劉洋 王玉英 李枝林 李茹

摘?要：該研究以大花蕙蘭‘紅酒’（Cymbidium hybridum ‘hongjiu’）×蓮瓣蘭‘邊草素花’（C. tortisepalum ‘biancaosuhua’）F1代雜交種原球莖和根狀莖為材料，比較了不同激素配比增殖分化、生根的培養(yǎng)基，建立了適用雜交蘭組培快繁體系。結(jié)果表明：1/2MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+AC 0.05%+香蕉80 g·L-1對原球莖增殖效果最佳，增殖率達到307%;1/2MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1 +AC 0.05%+香蕉80 g·L-1有利于原球莖分化，分化率為82%;1/2MS+TDZ 2.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+AC 0.05%+香蕉80 g·L-1對根狀莖增殖分化效果最佳，增殖率為293%，分化率為79%;1/2MS+IBA 0.5 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+AC 0.05%+香蕉80 g·L-1為最佳生根培養(yǎng)基，生根率達到84.7%，且根粗苗壯，葉色濃綠。此體系為雜交蘭種苗的規(guī)?；a(chǎn)提供了技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞： 蘭花雜交種， 根狀莖， 原球莖， 增殖與分化

Tissue culture and rapid propagation techniques in Cymbidium hybridum ‘hongjiu’× C. tortisepalum ‘biancaosuhua’

LIU Yang， WANG Yuying， LI Zhilin*， Li Ru

（ Institute of Landscape Plants， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China ）

Abstract：A rapid propagation technique system of hybrid orchid was established by comparing the effects of different hormone ratios on proliferation and rooting， with the protocorms and rhizomes of F1 hybrids of Cymbidium hybridum ‘hongjiu’ and C. tortisepalum‘biancaosuhua’ were used as materials. The results were as follows：1/2MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA1.0 mg·L-1+AC 0.05%+banana 80 g·L-1 had the best conductive effects on proliferation of protocorm， and the proliferative rate reached to 307%;1/2MS+

6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+AC 0.05%+banana 80 g·L-1 medium was beneficial to differential protocorm culture， and the differential rate was 82%;1/2MS+TDZ 2.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+AC 0.05%+banana 80 g·L-1 medium was conductive to proliferation and differentiation of rhizome， and the proliferative rate reached 293%， the differential rate was 79%. Medium of 1/2MS+IBA 0.5 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+AC 0.05%+banana 80 g·L-1 was the best for rooting， the rooting rate was 84.7%， and the roots were healthy with strong seedlings， and the leaves were dark green. This system provides technical support for large-scale production of hybrid orchid seedlings.

Key words： Orchid hybrid， rhizome， protocorm， proliferation and differentiation

蘭花為中國傳統(tǒng)名花，觀賞價值極高。國蘭（Chinese Cymbidium）是中國傳統(tǒng)十大名花之一，通常是指蘭科蘭屬（Cymbidium）植物中的部分地生蘭，其花型較小，但氣味芳香、葉態(tài)優(yōu)美。大花蕙蘭（Cymbidium hybridum）屬蘭科（Orchidaceae）蘭屬（Cymbidium）多年生草本植物，是蘭屬內(nèi)一些附生蘭雜交種的統(tǒng)稱，其大部分品種葉片長且披散，花無香味（朱根發(fā)等，2004）。大花蕙蘭‘紅酒’為大花、早開花品種，常在圣誕節(jié)前后開花，可用于培育圣誕節(jié)開花的紅花盆栽品種。蓮瓣蘭‘邊草素花’是蘭科蘭屬多年生草本植物，屬地生蘭，為細葉蓮瓣蘭類，葉槽較深，葉邊金黃色，花為淡黃色全素，開花2～4朵，花幽香。

以‘紅酒’ב邊草素花’為親本進行種間雜交，意在獲得花期長、花朵較大、鮮艷美麗且有香味的蘭花新品種。對大花蕙蘭（Cymbidium hybridum）若采用傳統(tǒng)的分株繁殖，則繁殖速度慢、周期長（盧思聰，1994），且大多是引進的國外優(yōu)良品種，難以滿足市場需求，因此需通過組織培養(yǎng)來快速繁殖大花蕙蘭。國內(nèi)外已開展了對蘭花雜交種的研究，目前已有數(shù)千個品種，但對地生蘭和附生蘭雜交種的研究較少。近年來，國內(nèi)的研究大多集中在雜交育種和胚培養(yǎng)方面（鄭立明，2010;朱根發(fā)等，2005;丁長春和夏念和，2011;陳瑤瑤等，2009），雜交蘭原球莖的增殖分化研究報道較多（宋蓮等，2017;謝利等，2014），根狀莖報道較少，但對大花蕙蘭‘紅酒’×蓮瓣蘭‘邊草素花’F1代雜交種的快繁技術(shù)目前尚未見有研究報道。因此，本研究以大花蕙蘭‘紅酒’×蓮瓣蘭‘邊草素花’F1代雜交種的根狀莖和原球莖為材料，在不同的培養(yǎng)基上進行增殖分化、生根，以篩選出最適培養(yǎng)基，從而為雜交蘭的工廠化生產(chǎn)和新品種選育奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1 材料

大花蕙蘭‘紅酒’（♀）與蓮瓣蘭‘邊草素花’（）雜交種原球莖和根狀莖材料，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉研究所自主培育。雜交種萌發(fā)后產(chǎn)生原球莖和根狀莖。雜交蘭產(chǎn)生的胚狀體長條狀稱為根狀莖，形成的胚狀體圓球形稱為原球莖，從中分別挑選出性狀長勢一致的原球莖和根狀莖為試驗材料。本試驗在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院花卉所組培實驗室進行。

1.2方法

1.2.1 原球莖和根狀莖的增殖分化?將原球莖大小為0.3 cm和根狀莖約為1.5 cm，分別接種于1/2MS基本培養(yǎng)，添加不同濃度配比的NAA、TDZ和6-BA，附加香蕉80 g·L-1和活性炭0.5 g·L-1，暗培養(yǎng)45 d后再進行光照培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度（23 ± 2） ℃，光照度1 800～2 500 lx。pH5.8，瓊脂7 g·L-1和蔗糖30 g·L-1。每處理42個原球莖，根狀莖處理30個，重復(fù)3次。對30 d后的增殖率和60 d后的出芽率進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.2 生根培養(yǎng)?將苗高2～3 cm的無根苗接種于1/2MS基本培養(yǎng)添加如下植物激素濃度：6-BA 0.3 mg·L-1，NAA 0～2.0 mg·L-1和IBA 0～1.0 mg·L-1上進行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。培養(yǎng)60 d統(tǒng)計生根率、根長、根粗等情況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

原球莖增殖分化階段每瓶5個，每處理10瓶，重復(fù)3次;根狀莖增殖分化階段每瓶5個，每處理10瓶，重復(fù)3次;生根培養(yǎng)階段每瓶5苗，每處理10瓶，重復(fù)3次。數(shù)據(jù)采用DPS9.50統(tǒng)計軟件分析進行差異顯著性分析。

2?結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對原球莖增殖分化的影響

在原球莖增殖分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10 d后，開始增殖、出芽分化，隨著天數(shù)的增加，增殖率、出芽率增大，30 d后不同激素配比培養(yǎng)基增殖率、出芽率有所差異。由表1可知，隨著6-BA濃度的增加，增殖率出現(xiàn)了先上升后下降的趨勢，不同濃度6-BA對雜交蘭原球莖增殖分化影響顯著，2號培養(yǎng)基1/2MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+AC 0.05%+香蕉80 g·L-1對原球莖增殖分化最好，增殖率為307%;比6-BA 2.0 mg·L-1、2.5 mg·L-1的培養(yǎng)基顯著高186%、344%，數(shù)據(jù)表明6-BA濃度高于2.0 mg·L-1，原球莖增殖率明顯下降，原球莖出芽率增殖不明顯，5號培養(yǎng)基出現(xiàn)了部分褐化，由此可見激素濃度大于一定限度不利于原球莖增殖。3號培養(yǎng)基出芽率顯著高于其他培養(yǎng)基，出芽率為82%，分別比添加NAA 1.0、2.0、2.5 mg·L-1培養(yǎng)基培養(yǎng)的出芽率顯著高105%、78%、310%，芽體翠綠，無褐化情況，可見6-BA 1.5 mg·L-1最適于原球莖出芽增殖，太低或太高濃度的6-BA均不能啟動芽分化，還會導(dǎo)致出芽黃化。

以上結(jié)果表明，6-BA 1.0 mg·L-1有利于原球莖增殖，6-BA 1.5 mg·L-1促進分化培養(yǎng)效果最佳，高濃度6-BA抑制了增殖分化效果。

2.2 不同激素配比對雜交蘭根狀莖增殖分化的影響

將原球莖誘導(dǎo)出來的根狀莖接種于不同濃度的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，隨時間延長增殖分化出根狀莖、不定芽，結(jié)果如表2所示。不同濃度TDZ對根狀莖增殖分化效果明顯，NAA濃度為0.3 mg·L-1，處理1比含TDZ 2.0 mg·L-1、3.0 mg·L-1的培養(yǎng)基顯著高288%、443%，隨著TDZ濃度的增加，增殖率出現(xiàn)了明顯下降的趨勢，表明高濃度的TDZ不利于根狀莖增殖，根狀莖長度增長不明顯，顏色較淺。TDZ濃度為2.0 mg·L-1時，NAA濃度為0.1 mg·L-1分化效果最佳，分別比添加NAA 0.3 mg·L-1、0.5 mg·L-1的培養(yǎng)基顯著高216%、203%，且顏色呈綠色，根狀莖長度明顯增長，在原有的根狀莖上增殖出長短不一的根狀莖，莖周圍新長出茂密的絨毛。隨著NAA濃度增加分化率越低，抑制芽的分化，芽體顏色較淺，為淡綠色。所以綜合考慮4號培養(yǎng)基1/2MS+TDZ 2.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+AC 0.05%+香蕉80 g·L-1對根狀莖增殖分化效果最佳，增殖率為293%，出芽率為79%，出芽較多，芽體呈綠色。

以上結(jié)果表明， TDZ 2.0 mg·L-1和NAA 0.1 mg·L-1組合使用有利于根狀莖的增殖分化，高濃度的TDZ、NAA抑制根狀莖的增殖分化效果。

2.3 不同 NAA 、IBA濃度生根的影響

將原球莖和根狀莖分化的無根小苗接種于不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隨著時間延長，苗體數(shù)量不斷增加，60 d統(tǒng)計結(jié)果如表3可知，不同激素配比的培養(yǎng)基對植株生根有影響。2號培養(yǎng)基和3號培養(yǎng)基的生根率均較高，NAA濃度在0.5～1.0 mg·L-1為最佳濃度，生根率均達到72%，根系誘導(dǎo)較好，根粗而多，葉色濃綠，長勢好;當NAA濃度大于1.0 mg·L-1時，苗的生根受到抑制，生根率出現(xiàn)了先上升后下降的趨勢;受誘導(dǎo)形成的組培苗本身激素含量的影響，壯苗培養(yǎng)時低濃度的NAA可以更好地促進苗體生長，比添加NAA 1.5 mg·L-1、2.0 mg·L-1顯著高46%、140%。但是，不添加NAA 植株則表現(xiàn)為矮化，葉片部分黃化。隨著IBA濃度增大，生根率也明顯提高，生根率出現(xiàn)了先上升后下降的趨勢。在左利娟等（2015）的研究中IBA濃度對雜交蘭根狀莖有促進作用，本研究NAA 0.3 mg·L-1和IBA 0.5 mg·L-1組合使用為最佳濃度，生根率為84.7%，分別比添加IBA 0 mg·L-1、0.3 mg·L-1、1.0 mg·L-1的培養(yǎng)基顯著高11%、32.9%、57.4%。綜合考慮，1/2MS+IBA 0.5 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+AC 0.05%+香蕉80 g·L-1為最佳生根培養(yǎng)基。

以上結(jié)果表明，高濃度NAA抑制了生根效果，IBA 0.5 mg·L-1和NAA 0.3 mg·L-1組合使用促進植株生根，且葉色濃綠，根數(shù)較多而粗，苗長勢良好。

3?討論與結(jié)論

蘭科植物大多是由原球莖分化成完整植株（Amaki & Haguchi， 1989），雜交蘭誘導(dǎo)分化出原球莖進一步生長為根狀莖（王國興，1989），用于蘭花組培的材料主要有莖尖、葉片、種子，目前大多采用種子萌發(fā)形成中間材料進行擴繁，本研究以雜交蘭原球莖和根狀莖為材料進行組培研究，以期實現(xiàn)雜交蘭的規(guī)?；敝?。

原球莖增殖分化選擇培養(yǎng)基尤為重要，適宜濃度的激素配比對原球莖的增殖分化影響較大。吳彥秋等（2016）以杜鵑蘭原球莖為材料，對比在1/2MS、MS、VW、KC培養(yǎng)基上的不同生長情況，1/2MS培養(yǎng)基的增殖率及長勢顯著高于其他處理。孫芳等（2012）和孫玉芬等（2014）研究也顯示蘭屬植物組培以1/2MS效果較適宜。聶菁等（2016）以蝴蝶蘭品種‘紅太陽’無菌播種形成的原球莖為材料，6-BA 5.0 mg·L-1、NAA 0.7 mg·L-1為最佳的類原球莖誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基濃度;本研究在激素和培養(yǎng)基選擇具有相同性，以1/2MS培養(yǎng)基中添加6-BA 1.0 mg·L-1、NAA 1.0 mg·L-1增殖分化效果最佳，添加NAA、6-BA有利于原球莖分化，這與相關(guān)研究（宋蓮等，2017;胡蕾和申婷，2017）一致， 說明不同品種的雜交蘭對激素的敏感性有差異。雜交蘭通過種子萌發(fā)獲得原球莖，進一步分化出根狀莖，根狀莖增殖速度較慢，故提高根狀莖的繁殖系數(shù)尤為關(guān)鍵。陳云喜等（2010）研究表明6-BA和NAA組合使用促進根狀莖增殖分化，說明原球莖和根狀莖增殖分化有其相似性。TDZ能刺激植株再生（Hutchinson & Saxena， 1996），但TDZ誘導(dǎo)芽變成完整植株存在問題，如生根困難、不利于芽的生長等（Huetteman & Preece， 1993）。在紅花草莓組培誘導(dǎo)過程中TDZ的誘導(dǎo)效果優(yōu)于6-BA，TDZ與NAA配合使用效果優(yōu)于與IBA的組合（金美芳等，2017）。在蝴蝶蘭的不定芽誘導(dǎo)中，單獨添加TDZ或6-BA芽誘導(dǎo)率顯著高于NAA與TDZ或6-BA的組合（程強強等，2011）。TDZ在雜交蘭根狀莖的增殖分化方面的研究尚未報道，因此本實驗使用TDZ和NAA促進根狀莖增殖，結(jié)果表明TDZ濃度2.0 mg·L-1和NAA0.1 mg·L-1組合使用時根狀莖增殖的最佳效果，這與程強強等（2011）的研究有所差異，可能受植株本身激素的影響，在增殖培養(yǎng)中所需NAA濃度較低，激素濃度使用有所不同，使用新型激素TDZ和NAA組合促進根狀莖增殖。組培苗長勢決定了其后期擴繁和移栽的難易程度，許申平等（2018）以墨蘭根狀莖分化出苗，培養(yǎng)基MS+25 g·L-1糖+7.5 g·L-1瓊脂+2 g·L-1活性炭，墨蘭的生根效果最好，6-BA和NAA濃度增加幼苗生根率下降，本研究與之相較差異較大，這可能由雜交蘭的特異性決定，不同雜交蘭遺傳特性的差異導(dǎo)致在生根階段所需激素種類不一，同種激素不同濃度的生根情況有較大區(qū)別，激素選擇上，IBA、NAA組合比6-BA、NAA組合生根率要好，生根培養(yǎng)基選擇1/2MS，IBA 0.5 mg·L-1和NAA 0.3 mg·L-1組合可以促進植株生根，葉色濃綠，根數(shù)較多而粗，生根效果最佳，與左利娟等（2015）的研究一致。有研究表明活性炭促進增殖分化、苗體生根、防止褐化，王玉英等（2015）在輻射誘變的線藝蘭快繁技術(shù)體系研究中加入了80 g·L-1香蕉泥;本研究在增殖分化、生根培養(yǎng)中均添加了香蕉泥和活性炭來促進苗體生長，減輕葉片褐化現(xiàn)象。

本研究結(jié)果表明，誘導(dǎo)篩選并建立了大花蕙蘭‘紅酒’×蓮瓣蘭‘邊草素花’雜交蘭的快繁技術(shù)體系，研究結(jié)果表明：最適宜原球莖增殖的培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+AC 0.05%+香蕉80 g·L-1;原球莖分化最佳培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1 +AC 0.05%+香蕉80 g·L-1;1/2MS+TDZ 2.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+AC 0.05%+香蕉80 g·L-1對根狀莖增殖分化效果最佳;1/2MS+IBA 0.5 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+AC 0.05%+香蕉80 g·L-1為最佳生根培養(yǎng)基，此體系的建立為種苗生產(chǎn)提供了技術(shù)支持。

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