梁梁 杜風(fēng)光 陳嘉山 劉秀花 梁峰

摘 要：小球藻生長(zhǎng)速率快、易于培養(yǎng)且能進(jìn)行光合作用，可作為生物法固碳的優(yōu)良材料。而CO2作為全球變暖的元兇，如何減少大氣中CO2含量已是當(dāng)今熱門話題。但目前對(duì)小球藻去除CO2的研究中，大規(guī)模培養(yǎng)的較少。因此，本實(shí)驗(yàn)以120L玻璃封閉的自制大容器為培養(yǎng)器，以HSM1添加植物激素6-BA 0.5mg/L為培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)持續(xù)通入CO2和空氣，通氣量為1L/min，CO2的濃度為6.56%，并進(jìn)行光照、水循環(huán)等，對(duì)小球藻進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。結(jié)果表明：小球藻對(duì)CO2的去除率最高達(dá)24.09%，鮮重為3.624g/L，產(chǎn)油能力為0.14g/L。

關(guān)鍵詞：小球藻;大規(guī)模培養(yǎng);生物固碳;生物燃料

中圖分類號(hào)：Q945 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1003-5168（2019）17-0131-05

Abstract： Chlorella has a high growth rate， is easy to cultivate and can perform photosynthesis， and can be used as an excellent material for biological carbon fixation. CO2， as a greenhouse gas， is the main culprit of global warming. How to reduce CO2 content in the atmosphere is a hot topic today. In the current study of CO2 removal by Chlorella， large-scale cultures are less common. Therefore， in this experiment， a large-scale culture of Chlorella vulgaris was carried out in a 120L glass-enclosed self-made container with HSM1 and phytohormone 6-BA 0.5mg/L as the medium. During the culture， CO2 and air were continuously injected with a ventilation rate of 1L/min and a concentration of CO2 of 6.56%. Light and water circulation were also carried out to culture Chlorella vulgaris on a large scale. The results showed that the highest CO2 removal rate of Chlorella was 24.09%， fresh weight was 3.624g/L， and oil production capacity was 0.14g/L.

Keywords： Chlorella;large-scale culture;biological carbon fixation;biofuel

小球藻（Chlorella）為綠藻門小球藻屬普生性單細(xì)胞綠藻，是一種球形單細(xì)胞淡水藻類，直徑3～8μm，內(nèi)有一個(gè)周生、杯狀或片狀的色素體，是一種高效的光合植物。微藻固碳已經(jīng)成為消減溫室氣體排放的新的研究熱點(diǎn)[1]。自養(yǎng)型藻類主要依靠CO2和光能生長(zhǎng)，在光合作用過程中，藻類吸收CO2，并將其轉(zhuǎn)化為糖、蛋白質(zhì)、油脂等生物質(zhì)能。藻類對(duì)光量子（太陽(yáng)能）的吸收轉(zhuǎn)化率可達(dá)8%～10%，而一般農(nóng)作物的光能轉(zhuǎn)化率只有1%～3%[2]。每生產(chǎn)100t微藻，約可吸收利用470t碳元素，可轉(zhuǎn)化掉185t CO2。因此，藻類養(yǎng)殖是控制和減少大氣中CO2的一種有效途徑[3]。在300mL的小培養(yǎng)容器中，對(duì)CO2的去除率為27.69%，固碳量達(dá)到256.86mg/（L·h）[4]，而小球藻去除CO2的研究必將邁向大容器、大規(guī)模培養(yǎng)。小容器培養(yǎng)與大容器培養(yǎng)中存在許多微小且令人意想不到的問題，這些問題也是在實(shí)驗(yàn)的深入研究中所必須要面臨的。

對(duì)于以消減大氣中CO2為目的大規(guī)模微藻培養(yǎng)，其主要利用微藻生長(zhǎng)速度快、易于培養(yǎng)且能達(dá)到較高密度培養(yǎng)的特性來進(jìn)行本次實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)選用實(shí)驗(yàn)室分離純化的一株小球藻，生長(zhǎng)迅速，抗逆性強(qiáng)，且能在雜藻及雜菌中優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)，可作為CO2減排藻株。以HSM1添加6-BA為其培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)過程中，對(duì)光照強(qiáng)度、通氣量、容器內(nèi)水循環(huán)等進(jìn)行控制。本文主要分析大容器培養(yǎng)中，每個(gè)時(shí)期的CO2去除率，并觀察其變化，分析變化的內(nèi)外原因。同時(shí)，觀察并測(cè)量每個(gè)時(shí)期的生物量，最后將其回收并測(cè)量藻內(nèi)含油量，以為后續(xù)生物精煉方向的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)菌株為小球藻，來自于生物精煉河南省工程實(shí)驗(yàn)室。本實(shí)驗(yàn)的基本培養(yǎng)基為HSM1培養(yǎng)基，其成分為：NH4Cl 0.500g/L，K2HPO4 1.440g/L，KH2PO4 0.720g/L，MgSO4·7H2O 0.020g/L，CH3COONa 2.000g/L，CaCl2·2H2O 0.010g/L，Trace 1mL。其他涉及培養(yǎng)基有以下三種。

BBM培養(yǎng)基：NaNO3 0.250g/L，KH2PO4 0.175g/L，K2HPO4 0.075g/L，MgSO4·7H2O 0.075g/L，CaCl2·2H2O 0.025g/L，NaCl 0.025g/L，Trace 1mL。

DS培養(yǎng)基：NaNO3 0.300g/L，CO（NH2）2 0.150g/L，K2HPO4·3H2O 0.050g/L，F(xiàn)eC6H5O7 0.006g/L，CaCl2·2H2O 0.025g/L，Trace 1mL。

SE培養(yǎng)基：NaNO3 0.250g/L，K2HPO4·3H2O 0.075g/L，MgSO4·7H2O 0.075g/L，CaCl2·2H2O 0.025g/L，KH2PO4 0.180g/L，NaCl 0.025g/L，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.010g/L，F(xiàn)e-EDTA 1mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 CO2發(fā)生器的制作。取兩個(gè)2L的雪碧空瓶，并貼上A、B標(biāo)簽。A瓶裝200g檸檬酸加600mL水，B瓶裝200g小蘇打加300mL水，搖勻待用。然后取雙出口瓶蓋兩個(gè)，并貼上A、B標(biāo)簽。A蓋頂部一個(gè)口接壓力表，另一個(gè)口連接B蓋，下部接有通到瓶底的管子;B蓋一個(gè)口連接A蓋，其接口下部接有連接斜三角的管子（使其內(nèi)液體單向流動(dòng)，即A瓶液體能進(jìn)入B瓶，B瓶液體不能進(jìn)入A瓶，且B瓶的氣體能進(jìn)入A瓶），另一個(gè)口為出氣口，其上接有調(diào)節(jié)出氣量的閥門。

接著蓋上瓶蓋，擠壓A瓶，使其內(nèi)檸檬酸進(jìn)入B瓶與小蘇打反應(yīng);松開A瓶，B瓶氣體進(jìn)入A瓶，所以兩瓶氣壓相等。重復(fù)擠壓幾次后，隨著小蘇打與檸檬酸反應(yīng)，內(nèi)部氣壓升高，以致擠壓不動(dòng)時(shí)，打開出氣口5s左右，使B瓶氣壓降低，A瓶的檸檬酸就會(huì)再次進(jìn)入B瓶，關(guān)緊出氣口。搖晃B瓶，使其產(chǎn)生更多CO2，待壓力表上壓力為1.5左右時(shí)，出氣口接上通往培養(yǎng)器內(nèi)的管子即可。為了保證安全，在壓力表處接上自動(dòng)泄壓閥，也可手動(dòng)泄壓，防止瓶?jī)?nèi)壓力過高。

1.2.2 培養(yǎng)裝置的制作。光照：用8條LDE長(zhǎng)條燈帶環(huán)繞在玻璃培養(yǎng)器周圍，頂部裝上吸頂燈環(huán)形替換光源。測(cè)得內(nèi)部光照強(qiáng)度大約為3 000lx。循環(huán)：玻璃培養(yǎng)器內(nèi)部裝上兩個(gè)多功能潛水泵，提供內(nèi)部的水循環(huán)，且保證一定的攪拌效果，防止過多的小球藻沉淀。通氣：外部裝上超靜音增氧泵和CO2發(fā)生器，通過橡膠管接入培養(yǎng)器內(nèi);每根橡膠管裝上止逆閥，防止內(nèi)部水倒流;培養(yǎng)器內(nèi)的橡膠管末端接上空氣細(xì)化器，使氣體均勻進(jìn)入培養(yǎng)器。電源的接通：以上儀器均接于智能控制插座上，可自動(dòng)控制以上儀器開啟和關(guān)閉的時(shí)間。氣密性檢查：開啟增氧泵，同時(shí)集氣口接上集氣袋，觀察集氣袋是否有氣體進(jìn)入，正常進(jìn)入即制作完成。

1.2.3 培養(yǎng)基的選擇及改良。用250mL的三角瓶對(duì)本實(shí)驗(yàn)室小球藻進(jìn)行培養(yǎng)基的選擇及改良實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)用BBM、DS、SE、HSM1四種培養(yǎng)基培養(yǎng)小球藻，對(duì)其生長(zhǎng)情況及油脂積累情況進(jìn)行比較，選出最優(yōu)。同時(shí)，用最優(yōu)培養(yǎng)基添加不同的植物激素2，4-D、6-BA 0.5mg/L，對(duì)其生長(zhǎng)情況及油脂積累情況進(jìn)行比較，選出最優(yōu)作為大容器培養(yǎng)的培養(yǎng)基。

1.2.4 菌種的活化。配制HSM1固體培養(yǎng)基20mL，然后和事先包扎好的10個(gè)平板一起放入滅菌鍋滅菌。滅過菌之后，在超凈工作臺(tái)中開始倒完平板，待平板凝固后拿出斜面保存著的菌種，進(jìn)行四區(qū)劃線。最后，將劃好線的平板放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4～5d。

1.2.5 種子液的配制。配制好HSM1培養(yǎng)基后，對(duì)其進(jìn)行滅菌。滅完菌，待冷卻后，拿出之前活化好的平板，在超凈工作臺(tái)中，挑取單菌落接入錐形瓶里的培養(yǎng)基中。將接好的種子液進(jìn)行光照培養(yǎng)4～5d。

1.2.6 計(jì)數(shù)接種。對(duì)培養(yǎng)了5d的種子液進(jìn)行計(jì)數(shù)，并通過計(jì)算得出大約接種子液100mL，使得玻璃培養(yǎng)器中的含藻量為105個(gè)/mL。

1.2.7 氣體的測(cè)量。用氣體收集袋收集培養(yǎng)器內(nèi)1min所排出的氣體，再利用排水法得出氣體的體積。CO2濃度的測(cè)量：用收集袋收集培養(yǎng)器內(nèi)的氣體，再用便攜紅外氣體分析儀測(cè)量收集袋中氣體的CO2濃度。根據(jù)氣體流量和通入氣體與流出氣體中CO2的濃度變化算出小球藻對(duì)CO2的去除量和去除率[5]。

1.2.8 生物量的測(cè)定。濁度法：從玻璃培養(yǎng)器中取小球藻培養(yǎng)液，合理稀釋后在680nm下測(cè)定其光密度值，以O(shè)D680來衡量小球藻的相對(duì)生長(zhǎng)量。

鮮重法：在玻璃培養(yǎng)器充分?jǐn)嚢韬?，?00mL培養(yǎng)液，8 000r/min離心后將上清液倒掉，并將離心管倒置于報(bào)紙上，使其水分充分流失，稱重。

1.2.9 回收及含油量的測(cè)定。將衰亡期的培養(yǎng)液進(jìn)行沉淀、離心回收，并取10g的鮮菌于離心管中，加入6mol/L鹽酸6～8mL，用玻璃棒攪拌均勻，超聲波30min后放入沸水浴中水浴1d，取出放到冰中冷卻后，加入95%乙醇10mL，用力搖勻，置于冰浴中10min。向離心管中加入5mL石油醚（30～60），5mL乙醚搖勻，4 800r/min，離心4min，小心用吸管吸取醚層液，放入已知重量的試管中（重量記為[m1]）。再加入3ml石油醚（30～60），3mL乙醚搖勻，4 800r/min，離心4min，小心用吸管吸取醚層液，放入同個(gè)試管中。在烘箱中由低到高逐漸升溫（不要暴沸），至85℃烘箱中干燥1h，取出冷卻稱重，直到達(dá)到恒重，重量記為[m2]，既得小球藻油脂重（g）為[m=m2-m1]，則可算得鮮菌的含油量。

2 結(jié)果分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)小球藻生長(zhǎng)和油脂積累的影響

在培養(yǎng)小球藻的過程中，培養(yǎng)基是否合適至關(guān)重要。因此，在大規(guī)模培養(yǎng)之前，要對(duì)培養(yǎng)小球藻的培養(yǎng)基進(jìn)行選擇優(yōu)化，選出最優(yōu)培養(yǎng)基，并將其改良成為適合本實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基，然后再開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。小球藻L4在4種培養(yǎng)基BBM、DS、SE、HSM1中培養(yǎng)，培養(yǎng)10d后小球藻的生長(zhǎng)情況如圖1所示。圖1中OD680為原液稀釋10倍的數(shù)值。從圖1可以看出，以HSM1為培養(yǎng)基能使小球藻迅速生長(zhǎng)，且具有較大的生物量。這可能與HSM1含有較大量的NH4Cl和CH3COONa有關(guān)，NH4Cl為小球藻提供充足的氮源，而CH3COONa具有緩沖作用，防止培養(yǎng)基過酸而導(dǎo)致藻細(xì)胞大量死亡。

小球藻L4在4種培養(yǎng)基BBM、DS、SE、HSM1中培養(yǎng)，培養(yǎng)10d后小球藻的油脂積累情況如圖2所示。從圖2可以看出，以HSM1為培養(yǎng)基收獲的總油脂最多，這與其生物量大有關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)室保藏的小球藻適合生長(zhǎng)于HSM1培養(yǎng)基中。該培養(yǎng)基能使小球藻在短時(shí)間內(nèi)快速生長(zhǎng)，符合培養(yǎng)小球藻去除CO2的實(shí)驗(yàn)要求，并能在后期提供生物精煉方向的研究。在以下所有實(shí)驗(yàn)中均以HSM1為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.2 不同植物激素對(duì)小球藻生長(zhǎng)和油脂積累的影響

小球藻L4以HSM1培養(yǎng)基不加植物激素作為對(duì)照，添加植物激素6-BA、2，4-D培養(yǎng)10d，以100mL為培養(yǎng)單位的生長(zhǎng)和油脂積累情況如表1所示。

從表1可以看出，在添加2，4-D的培養(yǎng)基中，小球藻的鮮菌重最高，但含油量低;而在添加6-BA的培養(yǎng)基中，雖然鮮菌重比添加2，4-D的培養(yǎng)基低，但含油量高。這主要是因?yàn)樯锊裼褪亲畛Ｓ玫纳锶剂现?，被公認(rèn)為理想的可再生能源，因而也被看作為未來主要的能源來源?？紤]到后期生物柴油方向的研究，選用HSM1添加植物激素6-BA為大容器培養(yǎng)的培養(yǎng)基。

2.3 大容器培養(yǎng)中小球藻的生物量變化

在以HSM1添加植物激素6-BA 0.5mg/L為培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)持續(xù)通入CO2和空氣，通氣量為1L/min，CO2的濃度為6.56%，光照強(qiáng)度為3 000lx的大容器培養(yǎng)中，小球藻受多種因素的影響，因此，和錐形瓶培養(yǎng)的結(jié)果會(huì)有所不同。大容器培養(yǎng)中小球藻的生長(zhǎng)情況如圖3所示。

圖3中OD680為原液稀釋10倍的數(shù)值。從圖3可以看出，其延滯期比錐形瓶培養(yǎng)長(zhǎng)了將近1d。因?yàn)橥ㄈ隒O2的原因，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)情況優(yōu)于錐形瓶培養(yǎng)。但是，在第6天提前進(jìn)入了穩(wěn)定期且OD680處于較低的狀態(tài)，這可能與內(nèi)部水循環(huán)不充分有關(guān)，導(dǎo)致藻體沉淀以及生長(zhǎng)不良。

2.4 大容器培養(yǎng)中小球藻對(duì)CO2的去除

小球藻在生長(zhǎng)過程中會(huì)進(jìn)行光合作用，從而吸收CO2產(chǎn)生O2，達(dá)到去除CO2的目的。在120L的大容器培養(yǎng)中，在優(yōu)化的培養(yǎng)基中通入含6.56% CO2的空氣，通氣量為1L/min，觀察小球藻對(duì)CO2的去除情況，結(jié)果如圖4所示。

圖4上是大容器中CO2濃度的變化情況，圖4下是CO2去除率的變化情況。從圖4可以看出，小球藻在延滯期及對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期吸收的CO2小于放出的CO2，之后對(duì)CO2的去除與生長(zhǎng)具有一定的相關(guān)性。在此培養(yǎng)器中，有一段時(shí)間會(huì)有陽(yáng)光直射，內(nèi)部溫度可能會(huì)升高，使小球藻的呼吸作用加強(qiáng)。小球藻去除CO2的量最終會(huì)反映到生物量上來。隨著生物量的增加，顏色的加深，CO2的去除量及去除率逐漸與生長(zhǎng)體現(xiàn)出相關(guān)性，培養(yǎng)8d時(shí)，去除率達(dá)到最高24.09%。最后，隨著小球藻生長(zhǎng)速率減慢，對(duì)CO2的去除率逐漸降低。

2.5 大容器培養(yǎng)中小球藻的回收及含油量

因?yàn)樾∏蛟寰哂卸喾矫娴膬r(jià)值，因而被廣泛應(yīng)用于美容、醫(yī)療保健、生物精煉等行業(yè)。在大容器培養(yǎng)中，小球藻的生物量達(dá)到一定程度且穩(wěn)定后，可對(duì)其進(jìn)行回收利用，進(jìn)行其他方面的檢測(cè)，從而充分體現(xiàn)小球藻的價(jià)值。培養(yǎng)10d，大容器中小球藻的生長(zhǎng)已達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定。生長(zhǎng)情況如圖5所示。

此時(shí)，生物量已達(dá)到穩(wěn)定水平。但是，由于光線原因看起來會(huì)是不均勻的，后期將對(duì)光照裝置進(jìn)行改良。

回收的方法是先關(guān)掉所有設(shè)備，使其沉淀2d，去除上清，留取約20L，取出用8 000r/min離心。此收集法獲得約200g鮮重，藻體含油量0.14g/L。小球藻藻體油滴的顯微拍照如圖6所示。

在圖（b）中，紅色為葉綠素，黃色為生物柴油?？梢?，大容器培養(yǎng)中小球藻的油脂較為明顯，可進(jìn)一步改進(jìn)提取油脂的方法。

3 討論

小球藻的生長(zhǎng)繁殖快、抗逆性強(qiáng)、光合作用速率高、易于調(diào)控，適合用于生物工程技術(shù)方面的研究;同時(shí)，小球藻藻體具有很高的利用價(jià)值，具有較高的工業(yè)化潛力。因此，小球藻對(duì)CO2的固定有望成為一種可行性和經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的CO2固定方法。

小球藻除了可應(yīng)用于CO2的固定外，因營(yíng)養(yǎng)豐富，細(xì)胞壁極薄，易于消化吸收，在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面也具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值;同時(shí)，小球藻的油脂含量高，微藻生物柴油是具有廣泛發(fā)展前景的生物柴油;在污水處理的研究中也有較大的進(jìn)展等。

本文的研究?jī)H僅是初步探索大規(guī)模培養(yǎng)小球藻所面臨的一些問題，而要真正深入探究及解決所帶來的問題，還需要迎接巨大的挑戰(zhàn)。

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