于浩　葛志豪　徐麗麗　郭立忠

摘要：【目的】利用雙單雜交育種技術(shù)選育長根菇新菌株，并建立雙單雜交后代的快速準確鑒定方法，以獲得活性成分含量高、抗病性強的長根菇優(yōu)質(zhì)菌株。【方法】利用雙單雜交技術(shù)進行長根菇雜交育種，通過拮抗試驗、細胞核染色觀察和SNP位點分析對雙單雜交后代進行鑒別，以液體深層發(fā)酵和比色法測定雜合菌株的小奧德蘑酮產(chǎn)量，并通過對峙培養(yǎng)鑒定雜合菌株的木霉抗性?！窘Y(jié)果】通過對長根菇親本菌株OuE進行單孢分離，獲得14株單核菌絲后代，編號依次為OuE01～OuE14。將獲得的單核菌絲后代與親本雙核體菌株OuC進行雙單雜交，經(jīng)拮抗試驗和SNP位點分析共篩選獲得14株雙單雜交后代。經(jīng)過與兩個親本菌株（OuC和OuE）比較發(fā)現(xiàn)，雜交后代OuCE02、OuCE08和OuCE12的菌絲平均生長速度分別為16.00、16.10和15.30 mm/d，均顯著高于兩個親本菌株（P<0.05）;雜交后代OuCE03、OuCE05、OuCE08和OuCE10的菌絲發(fā)酵液小奧德蘑酮含量較親本菌株OuC分別提高6.07%、47.66%、4.67%和15.42%;雜交后代OuCE01和OuCE08顯示出較親本菌株更強的木霉抗性。其中，雜交后代OuCE08在菌絲生長速度、小奧德蘑酮產(chǎn)量和木霉抗性方面均優(yōu)于兩個親本菌株?！窘Y(jié)論】雙單雜交是一種快速有效獲得食用菌新菌株的遺傳育種方法，通過該方法篩選出一株高產(chǎn)小奧德蘑酮、高抗木霉的長根菇新菌株OuCE08。長根菇雙單雜交后代快速、準確的檢測鑒定可先采用拮抗試驗作為初篩手段，再利用SNP位點分析進行復篩。

關(guān)鍵詞： 長根菇;雙單雜交;小奧德蘑酮;木霉抗病性;SNP位點分析

中圖分類號： S646.19? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）12-2621-08

Breeding of high oudenone production and Trichoderma resistant Oudemansiella raphanipes strain by dikaryon-monokaryon mating

YU Hao， GE Zhi-hao， XU Li-li， GUO Li-zhong*

（Shandong Province Key Laboratory of Applied Mycology/College of Life Science， Qingdao Agriculture University， Qingdao， Shandong? 266109， China）

Abstract：【Objective】To breed new Oudemansiella raphanipes（also known as Hymenopellis raphanipes or O. radicata） strain by dikaryon-monokaryon mating， construct fast and accurate hybrid offspring identification methods， and produce high oudenone yield and high Trichoderma resistant cultivar. 【Method】Dikaryon-monokaryon mating was used to perform genetic breeding of O. raphanipes. Hybrid offsprings were identified by antagonism test， nucleus fluorescence microscope observation and single nucleotide polymorphism（SNP） analysis. Oudenone yield of heterozygous strains were detected by submerged fermentation and colorimetry， the resistance to Trichoderma was determined using plate confrontation test. 【Result】In this study， 14 monokaryotic strains were isolated from the basidiospores of dikaryotic strain OuE，and their numbers were OuE01-OuE14. Dikaryon-monokaryon matings were performed between monokaryotic strains and dikaryotic strain OuC. Fourteen hybrid dikaryon offsprings were identified by plate antagonism test and single nucleotide polymorphisms analysis. Among them， the average growth rates of hypha of OuCE02， OuCE08 and OuCE12 were 16.00， 16.10 and 15.30 mm/d， respectively， which were significantly higher than those of the parental strains（P<0.05）. The oudenone yield of hybrid offsprings OuCE03， OuCE05， OuCE08 and OuCE10 increased 6.07%， 47.66%， 4.67% and 15.42%， respectively， compared with parental strain OuC. OuCE01 and OuCE08 showed higher Trichoderma resistance than both parental strains. The growth rate， oudenone yield and Trichoderma resistance of OuCE08 were all better than the two parental strains. 【Conclusion】The rapid and accurate methods to identify dikaryon-monokaryon mating offsprings are constructed. A new O. raphanipes strain， OuCE08， is obtained， which grows fast， produces high yield of oudenone and has high Trichoderma resistance. This study proves that dikaryon-monokaryon mating offsprings can be firstly selec-ted by antagonism test and then verified by SNP analysis. This study provides a high quality cultivar for O. raphanipes production.

Key words： Oudemansiella raphanipes; dikaryon-monokaryon mating; oudenone; Trichoderma resistance; SNP loci analysis

0 引言

【研究意義】長根菇（Oudemansiella raphanipes）屬于白蘑科（Tricholomataceae）小奧德蘑屬（Oudemansiella）食用真菌，其肉質(zhì)細嫩、柄脆可口、營養(yǎng)豐富，是一種可人工栽培的中高溫出菇型食用菌（楊祝良和臧穆，1993）。長根菇在夏季出菇，耐保存，可彌補夏季食用菌供應短缺，因此已成為當前食用菌市場最受青睞的品種（戴玉成等，2010;Hao et al.，2016;Wang et al.，2018）。長根菇含有多種生物活性物質(zhì)，其中小奧德蘑酮（Oudenone）為小奧德蘑屬真菌所特有，具有顯著的降血壓功效（Koizumi et al.，1982;Acharya et al.，2019;Gao et al.，2019）。長根菇菌絲生長速度較慢、栽培周期較長，且生長過程易受雜菌污染。木霉是長根菇栽培過程中的主要競爭性病原微生物，因其生長迅速（朱兆香和莊文穎，2014），一旦污染即造成長根菇產(chǎn)量嚴重下降。因此，培育生長迅速、高產(chǎn)小奧德蘑酮、抗木霉能力強的長根菇優(yōu)質(zhì)新品種對促進其產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】與其他大宗食用菌相比，針對長根菇的研究報道相對較少，且主要集中在培養(yǎng)基優(yōu)化和高產(chǎn)栽培技術(shù)等方面。唐利華等（2010）、陳林香（2018）對長根菇覆土栽培的技術(shù)要點進行探究;方少欽等（2015）研究表明，在我國蠶區(qū)利用桑枝資源栽培食用菌，特別是夏季栽培長根菇具有良好的應用前景;鐘祝爛和益志能（2017）對長根菇的工廠化栽培技術(shù)進行研究;張磊等（2018）對長根菇的菌種進行鑒定，并優(yōu)化其培養(yǎng)基;萬魯長等（2019）總結(jié)出北方地區(qū)長根菇大棚地栽周年生產(chǎn)標準化技術(shù)。目前，有關(guān)長根菇的育種研究在國內(nèi)外鮮見報道。雜交育種是食用菌育種的重要手段之一，分為單單雜交和雙單雜交。其中，雙單雜交技術(shù)因可迅速產(chǎn)生遺傳多樣性豐富的雜交后代而受到廣泛關(guān)注（Pilotti et al.，2002）。自1999年以來，我國開展了一系列食用菌雙單雜交育種工作，闡明了雙單雜交的基本遺傳學現(xiàn)象（葉明等，2007），并獲得一系列食用菌新菌株（譚琦等，2000;王波等，2012;孫艷穎，2013）。雜交后代鑒定是雙單雜交技術(shù)的關(guān)鍵步驟，常用的鑒定方法有酯酶同工酶技術(shù)（Eiji et al.，1994）、限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析（Carvalho et al.，1995）、單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）分析（Mah et al.，2011）、隨機擴增多態(tài)性DNA標記（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）分析（王春暉等，2013）及拮抗試驗分析等。雖然雙單雜交后代鑒定方法有很多，但不同方法間的優(yōu)劣性尚缺乏系統(tǒng)研究，進而影響雙單雜交工作的有效開展?！颈狙芯壳腥朦c】長根菇是一種重要的中高溫食用菌品種，其栽培規(guī)模持續(xù)擴大，育種研究尚存在很大空白。雙單雜交是有效的食用菌遺傳育種手段，但至今國內(nèi)外尚無利用雙單雜交技術(shù)進行長根菇遺傳育種的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用雙單雜交育種技術(shù)選育長根菇新菌株，并建立雙單雜交后代的快速準確鑒定方法，旨在獲得活性成分含量高、抗病性強的長根菇優(yōu)質(zhì)新菌株。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試長根菇親本菌株OuC來源于廣東市售長根菇，菌株OuE來源于北京市售長根菇。經(jīng)檢測，菌株OuE菌絲體在培養(yǎng)基上生長速度較快，而菌株OuC菌絲體發(fā)酵液中小奧德蘑酮含量較高，且其木霉抗性強于菌株OuE。木霉分離自污染的長根菇栽培菌包，分離后通過形態(tài)觀察和ITS分析（田慧敏等，2014）確定為木霉。葡萄糖、磷酸二氫鉀（K2HPO4）和硫酸鎂（MgSO4）購自萊陽市康德化工有限公司，瓊脂粉、PCR試劑、異丙醇和無水乙醇購自生工生物工程（上海）股份有限公司，E.Z.N.A.TM Fungal DNA Mini Kit柱式試劑盒購自OMEGA公司，馬鈴薯購自當?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。主要儀器設備：電熱恒溫培養(yǎng)箱DRD-9082（上海森信實驗儀器有限公司），熒光顯微鏡XSP-BM21AY（上海光學儀器廠），高速冷凍離心機GTR22-1（北京時代北利離心機有限公司）。

PDA液體培養(yǎng)基（1 L）：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，pH自然。PDA固體培養(yǎng)基（1 L）：在PDA液體培養(yǎng)基中加入20.0 g瓊脂粉。PDF固體培養(yǎng)基（1 L）：黃豆12.5 g，葡萄糖20.0 g，酵母浸膏3.0 g，瓊脂粉20.0 g，pH自然。CM固體培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖20.0 g，蛋白胨5.0 g，MgSO4 0.5 g，K2HPO4 1.0 g，KH2PO4 0.46 g，瓊脂粉20.0 g，pH自然。WA固體培養(yǎng)基（1 L）：瓊脂粉20.0 g，pH自然。YEA固體培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖20.0 g，酵母浸膏20.0 g，蛋白胨1.0 g，瓊脂粉20.0 g，pH自然。PBS緩沖液（1 L）：NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 1.42 g，KH2PO4 0.27 g，pH 7.4。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 菌絲生長測定 采用打孔法取直徑0.8 cm的菌種塊接種至新的PDA固體培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱避光靜置培養(yǎng)5 d。測定菌落直徑，計算菌絲生長速度，每組設3個平行。

1. 2. 2 菌株小奧德蘑酮含量測定 將供試菌株分別接種于250 mL三角瓶中進行液體發(fā)酵培養(yǎng)（PDA液體培養(yǎng)基），裝瓶量100 mL，每瓶接種10塊直徑為0.8 cm的圓柱形菌種塊，于25 ℃下160 r/min搖床恒溫振蕩培養(yǎng)25 d。發(fā)酵液經(jīng)80目篩過濾后，4 ℃下8000 r/min離心2 min，收集上清液即為待測液。采用紫外分光光度計法測定待測液的小奧德蘑酮含量（李浩，2012）。

1. 2. 3 擔孢子收集與單孢分離 選用菌株OuE進行擔孢子收集和單孢分離。取長至八分熟的子實體，用75%酒精擦拭子實體表面，以無菌水沖洗3～4次。無菌條件下剪掉菌柄，將剩余子實體的菌褶朝下置于已滅菌且鋪有牛皮紙的培養(yǎng)皿上，并蓋上已滅菌的燒杯，每個培養(yǎng)皿中放置7個子實體。將收集到的擔孢子置于培養(yǎng)皿中，用已過濾滅菌的鏈霉素（80 μg/mL）稀釋制備成孢子懸液。利用稀釋涂布法對制備好的孢子懸液進行梯度稀釋，制備成5個梯度的孢子懸浮液。每個梯度吸取200 μL，分別涂布于PDA、PDF、CM、WA和YEA等5種固體培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基每個梯度設3個平行。將萌發(fā)、無污染的菌落轉(zhuǎn)移至新鮮的PDA培養(yǎng)基中，進行下一步鑒定工作。

1. 2. 4 單核菌絲鑒定 觀察索狀聯(lián)合：利用插片法將潔凈滅菌的蓋玻片以45°角插入待鑒定菌落邊緣，待菌絲爬滿插片后，取出進行鏡檢觀察。存在索狀聯(lián)合的為雙核菌絲，無鎖狀聯(lián)合的則需進一步鑒定。細胞核熒光染色觀察：在待觀察的玻片上滴加幾滴DAPI染液（1 μg/mL），染色20 min后用PBS緩沖液進行沖洗，用濾紙吸干水分，滴加熒光封片液（PBS緩沖液與甘油等體積混合），2 min后用熒光顯微鏡觀察。SNP位點分析：利用E.Z.N.A.TM Fungal DNA Mini Kit柱式試劑盒提取菌絲樣品的基因組DNA。參照李浩（2012）的方法設計引物（JE54-F：5'-TAGTTGCGTTGCTGTCCG-3';JE54-R：5'-ATCCG CCTTTGGTTGTTC-3'），以長根菇基因組DNA為模板，PCR擴增JE54基因片段并進行SNP位點分析，將獲得的單一條帶送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序;然后利用BioEdit 7.2.1分析測序結(jié)果，以尋找SNP位點。

1. 2. 5 雙單雜交 在培養(yǎng)基中間接種單核體菌株后置于25 ℃培養(yǎng)3～4 d。在距離單核菌絲2～3 cm處接種雙核菌株OuC，然后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。菌絲接觸后繼續(xù)培養(yǎng)5 d，從交界處至單核菌絲體一側(cè)的菌落邊界處依次挑取5個菌塊，轉(zhuǎn)接到新鮮的PDA固體培養(yǎng)基上以獲得待檢測雙單雜交后代。

1. 2. 6 雜合子菌株鑒定 初篩：對雜交后代進行菌絲形態(tài)觀察并淘汰不具備鎖狀聯(lián)合的后代。將具有鎖狀聯(lián)合的后代與親本菌株OuC在培養(yǎng)基上進行對峙培養(yǎng)，若后代與親本間有明顯的拮抗線說明是雜合子菌株，淘汰拮抗線不明顯的雜交后代。復篩：將初篩獲得的雜交后代進行SNP位點分析。

1. 2. 7 抗病突變株篩選 采用菌絲對峙培養(yǎng)法對雙單雜交后代進行抗木霉菌株篩選（陳艷露等，2013）：在培養(yǎng)基一側(cè)接種雙單雜交雜合子菌株，將培養(yǎng)基置于25 ℃培養(yǎng)3～4 d后，在距離單核菌絲4～5 cm處接種病原菌木霉菌株。將接種后的培養(yǎng)基置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，分別在接種木霉后第3、5和10 d觀察雜合子菌株生長情況，并測量菌落大小。每組設3個平行。

1. 3 統(tǒng)計分析

采用Origin 8.0進行試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計整理，以SPSS 18.0中的Pearson雙側(cè)t檢驗進行相關(guān)性分析，并應用BioEdit進行測序結(jié)果及SNP位點分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 單孢分離結(jié)果

采用鐘罩法收集菌株OuE的擔孢子，然后稀釋涂布于5種培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，結(jié)果顯示，PDA培養(yǎng)基上長出14個單菌落，PDF培養(yǎng)基上長出12個單菌落，CM培養(yǎng)基上長出8個單菌落，WA培養(yǎng)基上長出29個單菌落，YEA培養(yǎng)基上長出11個單菌落。以WA培養(yǎng)基上的單菌落數(shù)量最多。

通過鎖狀聯(lián)合觀察淘汰31個單菌落，對剩余的43個單菌落和親本菌株OuE進行SNP位點分析及細胞核染色觀察。結(jié)果顯示，菌株OuE的菌絲具備鎖狀聯(lián)合，且細胞中兩個細胞核通常相距較近（圖1-A），可判斷為雙核菌絲;有20個單菌落菌絲中細胞核較分散（圖1-B），初步判斷這些菌落菌絲為單核菌絲。

對親本菌株OuE和剩余單菌落進行JE54基因片段上的SNP位點分析。據(jù)DNA測序圖譜顯示，親本菌株OuE在第4個堿基（A/G）和第11個堿基（A/C）兩處存在SNP位點（圖2-A），而在單核菌絲OuE06中以上兩處不存在SNP位點（圖2-B）。通過SNP位點分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有14株菌株能擴增出目的條帶，且不具備SNP位點，因此確定這14株菌株的菌絲為單核菌絲，編號依次為OuE01～OuE14。

2. 2 雙單雜交結(jié)果

利用雙單雜交共獲得35株具備鎖狀聯(lián)合的雙核體菌株，將這35株菌株與兩個親本菌株（OuC和OuE）進行拮抗試驗（圖3），結(jié)果淘汰16株與親本菌株拮抗反應不明顯的菌株，而剩余19株菌株中有5株與其他菌株間的拮抗反應不明顯，故將其去除，最終共獲得14株雙單雜交后代。

對雙核親本、單核親本和雙單雜交后代的JF54基因片段SNP位點進行分析，結(jié)果顯示獲得的14株雙單雜交后代均存在SNP位點的改變，因此可確定為雜交后代。以親本雙核體菌株OuC與單核菌株OuE06的雜交后代OuCE06為例，在圖4-A中第4個堿基兩個親本分別為純合的C和G，而雜交后代為C/G的套峰;在圖4-B中第4個堿基親本雙核體菌株OuC 為A/T雜合，單核菌株OuE06為T，雜交后代仍為純合的T。說明雜交后代OuCE06的兩個細胞核分別來自于OuC和OuE06兩個親本。

2. 3 雜交后代小奧德蘑酮含量測定結(jié)果

親本菌株和雜交后代的菌絲生長速度如圖5所示。親本菌株OuC和OuE的菌絲平均生長速度分別為8.39和9.09 mm/d。大部分雜交后代的菌絲平均生長速度顯著高于兩個親本菌株（P<0.05，下同），其中，雜交后代OuCE02、OuCE08和OuCE12的菌絲平均生長速度分別為16.00、16.10和15.30 mm/d，均顯著高于兩個親本菌株。14株雙單雜交后代菌株發(fā)酵液的小奧德蘑酮含量比較如圖6所示。雜交后代OuCE03、OuCE05、OuCE08和OuCE10的菌絲發(fā)酵液小奧德蘑酮含量均高于兩個親本菌株，與親本菌株OuC相比，其菌絲發(fā)酵液小奧德蘑酮含量分別提高6.07%、47.66%、4.67%和15.42%。綜上所述，雙單雜交產(chǎn)生的菌株后代遺傳多樣性豐富，其中雜合菌株OuCE08的菌絲生長最迅速，且可產(chǎn)生高濃度的小奧德蘑酮。

2. 4 抗病性菌株篩選結(jié)果

利用對峙培養(yǎng)法檢測雙單雜交后代對木霉的抗性，結(jié)果顯示，對峙培養(yǎng)10 d后部分雜交后代如OuCE08（圖7-A）與木霉的拮抗現(xiàn)象明顯，長勢與木霉均衡，表現(xiàn)出較好的木霉抗性;部分雜交后代如OuCE06（圖7-B）與木霉存在一定拮抗現(xiàn)象，可阻止木霉的完全侵入，但長勢弱于木霉;部分雜交后代如OuCE10（圖7-C）對木霉的抵抗能力很差，菌絲生長區(qū)域完全被木霉菌絲侵入。

由表1可知，14株雜交后代中以OuCE01和OuCE08的抗木霉能力最強，且強于兩個親本菌株（OuC和OuE）; OuCE06和OuCE13的抗木霉能力與具有較強木霉抗性的親本菌株OuC相近;其余10株雜交后代的抗木霉能力與親本菌株OuE相近。說明雙單雜交能產(chǎn)生具有豐富遺傳特性的后代，可作為有效的育種手段用于篩選抗病長根菇菌株。

3 討論

雜交是食用菌育種最常用、最有效的方法之一，能迅速將親本優(yōu)勢性狀集中到子代，可用優(yōu)秀性狀的顯性基因掩蓋性狀不佳的隱性基因（馬三梅等，2004;桂明英等，2006;陳娟和蘇開美，2008）。雜交育種包括單孢雜交、多孢雜交和雙單雜交（陳世通等，2013;周莉，2014）。其中，雙單雜交的目的性最強，僅需一個單倍體菌絲，能有效節(jié)省孢子分離的時間，具有簡單、迅速、高效等優(yōu)勢（Pilotti et al.，2002）。高效篩選是食用菌雜交育種的關(guān)鍵步驟。SNP分子標記技術(shù)可對不同親本菌株進行標記，并通過對雜交后代相同位點分析實現(xiàn)對雜交后代的鑒別和親本追溯。Nieuwenhuis等（2013）通過對8個SNP位點的檢測，成功對60株野生裂褶菌菌株的親本進行追溯;Xiang等（2016）將SNP位點分析成功應用于茯苓雜交后代鑒定，并確立一套有效的雜交后代篩選方法。本研究利用SNP分子標記技術(shù)成功鑒定了長根菇的雜交后代，進一步證實該技術(shù)是鑒別食用真菌雜交后代的有效手段。

選擇適宜的檢測引物是開展SNP分析的關(guān)鍵步驟。李浩（2012）使用4對引物對不同來源的長根菇菌株進行SNP位點分析，根據(jù)SNP位點分布進行遺傳多樣性分析;并通過對雙孢長根菇菌株和四孢長根菇菌株進行SNP位點分析，確定雙孢長根菇為同核體，四孢長根菇為異核體。本研究對李浩（2012）篩選出的4條引物進行比對分析，發(fā)現(xiàn)JE54基因片段擴增條帶單一，測序結(jié)果表明有多個SNP位點適合進行雜交后代檢測。SNP位點分析雖然準確性高，但存在操作步驟繁瑣、成本高、周期長等缺點（Kwan et al.，2019）。本研究先通過拮抗試驗篩選出與兩個親本菌株均具有明顯拮抗現(xiàn)象的菌株，再利用SNP位點分析對篩選出的菌株作進一步鑒定，結(jié)果顯示篩選出的14株菌株均為真正的雜交后代?？梢姡L根菇雙單雜交后代快速、準確檢測的方法可先采用拮抗試驗作為初篩手段，再利用SNP位點分析進行復篩。

本研究利用長根菇菌株OuE雜交產(chǎn)生的14種擔孢子萌發(fā)單核菌絲與親本雙核體菌株OuC進行雙單雜交，結(jié)果表明，雜交后代OuCE02、OuCE08和OuCE12的菌絲生長速度顯著高于兩個親本菌株，雜交后代OuCE03、OuCE05、OuCE08和OuCE10的菌絲體發(fā)酵液小奧德蘑酮含量高于兩個親本菌株，雜交后代OuCE01和OuCE08的抗木霉能力強于兩個親本菌株。其中，雜交后代OuCE08在菌絲生長速度、小奧德蘑酮含量和木霉抗性方面均優(yōu)于兩個親本菌株，表明雙單雜交后代存在豐富的遺傳多樣性，有利于篩選出優(yōu)良性狀的新菌株，但雙單雜交的遺傳機理至今尚未清楚，有待于進一步研究。

4 結(jié)論

雙單雜交是一種快速有效獲得食用菌新菌株的遺傳育種方法，通過該方法篩選出一株高產(chǎn)小奧德蘑酮、高抗木霉的長根菇新菌株OuCE08。長根菇雙單雜交后代快速、準確的檢測鑒定可先采用拮抗試驗作為初篩手段，再利用SNP位點分析進行復篩。

參考文獻：

陳娟，蘇開美. 2008. 食用菌遺傳育種及種質(zhì)鑒定研究進展[J]. 中國食用菌，27（5）：3-8. [Chen J，Su K M. 2008. Proceeding of heredity，breeding and idioplasm identification of edible fungi[J]. Edible Fungi of China，27（5）：3-8.]

陳林香. 2018. 長根菇栽培技術(shù)[J]. 福建熱作科技. 43（1）：34-35. [Chen L X. 2018. Cultivation technology of Oudemansiella radicata[J]. Fujian Science & Technology of Tropical Crops，43（1）：34-35.]

陳世通，白建波，李夢杰，李榮春. 2013. 香菇單孢雜交及雜合子鑒定的研究[J]. 中國食用菌，32（1）：45-46. [Chen S T，Bai J B，Li M J，Li R C. 2013. Study on monospore cross and identification of heterozygotes of Shiitake[J]. Edible Fungi of China，32（1）：45-46.]

陳艷露，周莉，黃麟淇，劉斌. 2013. 抗木霉平菇菌株的篩選及其生產(chǎn)性能評價[J]. 北方園藝，（17）：145-148. [Chen Y L，Zhou L，Huang L Q，Liu B. 2013. Screening and evalua-tion of Oyster mushroom strains resistant to Trichoderma disease[J]. Northern Horticulture，（17）：145-148.]

戴玉成，周麗偉，楊祝良，文華安，圖力古爾，李泰輝. 2010. 中國食用菌名錄[J]. 菌物學報，29（1）：1-21. [Dai Y C，Zhou L W，Yang Z L，Wen H A，Bau Tolgor，Li T H. 2010. A revised checklist of edible fungi in China[J]. Mycosystema，29（1）：1-21.]

方少欽，高云超，廖森泰，肖更生，鄒宇曉，施英，劉凡，劉軍，穆利霞，沈維治. 2015. 桑枝栽培長根菇的試驗研究[J]. 農(nóng)學學報，5（5）：76-80. [Fang S Q，Gao Y C，Liao S T，Xiao G S，Zou Y X，Shi Y，Liu F，Liu J，Mu L X，Shen W Z. 2015. Cultivation experiments of the edible mushroom Oudemansiella radicata using sawdust based substrate made of mulberry branch powder[J]. Journal of Agriculture，5（5）：76-80.]

桂明英，王剛，郭永紅，劉蓓，馬紹賓. 2006. 食用菌育種技術(shù)的研究進展[J]. 中國食用菌，25（5）：3-5. [Gui M Y，Wang G，Guo Y H，Liu B，Ma S B. 2006. Research advancement of breeding technique about edible fungi[J]. Edible Fungi of China，25（5）：3-5.]

李浩. 2012. 長根菇生活史研究[D]. 長沙：湖南師范大學. [Li H. 2012. Study the life cycle of Oudemansiella radicata[D]. Changsha：Hunan Normal University.]

馬三梅，王永飛，亦如瀚. 2004. 食用菌育種的研究進展[J]. 西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），32（4）：108-112. [Ma S M，Wang Y F，Yi R H. 2004. Review of edible fungi breeding[J]. Journal of Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry（Natural Science Edition），32（4）：108-112.]

孫艷穎. 2013. 香菇、滑子菇新品種選育研究[D]. 石家莊：河北師范大學. [Sun Y Y. 2013. Studies on the breeding of new varieties of Lentinula edodes and Pholiota nameko[D]. Shijiazhuang：Hebei Normal University.]

譚琦，潘迎捷，陳明杰，賀冬梅，汪昭月，嚴培蘭，馮志勇，郭倩，劉德云，陳有興. 2000. 香菇申香10號菌種的選育與推廣[J]. 食用菌學報，7（3）：6-10. [Tan Q，Pan Y J，Chen M J，He D M，Wang Z Y，Yan P L，F(xiàn)eng Z Y，Guo Q，Liu D Y，Chen Y X. 2000. Strian selection and extention of Lentinula edodes shengxiang No.10[J]. Acta Edulis Fungi，7（3）：6-10.]

唐利華，高君輝，郭倩. 2010. 長根菇林地覆土栽培技術(shù)[J]. 食用菌，（5）：52-53. [Tang L H，Gao J H，Guo Q. 2010. Soil covering cultivation technique of Oudemansiella ra-dicata in forest[J]. Edible Fungi，（5）：52-53.]

田慧敏，劉鐵志，連靜，李桂林，巴特爾. 2014. 基于形態(tài)特征及ITS序列對內(nèi)蒙古紅菇的分類鑒定[J]. 食用菌學報，21（4）：15-19. [Tian H M，Liu T Z，Lian J，Li G L，Ba T E. 2014. Identification and classification of four Russula species from inner Mongolia based on morphology and ITS sequencing[J]. Acta Edulis Fungi，21（4）：15-19.]

萬魯長，李曉博，趙敬聰，張甲生，李瑞琴，郭惠東，楊鵬，劉軍，韓建東. 2019. 北方地區(qū)長根菇大棚地栽周年生產(chǎn)標準化技術(shù)[J]. 食藥用菌，27（2）：135-138. [Wan L Z， Li X B， Zhao J C， Zhang J S， Li R Q， Guo H D， Yang P， Liu J， Han J D. 2019. Annual production technique of Oudemansiella radicata in greenhouses in northern areas of China[J]. Edible and Medicinal Mushrooms， 27（2）：135-138.]

王波，祁麗萍，鮮靈. 2012. 金針菇雙單雜交的遺傳分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學報，25（5）：1805-1810. [Wang B，Qi L P，Xian L. 2012. Di-monad breeding and genetic analysis of Flammulina velutipes[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，25（5）：1805-1810.]

王春暉，尹永剛，胡汝曉，彭運祥. 2013. 基于ISSR和RAPD標記的八株灰樹花栽培菌株遺傳多樣性分析[J]. 食用菌學報，20（4）：1-5. [Wang C H，Yin Y G，Hu R X，Peng Y X. 2013. Genetic diversity of eight Grifola forndosa cultivars analyzed using ISSR and RAPD markers[J]. Acta Edulis Fungi，20（4）：1-5.]

楊祝良，臧穆. 1993. 我國西南小奧德蘑屬的分類[J]. 真菌學報，12（1）：16-27. [Yang Z L，Zang M. 1993. Classification of the genus Oudemansiella Speg. in southwest China[J]. Acta Mycologica Sinica，12（1）：16-27.]

葉明，葉崇軍，陳輝，王文敏. 2007. 香菇雙單雜交菌株富鐵及其培養(yǎng)條件研究[J]. 食品科學，28（1）：275-278. [Ye M，Ye C J，Chen H，Wang W M. 2007. Study on optimization of cultivation conditions in iron-enriched strains of di-mon mating in Lentinula edodes[J]. Food Science，28（12）：275-278.]

張磊，徐麗麗，何翠萍，郭立忠. 2018. 長根菇菌種鑒定及生長條件優(yōu)化[J]. 安徽農(nóng)學通報，24（5）：14-19. [Zhang L，Xu L L，He C P，Guo L Z. 2018. Identification of Oudemansiella radicata and its growth conditions optimization[J]. Anhui Agricultural Science Bulletin，24（5）：14-19.]

鐘祝爛，益志能. 2017. 長根菇工廠化栽培技術(shù)[J]. 食用菌，（2）：51-53. [Zhong Z L，Yi Z N. 2017. Industrial cultivation of Oudemansiella radicata[J]. Edible Fungi，（2）：51-53.]

周莉. 2014. 平菇單孢雜交及抗病新菌株選育[D]. 南寧：廣西大學. [Zhou L. 2014. Monospore cross breeding and screening of new strains resisitant to disease of Oyster mushroom[D]. Nanning：Guangxi University.]

朱兆香，莊文穎. 2014. 木霉屬研究概況[J]. 菌物學報，33（6）：1136-1153. [Zhu Z X，Zhuang W Y. 2014. Current understanding of the genus Trichoderma（Hypocreales，Ascomycota）[J]. Mycosystema，33（6）：1136-1153.]

Acharya K，Nandi S，Dutta A K. 2019. Microanatomical and physicochemical characterization and antioxidative activity of methanolic extract of Oudemansiella canarii（Jungh.） H?hn[J]. Turkish Journal of Pharmaceutical Sciences，16（1）：76-81.

Carvalho D B，Smith M L，Anderson J B. 1995. Genetic exchange between diploid and haploid mycelia of Armilla-ria gallica[J].Mycological Research，99（36）：641-647.

Eiji T，Kenji Y，Yuri M，Kenjiro K. 1994. Nuclear selection and nuclear substitution in fully compatible demonm ma-tings in Pleurotus ostreatus[J]. Mycoscience， 35（3）：239-243.

Gao Z，Liu X C，Wang W S，Yang Q H，Dong Y H，Xu N，Zhang C，Song X L，Ren Z Z，Zhao F L，Z L J，Jia L. 2019. Characteristic anti-inflammatory and antioxidative effects of enzymatic-and acidic-hydrolysed mycelium polysaccharides by Oudemansiella radicata on LPS-induced lung injury[J]. Carbohydrate Polymers，204：142-151.

Hao Y J，Zhao Q，Wang S X，Yang Z. 2016. What is the radicate Oudemansiella cultivated in China[J]. Phytotaxa，286（1）：1-12.

Koizumi S，Nagatsu T，Iinuma H，Ohno M，Takeuchi T，Umezawa H. 1982. Inhibition of phenylalanine hydroxylase，a pterin-requiring monooxygenase，by oudenone and its derivatives[J]. The Journal of Antibiotics，35（4）：458-462.

Kwon O C，Lee C S，Park Y J. 2019. SNP and SCAR mar-kers for specific discrimination of antler-shaped Ganoderma lucidum[J]. Microorganisms，7（1）：12.

Mah J T L，Low E S H，Lee E. 2011. In silico SNP analysis and bioinformatics tools：A review of the state of the art to aid drug discovery[J]. Drug Discovery Today，16（17-18）：800-809.

Nieuwenhuis B P S，Nieuwhof S，Aanen D K. 2013. On the asymmetry of mating in natural populations of the mushroom fungus Schizophyllum commune[J]. Fungal Genetics and Biology，56（5）：25-32.

Pilotti C A，Sanderson F R，Aitken E A B. 2002. Sexuality and interactions of monokaryotic and dikaryotic mycelia of Ganoderma boninense[J]. Mycological Research，106（11）：1315-1322.

Wang Y F，Jia J X，Ren X X，Li B H，Zhang Q. 2018. Extraction，preliminary characterization and in vitro antioxidant activity of polysaccharides from Oudemansiella radicata mushroom[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 120（Part B）：1760-1769.

Xiang X Z，Wang X X，Bian Y B，Xu Z Y. 2016. Development of crossbreeding high-yield-potential strains for commercial cultivation in the medicinal mushroom Wolfiporia cocos（Higher Basidiomycetes）[J]. Journal of Natural Me-dicines，70（3）：645-652.

（責任編輯 蘭宗寶）

優(yōu) 秀 青 年 學 者 論 壇

于浩（1985-），博士，副教授，青島農(nóng)業(yè)大學生命科學學院碩士生導師，畢業(yè)于上海交通大學微生物代謝國家重點實驗室。主要從事食用菌遺傳育種及食用菌生長發(fā)育與抗病、抗逆分子機理研究工作。主持、參與國家自然科學基金項目、國家重點研發(fā)計劃項目、山東省自然科學基金項目、山東省重點研發(fā)計劃項目、山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系食用菌創(chuàng)新團隊建設項目等13項。在國內(nèi)外期刊上發(fā)表論文40余篇，其中以第一作者或通訊作者在《Journal of Biological Chemistry》《Applied and Environmental Microbiology》《Applied Microbiology and Biotechnology》《Journal of Bacteriology》等SCI期刊上發(fā)表學術(shù)論文16篇。申報國家專利9項，獲國家發(fā)明專利3項。