蔡惠寧 李翠平 陳曉燕 鄭小芳 陳文捷

[摘要]目的：探討兩種不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)CIK細(xì)胞的差異。方法：健康自愿者來源的外周血單個核細(xì)胞（PBMC）.分別加入CTS培養(yǎng)和H3培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第0、3、7、10、12、14天分別取細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，每日電子顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，在培養(yǎng)的第10天以流式細(xì)胞術(shù)檢測兩組培養(yǎng)細(xì)胞表面CD3、CD56的表達(dá)情況。結(jié)果：CIK培養(yǎng)基和H3培養(yǎng)基均可使培養(yǎng)細(xì)胞在第7天時開始明顯擴(kuò)增，第10天時可擴(kuò)增至200倍。其中，CIK培養(yǎng)基獲得的細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)明顯高于H3培養(yǎng)基（P<0.05）;流式結(jié)果CD3/CD56顯示兩種培養(yǎng)基無明顯差異。結(jié)論：不同成分的CTS培養(yǎng)基和H3培養(yǎng)基均可促進(jìn)CIK細(xì)胞的擴(kuò)增和成熟，但呈現(xiàn)不同生物學(xué)特征。

[關(guān)鍵詞]CIK細(xì)胞;培養(yǎng)基;增殖率;表型

[中圖分類號]R329 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]2096-5249（2019）19-0032-02

腫瘤的生物免疫治療作為第四種治療手段日益受到重視。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine-induced killercell，CIK）是腫瘤生物免疫治療的主力軍。國內(nèi)的一些臨床研究機(jī)構(gòu)也相繼開展了這方面的研究工作并取得了一定的成效。但是，目前CIK細(xì)胞的制備尚沒有統(tǒng)一的規(guī)范，各個研究中心報道的培養(yǎng)方法并不一致，所制備CIK細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)、細(xì)胞表型、生物學(xué)活性等均存在一定的差異。本研究利用兩種不同培養(yǎng)基，使用標(biāo)準(zhǔn)的實驗室培養(yǎng)方法（SOP），將人外周血淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)成CIK，分析不同培養(yǎng)基獲得的CIK細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)，細(xì)胞表型等生物學(xué)特征，旨在為標(biāo)準(zhǔn)化使用CIK治療提供相應(yīng)的參考。

1 材料與方法

1.1主要材料無血清AIM V MED CTS培養(yǎng)基（InvitrogenTrading，Gibco批號：1776632），無血清了akara H3培養(yǎng)基（寶日醫(yī)，Takara批號：WKl60315），流式細(xì)胞儀檢測用抗人CD3/CD56熒光抗體購自BD公司。

1.2CIK細(xì)胞培養(yǎng)取肝素抗凝的健康志愿者外周血30ml，用人淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心（800g，20min），吸取白膜層，置于15ml離心管中，用生理鹽水洗滌3次，分別用CTS培養(yǎng)基和H3培養(yǎng)基（含低濃度IL-2，IFN-r懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1X105/ml，加入75cm2培養(yǎng)瓶，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長情況補(bǔ)加培養(yǎng)基并擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.3顯微鏡觀察CIK細(xì)胞的增殖細(xì)胞培養(yǎng)至第O、3、7、10、12、14天時，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況;取樣進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，用臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活力。

1.4流式細(xì)胞儀檢測ClK細(xì)胞表型細(xì)胞培養(yǎng)10d后，取一定數(shù)量細(xì)胞洗滌離心，用PBS調(diào)整細(xì)胞密度至1X106/ml，加入流式管中，200ul/管;分別加入抗人CD3/CD56抗體，置暗處4℃標(biāo)記20min，PBS洗滌2次，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSSl8.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，計量資料進(jìn)行描述性統(tǒng)計，變量用（x±s）表示;治療前后結(jié)果比較，采用單因素重復(fù)測量方差分析，若P<0.05，則應(yīng)用Bonferroni多重比較，進(jìn)行治療前與治療后兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1兩種培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)ClK細(xì)胞的增殖水平

實驗結(jié)果（圖1）顯示

兩種培養(yǎng)基在第0、3、7天時增殖速度無明顯差異，在第10天后出現(xiàn)差異性，用CTS培養(yǎng)基獲得的CIK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)明顯高于H3培養(yǎng)基（P<0.05）。培養(yǎng)期間，臺盼藍(lán)染色活力檢測顯示，以兩種培養(yǎng)基獲得的CIK細(xì)胞活力均大于98%。CTS培養(yǎng)基誘導(dǎo)10d的細(xì)胞呈明顯克隆生長，H3培養(yǎng)基則較少（圖2）。

2.2兩種培養(yǎng)基誘導(dǎo)的ClK細(xì)胞表型細(xì)胞培養(yǎng)至第10天時，流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測，結(jié)果（圖3，表1）顯示，CTS培養(yǎng)基和H3培養(yǎng)基誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞中CD3CD56細(xì)胞百分比分別為（2.3±1.8）%和（1.8±0.5）%;CD3CD56細(xì)胞百分比分別為（1.5±0.8）%和（3.7±1.5）%;CD3細(xì)胞百分比分別為（92.3±5.8）%和（85.9±15.5）%。

3 討論

CIK細(xì)胞是在體外條件下通過加入不同的細(xì)胞因子（IFN-r、IL-1、IL-2、CD3McAb）刺激外周血單個核細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)而成，同時表達(dá)CD3、CD56兩種膜蛋白分子。與既往臨床使用的過繼免疫療法相比，CIK細(xì)胞具有增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣、對多重耐藥腫瘤細(xì)胞同樣敏感、對正常骨髓造血前體細(xì)胞細(xì)胞毒性小等特點(diǎn)，是目前發(fā)現(xiàn)的殺傷腫瘤細(xì)胞活性強(qiáng)，適合臨床應(yīng)用的一種理想的效應(yīng)細(xì)胞，其療效主要體現(xiàn)在控制腫瘤復(fù)發(fā)及提高生活質(zhì)量等方面。CIK細(xì)胞治療腫瘤的療效主要取決于輸注的有效細(xì)胞數(shù)量及其殺傷活性。

本研究比較了兩種不同的培養(yǎng)基誘導(dǎo)刺激對人外周血單個核細(xì)胞制備CIK的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種培養(yǎng)基均使培養(yǎng)細(xì)胞在第7天時即開始明顯擴(kuò)增，在培養(yǎng)10d時即可擴(kuò)增至300倍左右，用CTS培養(yǎng)基獲得的CIK細(xì)胞擴(kuò)增能力明顯高于H3培養(yǎng)基。CTS培養(yǎng)基所獲得的CIK細(xì)胞中，CD3細(xì)胞百分比明顯高于H3培養(yǎng)基;CD3CD56CD3CD56細(xì)胞百分比無明顯差異。說明CTS培養(yǎng)基可以在體外快速擴(kuò)增CIK細(xì)胞，且T細(xì)胞純度較高，有利于為今后體外高效擴(kuò)增培養(yǎng)CIK提供一定的參考。