何曉健 張柳 王戈 程亞東 毛自朝 楊煥文

摘? 要：PP2C是一類單體絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，廣泛參與生物體內(nèi)多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。PP2C基因家族的鑒定和功能研究已在多種作物上報道。為探明不同降雨量條件下煙草PP2C基因家族表達特征，通過塑料大棚內(nèi)模擬人工定量噴灌試驗和不同降雨量的田間試驗，利用RNA-Seq技術(shù)對移栽后40和60 d煙葉中PP2C家族基因進行了表達分析。結(jié)果顯示，18個煙草PP2C家族基因的表達明顯受降雨量影響，可分成9個亞族。其中6個PP2C家族成員的表達隨著降雨量增大而降低，4個PP2C家族成員的表達隨著降雨量增大而升高。本研究初步探明了云煙87中受降雨量影響的PP2C基因家族種類及其表達特點，為抗旱育種和抗旱栽培提供參考。

關(guān)鍵詞：煙草;降雨量;PP2C;生物信息學(xué)

中圖分類號：S572.01????????? 文章編號：1007-5119（2019）02-0044-08????? DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.02.007

Abstract： PP2C is a class of monomeric serine/threonine protein phosphatases that are widely involved in multiple signal transduction pathways in organisms. Identification and functional studies of the PP2C gene family have been reported in a variety of crops. In order to ascertain the expression characteristics of tobacco PP2C gene family members under different rainfall conditions， the expression of PP2C family genes in tobacco leaves at 40 and 60 days after transplanting was analyzed by RNA-Seq technique through simulated artificial quantitative irrigation in plastic greenhouse and field experiments with different rainfall. The results showed that the expression of 18 tobacco PP2C family genes was significantly affected by rainfall and could be divided into 9 subfamilies. The expression of six PP2C family members decreased with increasing rainfall， and the expression of four PP2C family members increased with increasing rainfall. In this study we have preliminarily identified the types and expression characteristics of the PP2C gene family affected by rainfall in Yunyan 87， providing reference for drought-resistant breeding and drought-resistant cultivation.

生物體內(nèi)普遍存在由蛋白激酶和蛋白磷酸酶介導(dǎo)的可逆磷酸化反應(yīng)，在調(diào)控植物細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆境脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用[1]。針對不同特異性底物和特定抑制劑敏感性不同，蛋白磷酸酶（PPs）通常被分為PP1，PP2A，PP2B或PP2C[2]。PP2Cs是一類依賴Mg2+或Mn2+的單體絲氨酸/蘇氨酸殘基蛋白磷酸酶[3-4]，也是高等植物中最大的蛋白磷酸酶家族[5]，在真核生物脫落酸、茉莉酸、水楊酸等信號傳導(dǎo)途徑中起著重要的調(diào)控作用[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中有80個PP2C基因[8]，水稻中有78個[9]，其中擬南芥PP2C基因被分為A-E、F1、F2、G-L共13個亞族[8]。相關(guān)研究顯示，PP2C酶催化可逆磷酸化作用，并反作用特定蛋白激酶，調(diào)控ABA信號通路，與水分等非生物逆境脅迫的耐受性相關(guān)，進而影響植物生長發(fā)育[10]。

水分是影響煙草生長的重要因子，除了灌溉外，降雨是煙草生長水分供應(yīng)的關(guān)鍵途徑[11]。我國許多煙區(qū)年降雨量分布不均，影響煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)[12]。作為重要的生態(tài)因子，降雨量影響著煙草基因的表達[11]。目前對煙草中PP2C家族基因雖有一些報道[13]，但不同降雨量條件下煙草PP2C家族基因的表達尚未見相關(guān)研究，本研究利用已公開的NCBI煙草基因組數(shù)據(jù)（PRJNA319578、PRJNA208209）結(jié)合本實驗室建立的云煙87煙草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（PRJNA206414）進行PP2C家族基因的預(yù)測，對塑料大棚內(nèi)降雨量模擬試驗和不同降雨量田間試驗下的云煙87葉片樣品進行RNA-Seq，結(jié)合生物信息學(xué)分析，探究了降雨量對煙草PP2C家族基因表達的影響，為煙草的抗旱育種與栽培提供指導(dǎo)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗處理

試驗分為塑料大棚內(nèi)模擬試驗和大田驗證試驗兩部分。供試烤煙品種為云煙87。

模擬試驗在云南玉溪趙桅烤煙試驗點（102.29° E，24.18° N，海拔1645 m）進行，搭建簡易塑料大棚進行避雨栽培，大棚四周通風(fēng)良好，棚內(nèi)溫度條件與室外試驗基本一致。參照降雨量有顯著差異的云南3個地區(qū)34年的年均降雨量及其旬分布特征，設(shè)計低、中、高3個降雨量處理：低降雨量（≤500 mm，典型區(qū)域為東川）、中等降雨量（650～700 mm，典型區(qū)域為江川）和高降雨量（≥1100 mm，典型區(qū)域為寧洱），進行降雨量模擬人工定量噴灌。3個處理移栽后0～40 d的模擬旬降雨量分別為32、42和71 mm（與東川、江川、寧洱3地34年平均降雨量等同），移栽后40～60 d模擬旬降雨量分別為30、53和90 mm，每5天模擬降雨1次。每個處理設(shè)3個小區(qū)（重復(fù)），每個小區(qū)按照株行距50 cm×120 cm栽種36株烤煙，小區(qū)規(guī)格為6 m×3.6 m，小區(qū)四周各設(shè)2列保護行。其他栽培管理措施與常規(guī)大田試驗相同。

為了驗證塑料大棚內(nèi)降雨量模擬試驗中PP2C家族基因表達變化情況，在文山硯山（104.38° E，23.59° N，海拔1540 m）、普洱寧洱（101.08° E，23.06° N，海拔1340 m）和玉溪江川（102.75° E，24.32° N，海拔1725 m）3個地點進行大田驗證。煙苗移栽成活后不澆水，統(tǒng)計當(dāng)?shù)貙嶋H降雨量。硯山、寧洱、江川移栽后0～40 d實際旬均降雨量分別為13 mm、11.5 mm、124 mm，移栽后40～60 d實際旬均降雨量分別為18 mm、19 mm、227 mm。塑料大棚內(nèi)模擬試驗及大田驗證試驗的旬降雨量統(tǒng)計見圖1。

1.2? RNA-Seq技術(shù)

塑料大棚內(nèi)模擬試驗和大田驗證試驗分別在移栽40和60 d后取樣，每個小區(qū)取3株煙，選取從下向上第10葉（中部煙葉），3個葉片混合作為一個樣品，每個處理共3次生物學(xué)重復(fù)。用不銹鋼剪刀剪去葉尖、葉基和主脈，取葉片中部，用鋁箔紙包裹好后用液氮速凍，分裝50 mL離心管中，?80 ℃儲存，用于RNA-Seq測序分析。

使用改良的CTAB法提取樣品總RNA。取質(zhì)量合格的總RNA 6 μg，利用Oligo（dT）磁珠富集mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，對cDNA片段進行末端修復(fù)和銜接子連接后，將產(chǎn)物純化并用PCR富集以產(chǎn)生最終的cDNA文庫。文庫質(zhì)控合格后使用Illumina HiSeq?2000進行測序。將獲得的原始讀段（reads）經(jīng)過去接頭和低質(zhì)量堿基的清洗獲得clean reads，并對參考數(shù)據(jù)通過Tophat進行短序列比對獲得SAM數(shù)據(jù)文件。SAM交由cufflinks軟件包做差異分析獲得基因的表達量（RPKM值）。對表達量相差兩倍以上，P<0.05的PP2C家族基因進行差異分析[14]。

1.3? 煙草PP2C候選基因的鑒定及生物信息學(xué)分析

利用已公開的NCBI煙草基因組數(shù)據(jù)（PRJNA319578、PRJNA208209）結(jié)合實驗室建立的云煙87煙草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（PRJNA206414）進行PP2C家族基因的預(yù)測，獲得56個云煙87的PP2C家族基因。挑選2個以上處理RPKM值大于1的基因作為對降雨量有明顯響應(yīng)的PP2C家族基因，最終獲得18個候選PP2C家族基因。進行NCBI和中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫Blast比對、ORF分析（NCBI ORFfinder，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder/）、結(jié)構(gòu)域分析（Pfam database，http：//pfam.xfam.org/）、蛋白理化性質(zhì)預(yù)測（ExPASy，http：//web.expasy.org/protparam/）、亞細胞定位預(yù)測（WoLF PSORT，http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）和Clustalx氨基酸多序列比對以及MEGA5.0系統(tǒng)進化關(guān)系分析。

1.4? 不同降雨量下表達模式分析

2? 結(jié)? 果

2.1? 表達受降雨量影響的煙草PP2C家族基因鑒定

利用RNA-Seq測序獲得18個隨降雨量變化有明顯響應(yīng)并具有完整ORF的候選PP2C基因家族成員。通過在NCBI數(shù)據(jù)庫和中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫比對分別命名為NtPP2C01、NtPP2C10、NtPP2C12、NtPP2C27、NtPP2C28、NtPP2C33、NtPP2C34、NtPP2C35、NtPP2C37、NtPP2C43、NtPP2C49、NtPP2C50、NtPP2C52、NtPP2C58、NtPP2C59、NtPP2C60、NtPP2C63、NtPP2C76。通過分析NtPP2C家族基因理化性質(zhì)，結(jié)果顯示18個NtPP2C基因家族成員中，蛋白質(zhì)編碼最長的526 aa，最短的267 aa，等電位范圍從4.49～9.19，18個煙草PP2C家族基因均含有PP2C保守結(jié)構(gòu)域（表1）。

2.2? 表達受降雨量影響的煙草PP2C家族基因亞細胞定位預(yù)測

利用WoLF PSORT對18個煙草PP2C家族基因進行亞細胞定位預(yù)測，結(jié)果表明表達受降雨量影響的煙草PP2C家族基因在細胞核、細胞質(zhì)、線粒體和葉綠體中表達集中，在過氧化物酶體、細胞骨架、液泡、高爾基體和細胞基質(zhì)中少量表達，在細胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中不表達（表2）。表達受降雨量影響的煙草PP2C家族基因表達部位的不同可能與其執(zhí)行不同的功能有關(guān)。

2.3? 表達受降雨量影響的煙草PP2C基因編碼蛋白系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

個與煙草候選PP2C基因蛋白同源性相近的水稻PP2C基因編碼蛋白，利用MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖2），根據(jù)擬南芥和水稻PP2C基因的分類，18個云煙87煙草的PP2C基因分別屬于A、D、E、F1、F2、G、H、K、L 9個亞族。其中NtPP2C37和NtPP2C50屬于A亞族，NtPP2C43、NtPP2C60和NtPP2C63屬于D亞族，NtPP2C33、NtPP2C34和NtPP2C52屬于E亞族，NtPP2C10、NtPP2C28和NtPP2C58屬于F1亞族，NtPP2C59和NtPP2C76屬于F2亞族，NtPP2C27和NtPP2C49屬于G亞族， NtPP2C12屬于H亞族，NtPP2C01屬于K亞族， NtPP2C35屬于L亞族。

2.4? 表達受降雨量影響的煙草PP2C基因表達趨勢

按照降雨量從低到高排列，通過塑料大棚內(nèi)數(shù)據(jù)（圖3）和大田驗證數(shù)據(jù)（圖4）比較后發(fā)現(xiàn)，

塑料大棚內(nèi)試驗云煙87的PP2C家族基因在移栽后40 d沒有移栽后60 d的變化顯著?？赡苁且圃院?0 d烤煙正處于團棵期后期，而移栽后60 d烤煙正處于旺長期，烤煙旺長期對水分和降雨量更為敏感，因此PP2C家族基因的表達差異大。并且在塑料大棚內(nèi)精準調(diào)控條件下，基因家族表達的規(guī)律性更強，所以在隨后PP2C家族基因表達變化的分析中，主要以60 d獲得的數(shù)據(jù)為主。采用基因表達隨降雨量的高低變化進行趨勢分析。試驗結(jié)果表明，塑料大棚內(nèi)和大田驗證試驗中NtPP2C37、NtPP2C63、NtPP2C34、NtPP2C10、NtPP2C58、NtPP2C49? 6個基因總體表達隨著降雨量的增大而降低。NtPP2C50、NtPP2C43、NtPP2C33、NtPP2C52? 4個基因總體表達隨著降雨量的增大而升高。

3? 討? 論

利用RNA-Seq可以很方便地對植物基因表達情況進行分析[15]。本研究分別在塑料大棚內(nèi)模擬和大田不同降雨量下開展煙草栽培試驗，并采集栽后40 d和栽后60 d不同處理的樣品，通過RNA-Seq，共鑒定了18個對降雨量有明顯響應(yīng)的煙草PP2C家族基因。基因定位預(yù)測表明，這18個煙草PP2C家族基因主要在細胞質(zhì)、葉綠體、線粒體和細胞核中表達。根據(jù)煙草、擬南芥和水稻PP2C基因編碼蛋白進化樹構(gòu)建結(jié)果，將18個煙草PP2C家族基因分成9個亞族：A、D、E、F1、F2、G、H、K、L亞族。

PP2C是一類具有多種功能的蛋白磷酸酶，在植物水分脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用[16-17]。相關(guān)研究顯示，A亞族調(diào)控脫落酸（abscisic acid，ABA）信號途徑[18]，擬南芥ABI1和ABI2基因?qū)儆贏亞族[19]，是ABA信號途徑中的調(diào)控基因[20-21]。B亞族在蛋白激酶MAPK途徑起作用[22]，苜蓿中B亞族是MAPK途徑中的負調(diào)控因子，受逆境脅迫誘導(dǎo)[23-24]。C亞族與花器官發(fā)育相關(guān)[4]。G亞族擬南芥基因AtPP2CG1能夠調(diào)控擬南芥對鹽脅迫的響應(yīng)[25]。E亞族在丹參中預(yù)測與植物組織器官發(fā)育相關(guān)[26]。

基因調(diào)控是復(fù)雜而多元化的過程，塑料大棚內(nèi)環(huán)境較單一，誘導(dǎo)基因家族表達的條件可控，通過綜合分析塑料大棚內(nèi)和大田試驗不同降雨量下PP2C基因家族表達量變化，NtPP2C37、NtPP2C63、NtPP2C34、NtPP2C10、NtPP2C58、NtPP2C49六個基因總體表達隨著降雨量的增大而降低，可能與干旱脅迫等非逆境脅迫相關(guān)。趙娜[27]研究發(fā)現(xiàn)中間錦雞兒CiPP2C37-like在干旱、高鹽、低溫和ABA脅迫下表達量上調(diào)。閔東紅等[1]發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫處理下，谷子SiPP2C10相對表達量上調(diào)2倍以上。這與本文研究結(jié)果相一致，推測NtPP2C37和NtPP2C10為抗旱相關(guān)基因。NtPP2C50、NtPP2C43、NtPP2C33、NtPP2C52四個基因總體表達隨著降雨量的增大而升高，可能與煙草水分代謝相關(guān)。同家族中不同基因差異表達結(jié)果不盡相同，可能是存在不同的應(yīng)答機制。

水分是影響煙草生長發(fā)育的重要環(huán)境因子，煙草產(chǎn)量和質(zhì)量的形成很大程度上決定于其生育期水分供應(yīng)。隨著降雨量增多，煙草中發(fā)生了豐富的基因調(diào)控變化[11]，通過研究低、中、高降雨量下PP2C家族基因的表達變化，可以有針對性地篩選與抗旱性有關(guān)的PP2C家族基因，為后續(xù)抗旱育種和抗旱栽培奠定基礎(chǔ)。

4? 結(jié)? 論

本研究利用NCBI煙草基因組數(shù)據(jù)結(jié)合實驗室建立的云煙87煙草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，通過RNA-Seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)了云煙87中18個對不同降雨量有明顯響應(yīng)的PP2C家族基因，可分成9個亞家族。其中6個PP2C家族成員的表達隨著降雨量的增多而降低，4個PP2C家族成員的表達隨著降雨量增多而升高。本研究可為抗旱育種和抗旱栽培提供參考。

參考文獻

[1]閔東紅，薛飛洋，馬亞男，等. 谷子PP2C基因家族的特性[J]. 作物學(xué)報，2013，39（12）：2135-2144.MIN D H， XUE F Y， MA Y N， et al. Characteristics of PP2C gene family in foxtail millet[J]. Acta Agronomica Sinica， 2013， 39（12）： 2135-2144.

[2]LUAN S. Protein phosphatases in plants[J]. Annual Review of Plant Biology， 2003， 54（54）： 63-92.

[3]STERN A， PRIVMAN E， RASIS M， et al. Evolution of the metazoan protein phosphatase 2C superfamily[J]. Journal of Molecular Evolution， 2007， 64： 61-70.

[4]COHEN P. The structure and regijlation of protein phosphatases[J]. Annu Rev Biochem， 1989， 58： 453-508.

[5]CAO J M， JIANG M， LI P， et al. Genome-wide identification and evolutionary analyses of the PP2C gene family with their expression profiling in response to multiple stresses in Brachypodium distachyon[J]. BMC Genomics， 2016， 17 （1）： 175.

[6]SHEEN J. Mutational analysis of protein phosphatase 2C involved in abscisic acid signal transduction in higher plants[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1998， 95： 975-980.

[7]NISHIMURA N， OKAMOTO M， NARUSAKA M， et al. ABA hypersensitive germination2-1 causes the activation of both abscisic acid and salicylic acid responses in Arabidopsis[J]. Plant Cell Physiol， 2009， 50： 2112-2122.

[8]HONG S W， JON J H， KWAK J M. Identification of a receptor-like protein kinase gene rapidly induced by abacisic acid， dehydration， high salt and cold treatments in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Physiology， 1997， 113（4）： 1203-1212.

[9]XUE T， WANG D， ZHANG S， et al. Genome-wide and expression analysis of protein phosphatase 2C in rice and Arabidopsis[J]. BMC Genomics， 2008， 9（1）： 550.

[10]張繼紅，陶能國. 植物PP2C蛋白磷酸酶ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及逆境脅迫調(diào)控機制研究進展[J]. 廣西植物，2015，35（6）：935-941.ZHANG J H， TAO N G. Research progress on regulation mechanism of plant PP2C protein phosphatase ABA signal transduction and abiotic stress[J]. The Plants in Guangxi， 2015， 35 （6）： 935-941.

[11]張柳，何曉健，林春，等. 降雨量對“云煙87”葉片基因表達影響的分析[J]. 分子植物育種，2018，16（16）：5483-5504.ZHANG L， HE X J， LIN C， et al. Analysis of the influence of rainfall on gene expression in leaves of Yunyan 87[J]. Molecular Plant Breeding， 2018， 16（16）： 5483-5504.

[12]李國蕓，李志偉，甄煥菊，等. 水分脅迫條件下煙草生理生化響應(yīng)研究進展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2007，23（9）：298-301.LI G Y， LI Z W， ZHEN H J， et al. Research advance on physiological and biochemical reponses in tobacco under water stress[J]. Chinese Agricultural Bulletin， 2007， 23（9）： 298-301.

[13]張雪薇，劉侖，魯黎明，等. 煙草磷酸酶基因 NtPP2C16的克隆、表達載體構(gòu)建及表達分析[J]. 華北農(nóng)學(xué)報，2017，32（5）：78-85.ZHANG X W， LIU L， LU L M， et al. Cloning construction of expression vector and expression analysis of NtPP2C16 in Nicotiana tabacum[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica， 2017， 32（5）： 78-85.

[14]COLE T， ADAM R， LOYAL G， et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks[J]. Nature Protocols， 2012， 7： 562-578.

[15]XIANG L X， HE D， DONG W R， et al. Deep sequencing-based transcriptome profiling analysis of bacteria-challenged Lateolabrax japonicus reveals insight into the immune-relevant genes in marine fish[J]. BMC genomics， 2010， 11（1）： 472.

[16]LIU L， HU X， SONG J， et al. Over-expression of a Zea mays L.protein phosphatase 2C gene （ZmPP2C） in Arabidopsis thaliana decreases tolerance to salt and drought[J]. Journal of Plant Physiology， 2009， 166 （5）： 531-542.

[17]胡偉，顏彥，何艷臻. 小麥TaPP2C59基因的克隆及表達分析[J]. 麥類作物學(xué)報，2014，34（10）：1334-1340.HU W， YAN Y， HE Y Z. Cloning and expression analysis of TaPP2C59 gene in wheat[J]. Journal of Triticeae Crops， 2014， 34（10）： 1334-1340.

[18]ZHANG J H， LI X S， HE Z M， et al. Molecular character of a phosphatase 2C（PP2C）gene relation to stress tolerancein Arabidopsis thaliana[J]. Molecular Biology Reports， 2013， 40（3）： 2633-2644.

[19]CUI M H， YOO K S， HYOUNG S， et al. An Arabidopsis R2R2-MYB transcription factor， AtMYB20， negatively regulates type 2C serine/threonine protein phosphatases to enhance salt tolerance[J]. FEBS Letters， 2013， 587（12）： 1773-1778.

[20]LEUNG J， MERLOT S， GIRAUDAT J. The Arabidopsis ABSCISIC ACID-INSENSITIVE2（ ABI2） and ABI1 genes encode homologous protein phosphatases 2C involved in abscisic acid signal transduction[J]. The Plant Cell， 1997， 9（5）： 759-771.

[21]GOSTI F， BEAUDOIN N， SERIZET C， et al. ABI1 protein phosphatase 2C is a negative regulator of abscisic acid signaling[J]. The Plant Cell， 1999， 11（10）： 1897-1909.

[22]SCHWEIGHOFER A， KAZANAVICIUTE V， SCHEIKL E， et al. The PP2C-type phosphatase AP2C1， which negatively regulates MPK4 and MPK6， modulates innate immunity， jasmonic acid， and ethylene levels in Arabidopsis[J]. The Plant Cell， 2007， 19（7）： 2213-2224.

[23]MESKIENE I， BAUDOUIN E， SCHWEIGHOFER A， et al. Stress-induced protein phosphatase 2C is a negative regulator of a mitogen-activated protein kinase[J]. Journal of Biological Chemistry， 2003， 278（21）： 18945-18952.

[24]郭鵬，張士剛，邢鑫，等.歐美楊 PdPP2C 基因的克隆與功能分析[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015，37（2）：100-106.GUO P， ZHANG S G， XING X， et al. Cloning and function analysis of PdPP2C from Popululus deltoises[J]. Journal of Beijing Forestry University， 2015， 37（2）： 100-106.

[25]LIU X， ZHU Y， ZHAI H， et al. AtPP2CG1， a protein phosphatase 2C， positively regulates salt tolerance of Arabidopsis in abscisic acid-dependent manner[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications， 2012， 422（4）： 710.

[26]徐志超，浦香東，宋經(jīng)元. 基于丹參基因組的蛋白磷酸酶2C家族的系統(tǒng)分析[J]. 中國現(xiàn)代中藥，2018，20（6）：652-657.XU Z C， PU X D， SONG J Y. Genome-wide characterization of PP2C gene family in Salvia miltiorrhiza[J]. Mod Chin Med， 2018， 20（6）： 652-657.

[27]趙娜. 中間錦雞兒CiPP2C37-like基因的克隆和功能分析[D]. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.ZHAO N. Cloning and function analysis of CiPP2C37-like gene from Caragana intermedia[D]. Hohhot： Inner Mongolia Agriculture University， 2016.