴(kuò)增儀（ABI），凝膠電泳成像系統(tǒng)（BioRad），Media微波爐（額定微波功率700 W），Centrifuge 5418離心機(jī)（Eppendorf）.Dream Taq PCR試劑盒（Fermentas），DNA Marker（Takara），SYBR Premix EX Taq II qPCR試劑盒（Takara），PCR八聯(lián)管（Axygen），EZNA Yeast DNA試劑盒（Omega）.YPD培養(yǎng)基（1% Yeast Extract，2% Peptone，2% Dextrose，固體平板加入2%瓊脂粉），其余為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?

1.2?? 微波輔助提取基因組DNA

將菌株KC-5在YPD平板上劃線培養(yǎng)3 d（30 oC）.用無(wú)菌牙簽刮取直徑約5 mm的單菌落到0.5 mL無(wú)菌離心管中.

1）微波干法：將樣品置于微波爐以中低火處理（額定微波功率30%）5 min，處理時(shí)爐中同時(shí)放入盛有50 mL水的三角瓶.處理完畢在離心管內(nèi)加入20 μL TE緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH=8.0），手指劇烈彈動(dòng)離心管1 min，4 000×g離心1 min，上清液即為基因組DNA樣品.

2）微波濕法：在離心管中先加入20 μL TE緩沖液，混勻后再同樣微波處理5 min.手指劇烈彈動(dòng)離心管1 min，4 000×g離心1 min，取上清液備用.

取2 μL樣品用微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè).

1.3?? 試劑盒法提取基因組DNA

在50 mL 離心管（含5 mL YPD液體培養(yǎng)基）中接種KC-5單菌落，搖床培養(yǎng)24 h（250 r/min，30 oC）.將菌液調(diào)至OD600=1，取1 mL菌液經(jīng)4 000×g離心5 min，收集菌體按照EZNA Yeast DNA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取酵母基因組DNA.用100 μL試劑盒自帶EB緩沖液洗脫，取2 μL樣品用微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè).

取5 μL 試劑盒法、微波干法和微波濕法的基因組DNA提取液進(jìn)行瓊脂糖凝膠（1%，m/v）電泳分析.

1.4?? PCR檢驗(yàn)基因組DNA

取微波法和試劑盒法提取的基因組DNA溶液用TE緩沖液分別稀釋至20 ng/μL用作模板.配制50 μL PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增1 392 bp的畢赤酵母his4基因部分片段（GenBank No. U14126.1），反應(yīng)體系為Dream Taq預(yù)混液25 μL，ddH2O 19 μL，PUhis4（5′-CAGCATCAGGGAAGTGG-3′）2 μL，PDhis4（5′-TTGGCAGAAAGAGTTGT-3′）2 μL，DNA模板2 μL.空白對(duì)照組不加DNA模板.擴(kuò)增程序?yàn)?4 oC預(yù)變性5 min，接著30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)（94 oC 30 s，55 oC 30 s，72 oC 1.5 min），最后再72 oC延伸7 min.

取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠（1%，m/v）電泳分析.

1.5?? 熒光定量PCR（qPCR）檢驗(yàn)基因組DNA

將試劑盒法提取的基因組DNA用ddH2O稀釋10倍作為模板，配制25 μL qPCR反應(yīng)體系分別擴(kuò)增CALB基因和參考基因G片段，而微波干法提取的基因組DNA則直接用為模板.首先配制7倍體積的公共溶液（SYBR Premix EX Taq II溶液 78 μL， ddH2O 63 μL，ROX Reference Dye II 3.1 μL，基因組DNA模板6.2 μL），混勻后分裝兩管，每管75 μL.其中一管加入引物PRTC1（5′-CCAAACCCATCCTTCTCG-3′）和PRTC2（5′-GGCGTTGACCATGTACTCC-3′）各1.5 μL，另一管加入引物PRTG1（5′-GTCGGGACACGCCTGAAACT-3′）和PRTG2（5′-CCACCTTTTGGACCCTATTGAC-3′）各1.5 μL，混勻后分別以25 μL/管分裝到八聯(lián)管的3個(gè)小管中進(jìn)行擴(kuò)增.擴(kuò)增程序?yàn)?5 oC預(yù)變性30 s，40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)（95 oC變性5 s，60 oC延伸34 s同時(shí)收集熒光數(shù)據(jù)）. 平行進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，用參考基因的△CT法計(jì)算CALB基因拷貝數(shù)[11].

2??? 結(jié)果與分析

2.1?? 酵母基因組DNA紫外吸收檢測(cè)

在波長(zhǎng)220 ～350 nm的紫外光范圍內(nèi)掃描樣品DNA的吸收峰曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1，樣品DNA濃度見(jiàn)表1. 3種方法都能夠獲得具有核酸特征吸收峰（260 nm）的樣品，但樣品的濃度和純度差異顯著.根據(jù)260 nm吸收值計(jì)算提取物核酸濃度，試劑盒法提取物的濃度最低， 微波干法提取物的濃度最高， 微波濕法提取物的濃度居中.這似乎提示微波爐法提取物的核酸含量高、效果好.然而結(jié)合260/280及260/230的紫外光吸收比值進(jìn)行分析，可發(fā)現(xiàn)試劑盒法提取物的核酸樣品純度很高（260/280=1.8），而微波法提取物則因含有較多雜質(zhì)使核酸樣品純度降低.這些雜質(zhì)（如RNA、DNA片段、核苷酸等）的增色效應(yīng)使微波法提取物260/280值提高，也導(dǎo)致基因組DNA表觀濃度增大.另外胞內(nèi)釋放的碳水化合物、多肽等雜質(zhì)降低了微波法提取物的260/230值.微波干法和微波濕法提取物中的雜質(zhì)主要成分也有所區(qū)別，總體而言，微波干法提取物中核酸類雜質(zhì)較多而濕法提取物中碳水化合物、多肽類雜質(zhì)較多.

2.2?? 酵母基因組DNA電泳

為了檢驗(yàn)3種方法提取物中基因組DNA的直觀濃度，各取5 μL提取液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析.試劑盒法提取物在圖2泳道3中顯示具有一條約15 kb大小的較清晰條帶，條帶彌散少，說(shuō)明試劑盒法獲得的基因組DNA質(zhì)量較好.而兩種微波法的提取物在圖2中都沒(méi)有條帶，說(shuō)明提取物中基因組DNA實(shí)際濃度很低以至于所加樣液中基因組DNA量達(dá)不到溴化乙錠染料顯色閾值.結(jié)合紫外吸收曲線的結(jié)果進(jìn)行分析，說(shuō)明微波法提取物的真實(shí)核酸濃度比試劑盒法提取物濃度（29 ng/μL）低，其表觀濃度高應(yīng)當(dāng)是樣品中雜質(zhì)增色效應(yīng)導(dǎo)致.

2.3?? 常規(guī)PCR擴(kuò)增his4基因

為了檢驗(yàn)微波爐法提取物是否可用于常規(guī)PCR擴(kuò)增，選取畢赤酵母GS115菌株的his4基因作為目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析.圖3（a）顯示試劑盒法提取物和兩種微波法提取物都可用作模板，擴(kuò)增出大小與預(yù)期相符的his4基因片段（1 392 bp）且無(wú)明顯拖帶和彌散現(xiàn)象，說(shuō)明這3種方法提取的DNA都可用于常規(guī)PCR擴(kuò)增反應(yīng).然而與試劑盒法提取物相比，微波法提取物的PCR產(chǎn)物條帶較淡，說(shuō)明其樣液中基因組DNA濃度較小.根據(jù)3種提取物表觀濃度數(shù)據(jù)（表1）統(tǒng)一配制成“29”ng/μL樣品溶液并進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢驗(yàn)（圖3（b）），發(fā)現(xiàn)三者仍都能擴(kuò)增出1 392 bp的his4基因條帶，然而各條帶的濃淡差異顯著，進(jìn)一步說(shuō)明微波法提取物的基因組DNA濃度低于試劑盒法提取物.此外圖3（b）中微波干法提取物的PCR產(chǎn)物條帶最淡，這是因?yàn)樗肞CR模板溶液稀釋倍數(shù)較大（53倍），如用提取物原液為模板，則其PCR產(chǎn)物條帶與微波濕法差異并不顯著.總之，微波干法和濕法提取物都能用于常規(guī)PCR擴(kuò)增，效果并無(wú)明顯差異.

2.4?? 熒光定量PCR（qPCR）分析

因熒光定量PCR分析對(duì)樣品的純度和濃度有一定要求，為了保證分析結(jié)果的穩(wěn)定與準(zhǔn)確，使用糖類、多肽等雜質(zhì)相對(duì)較少的微波干法提取物作為PCR模板進(jìn)行qPCR分析，同時(shí)以試劑盒法提取物為參照檢驗(yàn)兩者分析結(jié)果的差異.另外為了檢驗(yàn)此樣品的定量分析效果，選擇具有兩拷貝CALB脂肪酶基因的重組畢赤酵母菌株KC-5進(jìn)行qPCR分析.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，無(wú)論是以試劑盒提取的樣品（圖4（a））還是微波法提取的樣品（圖4（b））作為模板進(jìn)行qPCR分析，都獲得令人滿意的穩(wěn)定而準(zhǔn)確的CALB拷貝數(shù)數(shù)據(jù).微波法提取物qPCR分析結(jié)果顯示KC-5的CALB基因拷貝數(shù)為1.92（±0.145），而試劑盒提取物qPCR分析結(jié)果顯示KC-5的CALB基因拷貝數(shù)為2.01（±0.088）.雖然微波法提取物的CALB基因CT值達(dá)到26.9，比試劑盒法提取物的CALB基因CT值大了8.2，即其提取物中基因組DNA濃度僅為試劑盒法提取物的2-8.2（0.34 %，約10 pg/μL），但這并不影響微波法提取物用于qPCR分析的結(jié)果準(zhǔn)確性與精確性.

3??? 討論

對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行分子生物學(xué)分析時(shí)首先需要獲得其基因組DNA，但結(jié)構(gòu)堅(jiān)韌的酵母細(xì)胞壁給破壁提取基因組DNA及后續(xù)PCR檢測(cè)帶來(lái)阻礙.如果直接使用酵母菌液或菌苔作為模板進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，細(xì)胞破壁的過(guò)程主要依靠PCR預(yù)變性和變性階段的熱處理，不能保證提取效果使PCR檢測(cè)的結(jié)果不穩(wěn)定[12].因此酵母細(xì)胞的破壁成為酵母菌落PCR的關(guān)鍵.目前常用的破壁方法主要有煮沸法、煮沸凍融法、酶法、超聲波法、玻璃珠研磨法、微波法等[12-15].煮沸法設(shè)備試劑要求簡(jiǎn)單，但效果同樣不穩(wěn)定.煮沸凍融法利用高低溫差及胞內(nèi)水分結(jié)晶膨脹破壁，效果相對(duì)較好但處理時(shí)間長(zhǎng)、設(shè)備貴.酶法采用水解酶類（如蝸牛酶、溶菌酶）溫和破壁，對(duì)DNA損傷小但處理耗時(shí)且破壁不完全.超聲波法利用振蕩引起的機(jī)械剪切力和水力空化效應(yīng)能較好的達(dá)到細(xì)胞破壁效果，但對(duì)設(shè)備的要求高，而且超聲處理產(chǎn)生的自由基對(duì)核酸等生物分子有損傷.玻璃珠研磨法成本低，但操作過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)，也有專用玻璃珠振蕩破壁儀可快速破壁但成本昂貴.微波法利用微波對(duì)酵母細(xì)胞內(nèi)部偶極分子（如液泡中的水分）高頻往復(fù)運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)生的內(nèi)摩擦熱而使胞內(nèi)水分溫度升高汽化從而達(dá)到脹破細(xì)胞壁的目的.該方法破壁快速簡(jiǎn)便，且只需廉價(jià)微波爐即可進(jìn)行，因此在生物大分子提取中得以應(yīng)用.有研究報(bào)道對(duì)長(zhǎng)期浸泡于福爾馬林的樣品采用微波法也能較好的提取DNA，?DNA含量可達(dá)（2.16±0.95 ）μg/μL[16].本研究比較了微波輔助的干法和濕法提取效果.微波干法以酵母菌落為處理對(duì)象，微波對(duì)酵母細(xì)胞的作用更直接而強(qiáng)烈，但胞內(nèi)核酸酶可能會(huì)在基因組DNA釋放出來(lái)時(shí)破壞DNA的結(jié)構(gòu);微波濕法以TE緩沖液懸浮的酵母菌液為處理對(duì)象，TE緩沖液可以在基因組DNA釋放時(shí)抑制胞內(nèi)核酸酶的作用從而保護(hù)DNA，期待獲得更完整的基因組DNA分子樣品.

根據(jù)核酸分子在260 nm處的特征吸收峰計(jì)算核酸濃度是分子生物學(xué)常用技術(shù)之一.該方法簡(jiǎn)便快捷，然而對(duì)樣品的純度有較高要求.根據(jù)樣品260/280及260/230數(shù)據(jù)可定性分析樣品中雜質(zhì)的主要類型.本研究中，微波干法提取物的260/280值偏大，提示雜質(zhì)主要為RNA、寡核苷酸、核苷酸類產(chǎn)生增色效應(yīng)的分子.由于微波能夠使偶極分子加快振動(dòng)產(chǎn)生大量熱能，因此微波對(duì)有極性的DNA分子也有一定作用.微波作用的時(shí)間、強(qiáng)度（功率）直接影響到DNA分子的完整性，低強(qiáng)度的微波輻射就能使大鼠DNA損傷[17]，還會(huì)降低DNA樣品的可擴(kuò)增性[18].在作用時(shí)間相同的情況下，干法提取時(shí)微波傳遞給DNA分子的能量比濕法提取的大，因?yàn)闈穹尤氲腡E緩沖液消耗了部分微波的能量.另外微波干法提取過(guò)程中胞內(nèi)核酸酶有可能對(duì)DNA分子造成傷害，也會(huì)增加樣品的紫外吸收.因此干法提取物中DNA的損傷程度應(yīng)更大，受損的DNA分子由于增色效應(yīng)導(dǎo)致表觀濃度增加.濕法提取物的260/280值較小，但260/230值較大，說(shuō)明含有較多蛋白、多糖類雜質(zhì).其來(lái)源應(yīng)當(dāng)是高溫的TE緩沖液將細(xì)胞壁的蛋白和多糖類物質(zhì)提取出來(lái)成為雜質(zhì).微波干法和濕法都可提取出酵母基因組DNA，但干法提取物中DNA損失較大而蛋白、多糖雜質(zhì)較少;濕法提取物中DNA較完整但蛋白、多糖類雜質(zhì)較多.為了獲得高質(zhì)量的DNA樣品，可聯(lián)合其他技術(shù)共同處理.如采用SDS、溶菌酶、劇烈振蕩和微波共同作用可對(duì)難處理的放線菌細(xì)胞進(jìn)行破壁，提取較為滿意的基因組DNA樣品[19].

使用試劑盒法提取物進(jìn)行qPCR分析效果好，但是樣品平均提取時(shí)間長(zhǎng)達(dá)5 h，且需要專用細(xì)胞壁破壁儀器及較昂貴的試劑盒.根據(jù)核算，試劑盒法每個(gè)樣品提取成本約需20元，與此相比微波法制備微量基因組DNA樣品所耗時(shí)間僅10 min，僅需準(zhǔn)備廉價(jià)的微波爐以及幾乎可忽略的耗費(fèi).因此微波法提取的酵母基因組DNA非常適合用于通過(guò)qPCR法大量快速鑒定酵母重組子的基因拷貝數(shù)等應(yīng)用.

微波作用形式對(duì)提取效果也有影響.孢子具有極堅(jiān)固的外壁，其DNA的提取難度較高.將炭疽孢子樣品放在鋁箔膜構(gòu)成的“蝴蝶結(jié)”小穴結(jié)構(gòu)中，微波被引導(dǎo)聚焦到孢子上，20 s即可完全提取所有孢子的DNA[20].因此了解微波作用的機(jī)制才能更好的開(kāi)發(fā)微波輔助提取基因組DNA的新方法.微波除了可用于輔助提取基因組DNA外還具有其他生物學(xué)過(guò)程輔助效果，如可幫助加快DNA限制性酶切、連接、活化等酶法操作DNA的過(guò)程[21]，只要20～50 s處理即可達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)處理效果，極大地節(jié)約了處理時(shí)間.隨著微波作用機(jī)理的不斷深入探討，微波輔助處理生物樣品必將獲得更廣泛的應(yīng)用.

4??? 結(jié)論

使用微波干法和微波濕法制備的酵母提取物具有核酸紫外吸收特性，經(jīng)PCR擴(kuò)增分析證實(shí)其含有酵母基因組DNA，可作為模板用于常規(guī)PCR擴(kuò)增分析.微波干法提取物用于qPCR分析具備一定準(zhǔn)確性和精確性，可滿足大量篩選酵母重組子基因拷貝數(shù)的要求.

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A rapid yeast genomic DNA extracting method assisted by microwave using in qPCR test

SUN Yufei1，2， FANG Yuting1，2， DENG Dongmei1，2

（1.School of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou 545006， China; 2.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources （Guangxi University of

Science and Technology） ，Liuzhou 545006， China? ）

Abstract： A rapid yeast genomic DNA extracting method assisted by microwave using in qPCR test was studied. The yeast genomic DNA was prepared by the microwave-assisted dry method and the wet method respectively. Then the samples were tested by ultraviolet spectrometry， agarose gel?????????????? electrophoresis， general PCR amplification and quantitative PCR assay successively， comparing with the sample prepared by a commercial reagent kit. Results show that both extracts from the????????????????? microwave-assisted dry method and the wet method were able to use for general PCR amplification. Moreover， a considerable accurate and precise result can be achieved when the extract from dry method was used in the qPCR assay.

Key words： microwave; quantitative PCR; gene copy number; yeast genomic DNA

（責(zé)任編輯：黎?? 婭）