呂曉娜 李夢 李紅霞 陳銘陽 徐清 張帆 楊瑤珺 劉春生

摘要? 目的：建立中藥龜甲的HPLC指紋圖譜，以達(dá)到鑒別龜甲與其混偽品的目的。方法：收集不同產(chǎn)地的龜甲及其混偽品21批，按上下甲進(jìn)行分類，共42個(gè)樣品。通過鹽酸水解、脫磷、脫鈣等前處理，以6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基-氨基甲酸酯（AQC）進(jìn)行衍生化反應(yīng)，采用C18色譜柱（3.9 mm×150 mm，3 μm），柱溫37 ℃，以乙腈，水，緩沖鹽為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速1.00 mL/min，檢測波長248 nm。采用“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（《中華人民共和國藥典》2012版）對(duì)正品龜甲上甲與下甲、正品與常見混偽品進(jìn)行相似度分析。結(jié)果：所建立的指紋圖譜具有較好的精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。正品龜甲的上下甲相似度為0.932～0.995。正品與混偽品的相似度在0.90以下者占90.91%。結(jié)論：正品上、下甲的HPLC圖譜差異較小，正品與混偽品差異較明顯。所建立的HPLC指紋圖譜可用于龜甲的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

關(guān)鍵詞? 龜甲;混偽品;HPLC指紋圖譜;相似度;評(píng)價(jià)

HPLC Fingerprint of Carapax et Plastrum Testudinis

Lyu Xiaona，Li Meng，Li Hongxia，Chen Mingyang，Xu Qing，Zhang Fan，Liu Chunsheng，Yang Yaojun

（School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

Abstract Objective： To establish HPLC （High Performance Liquid Chromatography） fingerprint of Carapax et Plastrum Testudinis by identifying tortoiseshells and their adulterants.? Methods： A total of 21 batches of tortoiseshells and their adulterants from different habitats was collected，and 42 samples were classified by the carapace and plastron. The pre-treatment of acid hydrolysis，dephosphorization and decalcification pretreatment with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate （AQC） derivatization reaction was carried out using the C18 column （3.9×150 mm，3 μm），the column temperature of 37 ℃. Acetonitrile，water，salt buffer were used as mobile phase for gradient elution at a flow rate of 1.00 mL/min and a the detection wavelength of 248 nm. The system of similarity evaluation （Pharmacopoeia 2012） was used to analyze tortoiseshells by the carapace and plastron，tortoisshells and their common adulterants.? Results： The fingerprint had good precision，reproducibility and stability. The similarity of tortoiseshells was between 0.932-0.995. The percentage was less than 90.91% under the similarity of 0.90 between tortoiseshells of their adulterants.? Conclusion： The difference of HPLC is relatively small between tortoiseshells′ carapaces and plastrons，and the difference between tortoise shells and their adulterants is obvious. The established HPLC fingerprint can be used for the quality evaluation of tortoiseshells.

Key Words? Carapax et Plastrum Testudinis; Adulterants; High Performance Liquid Chromatography fingerprint; Similarity evaluation

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.012

龜甲始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品[1]。2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定龜甲為龜科動(dòng)物烏龜 Chinemys reevesii （Gray）的背甲及腹甲。其具有滋陰潛陽、益腎強(qiáng)骨、養(yǎng)血補(bǔ)心等功效[2]，常以龜甲飲片、醋龜甲、龜甲膠等形式入藥，需求量大;且正品資源較少，價(jià)格較貴，市場上偽品與混淆品泛濫[3]。然而，龜甲的代表性成分尚不清楚，在質(zhì)量控制上缺乏具有說服力的指標(biāo)[3]。目前龜甲的生藥學(xué)鑒別主要集中在性狀和薄層鑒別上，也有部分學(xué)者嘗試用比值圖示法和相似系數(shù)法對(duì)其性狀進(jìn)行研究，并取得一定的成效。但上述研究都僅限于2個(gè)或幾個(gè)龜類藥材之間的比較，缺乏對(duì)龜類藥材的系統(tǒng)性比較研究[4]。同時(shí)，龜甲的上甲與下甲是否能夠統(tǒng)一使用，仍存在一些爭議。對(duì)正品上下甲、正品與混偽品的深入研究，不僅有助于制定龜甲質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，而且對(duì)龜甲藥材的市場管理有一定的指導(dǎo)意義。

HPLC適用于成分復(fù)雜而不易分離的分析對(duì)象，具有分離效能高、靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，是目前指紋圖譜技術(shù)中用途最廣泛的一種方法。通過HPLC對(duì)龜甲中羥脯氨酸[5]、膠原蛋白的含量[6]，龜甲炮制品龜甲膠中14種氨基酸含量[7]等均有研究。而本實(shí)驗(yàn)所采用的AQC柱前衍生化HPLC也較成熟，如應(yīng)用于人血漿[8]、阿膠[9]、稻米[10]等。

中藥指紋圖譜建立的目的是全面反映中藥所含內(nèi)在化學(xué)成分的種類和數(shù)量，進(jìn)而反映其內(nèi)在質(zhì)量[11-12]，已應(yīng)用于柑橘屬中藥[13]、鉤藤[14]、黃芩[15]等中藥的鑒別。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC對(duì)不同產(chǎn)地的龜甲藥材及其混偽品進(jìn)行了指紋圖譜研究，建立了正品龜甲的HPLC指紋圖譜，為龜甲藥材的質(zhì)量控制提供有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材 收集正品龜甲及其混偽品，按上下甲分為42個(gè)樣品，采集地為廣州、茂名、南京、無錫等地，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)楊瑤珺教授鑒定其品種。

1.1.2 藥物 L-羥脯氨酸（Hyp）對(duì)照品（批號(hào)Z26M7H11979，上海源葉生物科技有限公司）;17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品混合液[天冬氨酸（Asp）、絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）、蘇氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、賴氨酸（Lys）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe），除Cys為1.25 mmol/L外，其余均為2.5 mmol/L;批號(hào)2QL228986，Waters公司提供]。

1.1.3 試劑與儀器 Waters AccQ.Flour衍生化試劑盒[包含Waters AccQ.Flour緩沖液、AQC試劑粉、AQC稀釋液，批號(hào)：8217860041];AccQ.Tag流動(dòng)相濃縮液（乙酸鹽-磷酸鹽萃取劑）（批號(hào)8114160431）;乙腈（色譜純）;鹽酸;純凈水;waters高效液相色譜儀（包括2695紫外檢測器，Empower數(shù)據(jù)工作站）;TCQ-250超聲波清洗器（北京醫(yī)療設(shè)備二廠）;分析天平;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城儀器廠）;CS101-1C電熱鼓風(fēng)干燥箱（重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器廠）;旋渦振蕩器;中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版（國家藥典委員會(huì)）。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取濃度為2.5 mmol/L（Cys1.25 mmol/L）的17種氨基酸對(duì)照品100 μL，放入一小樣品瓶中，加0.9 mL高純水稀釋，混勻，即得17種混合氨基酸對(duì)照品溶液。取Hyp適量，精密稱定，加入0.1 mol/L鹽酸制成0.25 mmol/L的溶液，混勻，即得羥脯氨酸對(duì)照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 取樣品0.1 g，加入6 mol/L鹽酸5 mL，充入高純氮?dú)?0 s，密封，置于110 ℃烘箱中水解8 h，過濾，蒸干，加入20 mL 70%乙醇超聲15 min，過濾，蒸干，加入0.1 mol/L草酸6 mL，超聲，定容至50 mL容量瓶，用0.22 μm濾膜過濾，即得。

1.2.3 空白溶液的制備 在不加入樣品的情況下，同供試品溶液的制備方法制備。

1.2.4 衍生方法 分別精密移取空白溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液和各10 μL，置于離心管中，加入AccQ.Flour緩沖液70 μL，漩渦混合，在渦旋狀態(tài)下加入AQC溶液20 μL，并保持漩渦混合10 s，密封，置55 ℃烘箱內(nèi)10 min，取出，放涼，轉(zhuǎn)移至微量進(jìn)樣瓶，即得空白、對(duì)照品和供試品的衍生化溶液。

1.2.5 色譜條件 色譜柱為Waters AccQ.Tag法專用C18色譜柱（3.9 mm×150 mm，3 μm），流動(dòng)相A為AccQ.Tag流動(dòng)相的1∶ 10稀釋液，B為乙腈，C為水，按表1進(jìn)行梯度洗脫，流速1.00 mL/min，紫外檢測波長248 nm，柱溫37 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果

2.1 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.1.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一供試品的衍生化溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果15個(gè)主要色譜峰（His、Cys、Met含量較低，未納入計(jì)算）的相對(duì)保留時(shí)間的 RSD 均<0.68%，相對(duì)峰面積的 RSD 均<2.04%，各色譜圖的相似度值不低于0.99，表明儀器等整個(gè)檢測系統(tǒng)的精密度良好。

2.1.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品的衍生化溶液，分別于0、3、6、12、24、72 h進(jìn)行檢測，結(jié)果15個(gè)主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的 RSD 均<0.90%，相對(duì)峰面積的 RSD 均<2.87%，各色譜峰的相似度值不低于0.97，表明供試品在室溫下72 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一正品龜甲樣品，按實(shí)驗(yàn)方法平行制備6份供試品溶液并衍生化，分別進(jìn)樣檢測。結(jié)果15個(gè)主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的 RSD 均<1.0%，相對(duì)峰面積的 RSD 均小于3.0%，各色譜峰的相似度值不低于0.98，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2 中藥龜甲指紋圖譜的建立

2.2.1 各龜甲樣品與其混偽品的HPLC圖譜采集 ?在本實(shí)驗(yàn)色譜條件下，15種氨基酸得到有效分離。按羥脯氨酸衍生物峰計(jì)算，理論板數(shù)在4 000以上。所得空白、羥脯氨酸、17種混合氨基酸和樣品的HPLC圖譜見圖1。

2.2.2 正品上甲與下甲HPLC圖譜的相似度 取10批正品下甲藥材，按上述試驗(yàn)方法制備供試品衍生化溶液，進(jìn)行HPLC分析，所得圖譜導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（中華人民共和國藥典2012版）進(jìn)行相似度分析，其相似度為0.927～0.995，將生成的下甲對(duì)照?qǐng)D譜與各上甲樣品進(jìn)行相似度分析，結(jié)果見表2;10批正品上甲藥材的相似度為0.917～0.985，上甲對(duì)照?qǐng)D譜與各下甲樣品的相似度結(jié)果見表3。由表2可知，下甲對(duì)照?qǐng)D譜與各上甲樣品的相似度為0.932～0.995，上甲對(duì)照?qǐng)D譜與各下甲樣品的相似度為0.949～0.989。表明：上甲與下甲的相似度基本均在0.950以上，差異較小。因此采用龜甲上甲與下甲的HPLC圖譜統(tǒng)一建立龜甲藥材HPLC指紋圖譜。

2.2.3 龜甲藥材指紋圖譜的建立 實(shí)驗(yàn)中，正品上甲與下甲樣品均一一對(duì)應(yīng)，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，考慮將對(duì)應(yīng)的上甲與下甲樣品合并，共10個(gè)批次。利用相似度軟件，對(duì)色譜峰進(jìn)行剪切、校正等處理，采用平均數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜。見圖2、表3。由表中數(shù)據(jù)可知，批次間的相似度在0.900以上的占95.56%，在0.950以上的占91.11%。各批次與所得龜甲的對(duì)照指紋圖譜的相似度在0.964～0.999，顯示其與對(duì)照指紋圖譜有良好的相似性。

2.3 龜甲及其混偽品的相似度分析 將所收集的22個(gè)混偽品按試驗(yàn)方法制備供試品衍生化溶液，以色譜條件對(duì)其進(jìn)行檢測。用2.2.3項(xiàng)所得的對(duì)照指紋圖譜與各混偽品的HPLC圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。見表4。可知相似度值在0.85以下的占81.82%;相似度值在0.90以下的占90.91%。其中地龜下甲、鷹龜下甲與正品龜甲的相似度值在0.90以上，巴西龜、黃喉擬水龜、中華花龜?shù)绕贩N與正品龜甲的相似度值均在0.90以下。這表明在一定程度上，龜甲藥材的對(duì)照指紋圖譜能夠作為鑒別龜甲正偽品的參考方法之一。

3 討論

龜甲藥材中主要有效成分為蛋白質(zhì)，通過蛋白質(zhì)水解、AQC試劑衍生化的方法對(duì)檢測氨基酸的種類和含量有較好的效果。然而，圖譜中羥脯氨酸與衍生化副產(chǎn)物的出峰時(shí)間較接近，且色譜峰保留時(shí)間對(duì)圖譜相似度有較大影響，因此，在色譜柱分離效果和儀器靈敏度良好的情況下，需嚴(yán)格控制流動(dòng)相A稀釋液的比例，而本實(shí)驗(yàn)采用的是1∶ 10的稀釋比例。通過筆者市場走訪發(fā)現(xiàn)，龜甲混偽品眾多，而未鑒別出的地龜下甲、鷹龜下甲在性狀上與正品龜甲差異較大，且目前養(yǎng)殖量和野生量均較少，因此對(duì)正品龜甲的鑒別影響較小。故根據(jù)龜甲對(duì)照指紋圖譜及其混偽品的相似度值，可以用于鑒別正偽品龜甲，為擴(kuò)大龜甲藥源提供參考。

目前，在龜甲的藥效成分尚未完全闡明的情況下，利用龜甲指紋圖譜作為質(zhì)量控制指標(biāo)或龜甲中多種氨基酸的含量范圍為指標(biāo)，并結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別如主成分分析、聚類分析以及人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等，整個(gè)評(píng)價(jià)研究將是一種更有效的質(zhì)量控制方法。

參考文獻(xiàn)

[1] 陳修園.神農(nóng)本草經(jīng)讀[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1959：26.

[2]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[S].一部.北京.中國醫(yī)藥科技出版社，2015：180-181.

[3]杜沛霖，周雨晴，朱華.龜甲的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（32）：11319-11320，11338.

[4]顧迎寒.龜甲的生藥學(xué)研究[D].成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2007.

[5]王新雨，譚曉梅，陳飛龍，等.HPLC-ELSD法測定醋龜甲中羥脯氨酸[J].中草藥，2011，42（7）：1338-1340.

[6]駱達(dá)，李惠芬，李秀蘭.異硫氰酸苯醋衍生化HPLC法測定龜甲中膠原蛋白[J].中草藥，2009，39（6）：851-852.

[7]江東龍，陳芳，熊丹丹，等.柱前衍生化HPLC法同時(shí)測定龜甲膠中14種水解氨基酸含量[J].藥物分析雜志，2015，35（10）：1790-1795.

[8]陳蓉，董吉，繆麗燕.AccQ.Tag法測定人血漿中的17種氨基酸[J].華西藥學(xué)雜志，2013，28（5）：534-536.

[9]謝誼，易艷，劉陽，等.柱前衍生HPLC測定阿膠中17種水解氨基酸含量[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32（5）：46-49.

[10] 周新躍，劉紅梅，李海林，等.AccQ-Tag柱前衍生法測定稻米中氨基酸的含量[J].生命科學(xué)儀器，2008，6（11）：55-57.

[11]郭秋平，高英，李衛(wèi)民.中藥百合HPLC指紋圖譜研究[J].中成藥，2011，33（8）1280-1285.

[12]祝明，陳碧蓮，石上梅.中國指紋圖譜技術(shù)在中國藥典2015年版一部中的應(yīng)用[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2016，33（5）：611-614.

[13]陳永剛，林勵(lì).柑橘屬常用中藥黃酮類成分HPLC指紋圖譜研究與比較[J].中國中藥雜志，2011，36（19）：2660-2665.

[14]譚超元，王海波，邸學(xué)，等.中藥鉤藤生物堿部位HPLC指紋圖譜[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2012，29（4）：2313-2316.

[15]王丹，張秋燕，徐風(fēng)，等.中藥黃芩HPLC指紋圖譜的化學(xué)輪廓及其影響因素的研究[J].藥品檢驗(yàn)，2013，10（5）：96-102.