陳庭見智　袁文斌　吳景芝　王玉英　吳紅芝

摘要：【目的】分析紫斑百合與栽培百合的親緣關系，為利用紫斑百合改良栽培百合雜交育種中親本的選配提供指導。【方法】以6份紫斑百合野生資源和92份市場流行、廣泛栽培的百合品種為材料，通過兩輪溫度梯度PCR篩選引物后，利用SSR引物對DNA進行PCR擴增，并進行UPGMA聚類分析。【結果】從100對SSR引物共篩選獲得15對通用性好、多態(tài)性高、擴增條帶清晰的引物。15對SSR引物在98份百合樣品中共檢測到93.0個等位位點，平均每對引物6.2個。多態(tài)性信息含量（PIC）為0.29～0.84，平均為0.66，其中PIC高于0.50的引物有13對，屬于高多態(tài)性引物。UPGMA聚類分析結果顯示，98份樣品聚為兩大分支，分支Ⅰ包括紫斑百合、O（東方百合）雜種系和OT雜種系，表明其遺傳關系較近，篩選的15對SSR引物可將這3個類群進行有效區(qū)分;分支Ⅱ包括LA雜種系、L（麝香百合）雜種系和A（亞洲百合）雜種系，不同的類群間有部分交叉，篩選的15對引物不能對其進行有效區(qū)分?！窘Y論】篩選出的15對SSR引物可將98份百合材料分為兩大分支，并可應用于分支Ⅰ中3個類群的分子鑒定。紫斑百合與OT雜種系和O雜種系的遺傳關系更近，在制定紫斑百合與栽培百合雜交組合時可先從OT雜種系和O雜種系的雜交改良展開研究，特別是聚在紫斑百合附近的優(yōu)良OT百合品種。

關鍵詞： 紫斑百合;栽培百合;SSR分子標記;親緣關系;雜交育種;聚類分析

中圖分類號： S644.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）12-2647-09

Phylogenetic relationship between Lilium nepalense and cultivated lilies based on SSR molecular markers

CHEN Ting-jian-zhi， YUAN Wen-bin， WU Jing-zhi， WANG Yu-ying， WU Hong-zhi*

（College of Horticulture and Landscape， Yunnan Agricultural University， Kunming? 650201， China）

Abstract：【Objective】The purpose of this study was to explore the genetic relationships between Lilium nepalense and cultivated lilies to provide reference for improving parent breeding in the hybrids of cultivated lilies improved by L. nepalense. 【Method】A total of 6 wild L. nepalenses and 92 cultivars with market interests were analyzed in this study. SSR primer pairs were screened for polymorphism in two rounds of temperature gradient PCR. Following all samples were amplified by selected SSR primers， UPGMA cluster was performed. 【Result】There were 15 SSR primer pairs with good versatility， high polymorphism and clear amplification bands being screened from 100 pairs of SSR orimers. A total of 93 allelic loci were detected in 15 primer pairs among the 98 lily samples， with an average of 6.20 alleles of every pri-mer pair. The variation range of polymorphism information content（PIC） was 0.29-0.84， with an average value of 0.66， and PIC of 13 primer pairs was higher than 0.50， which were high polymorphism primers. UPGMA cluster analysis showed that 98 samples were divided into two main branches. BranchⅠ included L.nepalense， O（Oriental） hybrids and OT hybrids， indicating that their phylogenetic relationships was closely related， and three groups could be distinguished effectively by the selected 15 primer pairs. Branch Ⅱ included LA hybrids， L（Easter） hybrids and A （Asia） hybrids. But there were overlaps among the groups， the 15 SSR primer pairs could not classified them effectively. 【Conclusion】The selected 15 SSR primer pairs can divide 98 lily samples into two main branches， and can be applied to molecular identification of three groups in branch Ⅰ. L. nepalense has a closer relationship with O hybrids and OT hybrids. When making a crossbreeding program between L. nepalense and cultivated lilies， O hybrids and OT hybrids can be given a priority to cross with L. nepalense， especially the excellent OT hybrids， which are clustered around L. nepalense.

Key words： Lilium nepalense; cultivated lily; SSR molecular markers; phylogenetic relationship; crossbreeding; cluster analysis

0 引言

【研究意義】百合是我國的傳統(tǒng)名花，寓意美好，深受人們喜愛，也是目前居世界第二的切花?，F(xiàn)代栽培觀賞百合主要由雜交選育而來，具有較高的經濟和美學價值（郭志剛和張偉，2001），但現(xiàn)代栽培百合尚缺乏許多優(yōu)良性狀，如缺乏綠花、清香味和抗性等。我國擁有豐富的百合資源，原產47種，約占世界百合資源的一半，是現(xiàn)代栽培百合的重要親本源（吳征鎰等，1997;龍雅宜和張金政，1998;梁振旭，2014）。紫斑百合為百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）植物，花淡黃綠色至淡綠色，花瓣中至底部有紫色斑點，花被反卷如喇叭狀，花朵大而多，氣味清幽淡雅，生長強健，是最具開發(fā)利用價值的野生百合之一（何顯靜等，2003;李標等，2004;吳學尉等，2006）。鑒于紫斑百合的優(yōu)良性狀及其蘊藏的巨大育種價值，探究紫斑百合與栽培百合間的親緣關系，對制定紫斑百合與栽培百合雜交組合，利用紫斑百合改良栽培百合具有重要指導意義。【前人研究進展】我國野生百合主要分為卷瓣組、鐘花組、百合組和輪葉組，而紫斑百合同時兼具卷瓣組和輪葉組的特征。在親緣關系不清基礎上盲目選擇親本雜交，經常會導致雜交不親和或雜交后代不育（趙祥云等，1994;張克中等，2008;郭朋輝等，2019）及時間和種質材料的浪費。分子標記在百合的種質鑒定、親緣關系、遺傳多樣性及系統(tǒng)進化方面得到廣泛應用，是百合種質資源保護和新品培育的重要手段（張云等，2001;羅鳳霞等，2008;侯珺等，2016;趙玉倩等，2016）。趙祥云等（1995）運用RAPD分子標記評價了14個百合品種（含13個栽培種和1個野生種）間的遺傳關系;左志銳等（2005）對60個百合野生種及栽培品種進行了RAPD分析;王潔瓊（2006）調查和收集了云南、陜西和吉林長白山部分地區(qū)的50份百合資源，并采用AFLP和cpSSR兩種分子標記對百合資源的遺傳多樣性進行研究;陳瓊等（2007）以百合兩個雜交組合（Brunello×Yellow Jiant和Prato×Lilium pumilum）的親本和雜交后代為試驗材料，采用4對多態(tài)性高的SRAP引物進行分析，證實雜交后代的真實性及遺傳偏向;崔光芬等（2008）以滇蜀豹子花和多斑豹子花為材料，測定其ITS序列，結合GenBank中其他3種豹子花和5種百合的ITS序列構建了系統(tǒng)發(fā)育進化樹。SSR（Simple sequence repeats）與其他分子標記相比，具有在染色體上分布均勻、多態(tài)性豐富、共顯性遺傳和易于檢測等優(yōu)點（Devarumath et al.，2002）?；贏BI 3730XL遺傳分析儀（Applied Biosystems Sequence Analyzer）的SSR熒光標記毛細管電泳技術使擴增產物長度的檢測更精確，誤差通常在1 bp內，不同熒光標記產物相互混合同時檢測，實驗效率極大提高（Shirasawa et al.，2011），目前已廣泛應用于各種材料的研究，如水稻（程本義等，2011）、銀杏（王星星等，2017）、花菜（劉春晴等，2018）和茶花（陶乃奇等，2019）等。近年來，在百合中也開發(fā)出了許多穩(wěn)定性好和多態(tài)性高的SSR分子標記。楊素麗等（2008）、Lee等（2011）依據NCBI數(shù)據庫中已知的EST（Expressed sequence tags）序列信息檢索含有SSR的序列，以此開發(fā)新的分子標記;葛亮等（2012）、Yuan等（2013）利用岷江百合（L. regale）轉錄組數(shù)據開發(fā)了EST-SSR分子標記;杜方（2014）分析百合鱗莖、葉片和花朵的表達譜數(shù)據庫，開發(fā)了61對SSR引物?！颈狙芯壳腥朦c】分子標記在百合種質鑒定、親緣關系、遺傳多樣性和系統(tǒng)進化方面已有較多研究，但利用分子標記分析紫斑百合與栽培百合間親緣關系的研究尚無報道。【擬解決的關鍵問題】利用SSR分子標記對云南地區(qū)野生紫斑百合與目前市場流行和廣泛栽培的東方百合（O）雜種系、OT雜種系、亞洲百合（A）雜種系、麝香百合（L）雜種系和LA雜種系的親緣關系進行研究，以期為利用紫斑百合改良栽培百合雜交育種中親本的選配提供指導，以減少栽培百合雜交育種的盲目性，提高育種效率。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗于2017年6月—2018年12月進行。試驗用百合材料種植于云南農業(yè)大學園林園藝學院溫室，SSR分子標記試驗在中國科學院昆明植物研究所進行。試驗材料共98份，其中包括6份紫斑百合、17份東方百合（O）雜種系、20份OT雜種系、7份亞洲百合（A）雜種系、3份麝香百合（L）雜種系和45份LA雜種系。材料詳細信息見表1。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 DNA提取 選取新鮮的百合嫩葉，采用CTAB法提取總DNA，提取的DNA經TE Buffer溶解后加入2.0 μL RNA酶37 ℃消化2 h，并用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop ND-1000對質量進行檢測，檢測后如有DNA質量不達標，對其進行重新提取。最后將質量合格的DNA濃度稀釋至30 ng/μL，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 引物和退火溫度篩選 試驗所用的100對百合SSR引物，其中有57對是利用Primer 5.0對NCBI數(shù)據庫中百合EST序列設計獲得，43對是從前人的研究報道中（葛亮等，2012;Yuan et al.，2013;杜方，2014;趙玉倩等，2016）選取，引物由昆明碩擎生物技術有限公司合成。設置溫度梯度對引物退火溫度進行篩選，溫度范圍為50～65 ℃，梯度為1 ℃，PCR在Applied Biosystems Veriti PCR儀上進行。反應體系20.0 μL：10.0 μL 2×Taq PCR MasterMix[天根生化科技（北京）有限公司]，正、反向引物各0.5 μL（5 μmol/L），1.0 μL DNA模板，8.0 μL ddH2O。擴增程序：94 ℃預變性2 min;94 ℃ 30 s，50～65 ℃退火35 s，72 ℃ 45 s，進行35個循環(huán);72 ℃延伸7 min;4 ℃保存。聚丙烯酰氨凝膠電泳中PCR產物上樣量2.0 μL，分子量標準100 bp DNA Ladder上樣量1.0 μL，220 V電壓下電泳1.5 h，經固定、銀染、脫色和顯影4個步驟后對檢測結果拍照保存以便進行下一步分析。

1. 2. 3 SSR熒光標記毛細管電泳檢測 篩選的引物由碩擎生物公司合成熒光引物，熒光標記PCR反應體系和擴增程序與引物篩選時一致，按PCR產物1.0 μL，片段大小標準 GS500（-250）LIZ 0.1 μL和高度去離子甲酰胺（HiDi）8.9 μL，充分混勻，置于PCR儀中95 ℃變性5 min后迅速冰浴2 min，最后在ABI3730xl遺傳分析儀上進行毛細管電泳檢測，運用GeneMarker對上機結果進行片段讀取及基因分型分析。

1. 2. 4 SSR引物多態(tài)性分析 毛細管電泳結果采用“0-1”系統(tǒng)進行譜帶位置記錄，樣品在某一擴增長度位點處有峰值出現(xiàn)記作“1”，代表該樣品在此SSR位點處出現(xiàn)對應長度的擴增片段，無峰值出現(xiàn)記作“0”，代表該樣品在此位點無擴增片段，結果采用Excel 2003記錄保存?；?8份百合樣品的SSR擴增結果計算每對引物的等位基因數(shù)和多態(tài)性信息含量（PIC），對引物的多態(tài)性進行評價。PIC利用公式PIC=1-[inP2i]進行計算，式中，Pi表示第i個等位基因出現(xiàn)的頻率，當PIC>0.50為高多態(tài)性引物，0.25<PIC≤0.50為中多態(tài)性引物，PIC≤0.25為低多態(tài)性引物。

1. 2. 5 UPGAM聚類分析 毛細管電泳統(tǒng)計的98份百合樣品（0，1）矩陣，根據Gower（1971）、Podani（1999）提出的方法，使用R語言包對樣品間的遺傳距離進行計算，采用MEGA 7.0構建UPGAM系統(tǒng)發(fā)生樹。

2 結果與分析

2. 1 DNA提取結果

98份百合樣品DNA經NanoDrop ND-1000檢測，濃度均在50 ng/μL以上。以分子量標準100 bp DNA Ladder（M）為對照，經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果（圖1）顯示大部分DNA在23130 bp處條帶清晰明亮，有明顯的主帶，個別樣品（ct63、ct65、c78和ct84）發(fā)生輕微降解，DNA總體質量符合SSR-PCR擴增要求。

2. 2 SSR引物篩選

采用12份樣品和溫度梯度對100對引物進行篩選，初步篩選出26對多態(tài)性較好的引物。選取24份樣品再次對初篩引物進行第二輪篩選，最終確定15對通用性好、擴增條帶清晰、多態(tài)性高和雜帶少的SSR引物。部分SSR引物擴增產物的聚丙烯酰氨凝膠電泳結果見圖2，篩選出的15對引物名稱、序列和最適退火溫度見表2。

2. 3 擴增片段大小和等位基因數(shù)目

采用15對熒光引物分別對98份百合材料進行擴增，熒光引物在正向引物的5'端添加熒光染料fam（藍色）或hex（綠色），擴增得到的片段長度為90～300 bp。不同引物等位基因數(shù)2.0～10.0個，15對SSR引物共檢測到93.0個等位基因，每對引物平均6.2個，其中引物C-15的等位基因數(shù)最多，為10個，引物C-18最少，為2.0個。引物C-16在Party Diamond、Corvara和Trogon的擴增帶型見圖3，各引物熒光標記種類、擴增片段大小和等位基因數(shù)見表3。

2. 4 多態(tài)性分析結果

PIC用于評價每個SSR分子標記用于群體檢測多態(tài)性的價值，某個位點出現(xiàn)等位基因數(shù)目越多，各等位基因頻率越平等，PIC越高。由表3可知，15對SSR引物的PIC變化范圍為0.29～0.84，平均為0.66，其中引物C-15和C-a15的PIC最高，為0.84，引物C-a46的PIC最低，為0.29。15對SSR引物中PIC高于0.50的有13對，屬于高多態(tài)性位點引物，具有很好的群體遺傳多樣性鑒別能力，其余2對引物屬于中度多態(tài)性引物，表明篩選的15對SSR引物多態(tài)位點變異性好，多態(tài)性鑒別能力高。

2. 5 UPGMA聚類分析結果

根據樣品間的遺傳距離，利用MEGA 7.0繪制UPGMA系統(tǒng)發(fā)生樹。結果（圖4）顯示，98份百合樣品聚為兩大分支：分支Ⅰ以紫斑百合、OT雜種系和O雜種系為主，3個類群分別聚為一支，篩選的15對SSR引物可將各類群進行有效區(qū)分。紫斑百合先與OT雜種系聚在一起，再與O雜種系共同構成分支Ⅰ，表明其遺傳關系較近。分支Ⅱ以LA雜種系、L雜種系和A雜種系為主，3個雜種系沒有明顯地各自聚為一支，LA雜種系分散在整個分支Ⅱ中，A雜種系和L雜種系則聚在分支Ⅱ靠近基部位置，3個種系間可能進行過頻繁的基因交流，篩選的15對SSR引物無法將其進行有效區(qū)分。

3 討論

紫斑百合具有商業(yè)品種中缺乏的綠花性狀，花朵大而多，氣味清幽淡雅，生長適應性強，是最具開發(fā)利用價值的野生百合之一（吳學尉等，2006;郭朋輝等，2019）。本研究中的92份栽培百合資源是目前市場上流行、廣泛栽培且綜合性狀好、商業(yè)性狀突出的品種，研究紫斑百合與這些栽培百合的親緣關系，對利用紫斑百合改良栽培百合，培育出具有市場價值的商業(yè)品種具有重要指導意義。

從多態(tài)性結果來看，本研究篩選的15個SSR分子標記在98份百合樣品中表現(xiàn)出較高的多態(tài)性水平，平均等位基因數(shù)6.2個，高于葛亮等（2012）的3.47個、Yuan等（2013）的2.97個、鐘程等（2015）的1.69個，平均PIC為0.66，高于葛亮等（2012）的0.55和Yuan等（2013）的0.494，平均等位基因數(shù)和平均PIC均是已知報道中最高的。本研究在選擇百合樣本時考慮其種系歸屬，避免了種系過于單一或同一種系樣品過于集中對多態(tài)性結果造成的影響。本研究用于百合資源鑒定的15對SSR引物是通過兩輪篩選獲得，較只經過一輪篩選的引物通用性更好，多態(tài)性更高，擴增條帶更清晰。多態(tài)性條帶檢測采用熒光毛細管電泳方法，檢測結果比傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠電泳方法更精確，也避免了人為主觀因素帶來的影響。

本研究的98份百合材料分別歸屬于5個雜種系和1個原生種，聚類分析結果與已知的分類關系基本一致。杜方（2014）通過SSR對32份百合材料進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)32個樣品聚為G1和G2兩個大組，G1包括A雜種系、L雜種系、LA雜種系和7個原生種，其中7個原生種曾參與A雜種系的形成，G2包括O和OT和1個原生種，該原生種曾是O類百合的雜交親本，與本研究得到的結果類似。本研究的UPGMA聚類分析結果表明，分支Ⅰ中紫斑百合與OT系和O雜種系遺傳關系更近，在發(fā)掘利用紫斑百合優(yōu)良性狀時可優(yōu)先考慮與OT雜種系和O雜種系雜交，特別是聚在紫斑百合附近的優(yōu)良OT百合品種;但在分支Ⅱ中3個雜種系未明顯地聚為一支，有部分交叉，可能是篩選出的15對SSR引物無法將其進行有效區(qū)分，需開發(fā)新的SSR分子標記，或與SNP分子標記（鄭司浩等，2014）、AFLP分子標記（Hir，2016）及表型（段青等，2018）等相結合作更進一步的分析。本研究的百合栽培品種資源是從目前市場流行的主栽品種中收集而來，可收集的資源種類和數(shù)量受市場選擇的影響，供試的92份栽培百合品種中，有20份OT雜種系、17份O雜種系、7份A雜種系、3份L雜種系和45份LA雜種系，各類群數(shù)量不均勻，類群還不夠豐富，缺乏T、OA、LO和LT等類群，同時野生紫斑百合資源也受生境破壞的嚴重影響，數(shù)量越來越少，未來的工作中將盡可能多地收集資源以豐富樣本庫。

4 結論

從100對SSR引物中篩選出通用性好、擴增條帶清晰和多態(tài)性高的15對SSR引物，篩選出的15對SSR引物可將98份百合材料分為兩大分支，并可應用于分支Ⅰ中3個類群（紫斑百合、OT雜種系和O雜種系）的分子鑒定。紫斑百合與OT雜種系和O雜種系的遺傳關系更近，在制定紫斑百合與栽培百合雜交組合時可先從OT雜種系和O雜種系的雜交改良展開研究，特別是聚在紫斑百合附近的優(yōu)良OT百合品種。

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（責任編輯 麻小燕）