薛曉夢 李建國 白冬梅 晏立英 萬麗云 康彥平 淮東欣,* 雷 永 廖伯壽,*

花生基因家族表達(dá)分析及其對低溫脅迫的響應(yīng)

薛曉夢1李建國1白冬梅2晏立英1萬麗云1康彥平1淮東欣1,*雷 永1廖伯壽1,*

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所/ 農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室, 湖北武漢 430062;2山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所, 山西汾陽 032200

為了探究在花生低溫響應(yīng)中的作用, 本研究從普通油酸花生中花16 (ZH16)和高油酸花生中花413 (ZH413)中克隆得到花生家族的全部基因, 共7個。通過分析這些基因的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn), 在ZH16和ZH413中各基因表達(dá)模式相似,主要在花和發(fā)育的種子中表達(dá),主要在營養(yǎng)組織中表達(dá),主要在根和花中表達(dá), 表明基因在花生不同發(fā)育階段和不同組織中發(fā)揮各自的生物學(xué)功能。在15℃下發(fā)芽6 d發(fā)現(xiàn), ZH413的發(fā)芽率未顯著下降, 而ZH16的發(fā)芽率顯著下降。種子萌發(fā)過程中,和均受低溫誘導(dǎo)表達(dá)。在ZH16中在低溫誘導(dǎo)第6天開始顯著上調(diào)表達(dá), 而在ZH413中第1天顯著上調(diào)表達(dá); 在ZH16中在低溫誘導(dǎo)第3天出現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá), 之后表達(dá)量下降, 但在ZH413中第1天就顯著上調(diào)表達(dá), 且始終維持在高水平表達(dá)?；谝陨涎芯拷Y(jié)果推測, 高油酸花生在受到低溫脅迫時,編碼蛋白失活, 但的高量表達(dá)在一定程度上彌補(bǔ)了這部分功能。同時也說明功能的缺失并不是決定花生耐寒性的主要因素。本研究的開展為培育抗寒的高油酸花生品種奠定了理論基礎(chǔ), 為高油酸花生在高緯度、高海拔地區(qū)推廣提供了理論支持。

脂肪酸脫氫酶(FAD2); 基因克隆; 低溫脅迫; 基因表達(dá)

花生(L)是世界范圍內(nèi)主要的油料作物之一, 集中分布在熱帶、亞熱帶以及溫帶地區(qū)[1]。我國是主要的花生生產(chǎn)國, 目前種植面積達(dá)到近500萬公頃, 占全球的20%。我國花生總產(chǎn)的一半左右用于榨油, 是世界上最大的花生消費國[2-3]。

花生的脂肪酸組成對其營養(yǎng)價值、食用品質(zhì)、存儲和加工性能以及市場價值等方面起著決定性作用。油酸(C18:1)和亞油酸(C18:2)是花生脂肪酸的主要成分, 其總和約占80%, 高油酸花生中油酸含量達(dá)到75%以上[4]。油酸能選擇性地降低人體血液中有害的低密度膽固醇, 而保持有益的高密度膽固醇, 可有效預(yù)防心血管疾病的發(fā)生, 而且高油酸花生抗氧化能力強(qiáng)、貨架期長, 因此受到廣大消費者和花生加工企業(yè)的青睞。

在高油酸花生推廣的過程中發(fā)現(xiàn), 高油酸品種在低溫條件下出苗率低, 特別在東北地區(qū)播種遭遇低溫時常爛種, 高油酸品種表現(xiàn)不耐低溫[5]?；ㄉ哂退嵝誀钍怯?對Δ12脂肪酸脫氫酶(,)基因隱性突變導(dǎo)致的[6]。已有研究報道, 擬南芥()突變體植株在低溫條件下生長緩慢, 植株矮小, 耐低溫能力顯著低于野生型擬南芥[7-8]。酵母()的基因在低溫處理2 h后轉(zhuǎn)錄水平上調(diào), 之后其表達(dá)量回復(fù)到日常水平[9]。棉花()的和在低溫處理下表達(dá)量顯著提高, 而和的表達(dá)不受溫度影響[10]?；ㄉ哂卸鄠€家族基因, 它們在不同組織中的表達(dá)量不盡相同[11]。對于花生中的家族基因與花生耐寒性的關(guān)系鮮有報道。研究花生基因在低溫脅迫條件下的響應(yīng)水平, 對解析高油酸花生的耐寒性具有重要意義。

本研究從栽培種花生中克隆得到7個基因, 并通過熒光定量PCR (qRT-PCR)探究其在高油酸花生(ZH413)和普通油酸花生(ZH16)各組織器官中的表達(dá)模式, 通過比較ZH413和ZH16在低溫脅迫條件下的發(fā)芽率、各基因在低溫下的表達(dá)模式來分析花生基因與其耐低溫能力的相關(guān)性, 將為解析和改良高油酸花生的耐寒性提供理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

普通油酸花生中花16 (ZH16)油酸含量為54.3%, 高油酸花生中花413 (ZH413)油酸含量為78.8%, 均為珍珠豆型花生。種植試驗在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所試驗基地(武昌)進(jìn)行, 于2017年5月初播種, 8月底收獲。

1.2 試劑與測序分析

大腸桿菌感受態(tài)10、pEASY-Blunt Cloning Kit、聚合酶、RNA抽提試劑盒均購自全式金生物科技有限公司; SYBR熒光PCR染料、反轉(zhuǎn)錄試劑盒等均購自諾唯贊生物科技有限公司; PCR引物的合成和測序由武漢擎科生物科技有限公司協(xié)助完成。

1.3 總RNA的提取及cDNA的合成

花生播種后6 d, 分別收集ZH16和ZH413的胚根、胚軸、子葉和真葉; 60 d后分別收集ZH16和ZH413的根、莖、新葉、老葉、花以及未入土的果針; 100 d后分別收集ZH16和ZH413發(fā)育的種子, 并根據(jù)其種子形態(tài)劃分為5個時期。將所有收集到的樣品液氮速凍后, 存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

取100 mg左右的樣品置液氮冷卻的研缽中, 加入液氮迅速研磨成粉, 按照RNA提取試劑盒的方法提取總RNA。通過分光光度計和1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總RNA質(zhì)量, 取1 μg的DNA-free RNA根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的方法和將其反轉(zhuǎn)為cDNA。

1.4 FAD2家族基因的克隆和測序分析

利用已知的花生基因(KF741365和KF741366)編碼的氨基酸序列, 在花生基因組信息(http://www.peanutbase. org/)中進(jìn)行blast分析, 得到花生中所有基因序列信息, 并根據(jù)核苷酸序列設(shè)計引物(表1)。分別以ZH16和ZH413發(fā)育種子的cDNA為模板, 克隆得到所有基因, 送公司測序。利用Copmuter PI/MW (https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測FAD2蛋白質(zhì)的等電點及相對分子質(zhì)量。

表1 克隆AhFAD2基因使用的引物及其序列

1.5 FAD2家族基因的表達(dá)模式分析

通過在線工具Integrated DNA Technologies (http://sg. idtdna.com/scitools/Applications/RealtimePCR/)設(shè)計基因的熒光定量PCR引物(表2)。

以ZH16和ZH413不同生長時期各組織的cDNA為模板, 按照TaKaRa熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex說明書進(jìn)行PCR, 反應(yīng)體系為20 μL, 包含SYBR Premix Ex(2×) 10 μL、引物(F/R)各0.5 μL、cDNA模板1 μL、ddH2O 8 μL。反應(yīng)程序為95℃變性3 min; 95℃變性30 s, 60℃退火15 s, 72℃延伸20 s, 測熒光值, 40個循環(huán); 最后計算溶解曲線以0.1℃ s-1的速度從60℃升至90℃。設(shè)每個反應(yīng)3個重復(fù), 利用2–DDCt法計算基因的相對表達(dá)量。利用Graph Pad Prism 5軟件和Microsoft Excel軟件處理和分析實驗數(shù)據(jù)。

1.6 低溫脅迫試驗

分別挑選50粒ZH16和ZH413的飽滿種子, 置培養(yǎng)皿中充分吸脹后, 分別置15℃和25℃培養(yǎng)箱中, 分別在1、3、6 d統(tǒng)計的發(fā)芽種子, 并選取5粒有代表性的種子提取其總RNA, 并反轉(zhuǎn)得到cDNA。以上試驗重復(fù)3次。

發(fā)芽率(%) = 發(fā)芽的種子數(shù)/參試種子總數(shù)×100

利用上述設(shè)計的家族基因熒光定量PCR引物,按照翊圣熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex說明書進(jìn)行qRT-PCR。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生AhFAD2家族基因的克隆

利用已知的花生基因(KF741365和KF741366)編碼的氨基酸序列, 在花生基因組信息網(wǎng)站(https://www. pea-n-ut--base.org/)中進(jìn)行blast分析, 共得到7個基因。分別以ZH16和ZH413發(fā)育種子的cDNA為模板, 克隆測序得到這些基因ORF的序列信息, 并根據(jù)它們在花生基因組中的位置和同源性分別命名為、、、、、和(表3),為1對同源基因, 分別位于A09和B09染色體上, 均編碼379個氨基酸, 相對分子質(zhì)量為43.65 kDa, pI為8.9;中第451位的G突變?yōu)門, 形成終止密碼子, 導(dǎo)致翻譯提前終止;為1對同源基因, 分別位于A06和B06染色體上, 分別編碼349個和383個氨基酸, 相對分子質(zhì)量分別為39.7 kDa和43.8 kDa, PI分別為8.85和8.80;一對同源基因, 分別位于A09和B09染色體上, 均編碼387個氨基酸, 相對分子質(zhì)量為45.0 kDa, pI分別為8.94和9.04。

表2 Real time PCR引物及其堿基序列

表3 花生FAD2家族基因信息

2.2 花生AhFAD2基因的表達(dá)分析

利用熒光定量PCR分析各基因在高油酸花生ZH413和普通油酸ZH16的15個組織中的表達(dá)模式(圖1)表明,主要在花生發(fā)育種子中表達(dá),在ZH16的花中也高量表達(dá), 但該基因在ZH413中表達(dá)量較低。在種子發(fā)育的各個時期, ZH16中表達(dá)量均高于ZH413。的表達(dá)模式與類似, 雖然在花生的各組織均有表達(dá), 但表達(dá)量都很低。在花生的各組織均有表達(dá),但主要在葉片和莖中表達(dá), 而在種子中的表達(dá)量相對較低。在ZH16幼嫩葉片和果針中的表達(dá)量比在ZH413中高, 而在ZH413花和發(fā)育早期的種子中的表達(dá)量比在ZH16中高。主要在根和花中高量表達(dá), 在花中的表達(dá)量最高, 是根中表達(dá)量的1000倍左右。在ZH16和ZH413各組織中的表達(dá)量沒有顯著差異。通過比較、和在花生種子發(fā)育各時期的表達(dá)量發(fā)現(xiàn),在ZH16和ZH413的種子發(fā)育中后期表達(dá)量最高。在ZH16和ZH413種子發(fā)育各時期均有表達(dá), 且在ZH413的種子發(fā)育初期表達(dá)量最高。而在ZH16和ZH413種子發(fā)育各時期表達(dá)量都很低。以上結(jié)果表明, 花生各基因的表達(dá)模式不盡相同, 其可能在不同發(fā)育階段、不同組織中發(fā)揮作用, 例如是花生種子中決定油酸含量的關(guān)鍵基因, 而在營養(yǎng)組織中的表達(dá)量較高, 可能是調(diào)控花生營養(yǎng)組織中不飽和脂肪酸含量的主要基因。

(圖1)

A: 本研究中涉及到的15個花生組織。I: 播種6 d后的胚根; II: 播種6 d后的胚軸; III: 播種6 d后的子葉; IV: 播種6 d后的真葉; V: 播種60 d后的根; VI: 播種60 d后的果針; VII: 播種60 d后的莖; VIII: 播種60 d后的幼嫩葉片; IX: 播種60 d后的成熟葉片; X: 播種60 d后的花; XI: 白色、扁平的發(fā)育中的種子; XII: 白色、水滴形的發(fā)育中的種子; XIII: 白色、魚雷形的發(fā)育中的種子; XIV: 淺粉色、圓形的發(fā)育中的種子; XV: 深粉色、成熟的種子。B:基因在15個花生組織中的表達(dá)水平。白色表示普通油酸材料ZH16; 灰色表示高油酸材料ZH413。經(jīng)單因素方差分析差異達(dá)到顯著水平。*< 0.05; **< 0.01; ***< 0.001。C:基因在花生發(fā)育種子中的表達(dá)分析。標(biāo)有不同小寫字母的柱值表示經(jīng)單因素方差分析和最小顯著差異法(LSD)檢驗差異達(dá)到顯著水平(< 0.05)。

A: 15 peanut tissues involved in this study. I: radicle after 6 days of sowing; II: hypocotyl after 6 days of sowing; III: cotyledon after 6 days of sowing; IV: true leaves after 6 days of sowing; V: root after 60 days of sowing; VI: peg after 60 days of sowing; VII: stem after 60 days of sowing; VIII: yong leaves after 60 days of sowing; IX: mature leaves after 60 days of sowing; X: flowers after 60 days of sowing; XI: white and flat developing seeds; XII: white and drop-shaped developing seeds; XIII: white and torpedo-shaped developing seeds; XIV: light pink and round developing seeds; XV: dark pink and mature seeds. B: expression analysis ofgenes in 15 tissues of peanut. The white column indicates normal oleate peanut ZH16, the gray column indicates high oleate peanut ZH413. Differences reached a significant level by one-way analysis of variance. *< 0.05, **< 0.01, ***< 0.001. C: expression analysis ofgenes in developing seeds. Bars superscripted by different lowercase letters are significantly different at< 0.05 by one-way ANOVA and least significant difference (LSD) test.

2.3 低溫處理對ZH16和ZH413發(fā)芽率的影響

在25℃和15℃溫度處理下, 分別統(tǒng)計ZH16和ZH413種子的發(fā)芽率(表4)。25℃條件下, 種子浸泡24 h后即可露白; 而在15℃條件下, 種子的萌發(fā)時間顯著延長, 種子在3 d后開始露白。在25℃條件下, ZH16的種子發(fā)芽率為91.33%, ZH413的種子發(fā)芽率為94.66%, 差異不顯著; 而在15℃條件下, ZH16的種子發(fā)芽率為45.00%, ZH413的種子發(fā)芽率為98.67%, ZH16的發(fā)芽率顯著低于ZH413 (表4和圖2)。以上結(jié)果表明, 雖然低溫均延長了ZH16和ZH413的萌發(fā)時間, 但是ZH413在低溫處理6 d后發(fā)芽率仍然達(dá)到90%以上, 而ZH16在低溫處理下發(fā)芽率顯著降低。因此, 高油酸花生的耐寒性并不一定比普通油酸花生差。

2.4 低溫脅迫對AhFAD2基因在高油酸和普通油酸花生中表達(dá)模式的影響

為了調(diào)查基因在低溫脅迫條件下是否參與了花生的低溫響應(yīng)過程, 利用熒光定量PCR分析了不同溫度處理下普通油酸花生ZH16和高油酸花生ZH413萌發(fā)種子中各基因的表達(dá)模式(圖3)。研究發(fā)現(xiàn), 在25℃條件下, ZH16和ZH413中隨著處理時間的延長, 其表達(dá)量逐漸增加(圖3-a, d)。而在15℃條件下, ZH16中前3 d的表達(dá)量與25℃處理條件下的表達(dá)量差異不顯著; 在處理第6天,在15℃條件下的表達(dá)量比在25℃條件下的表達(dá)量顯著提高(圖3-a)。處理第1天, ZH413中在15℃條件下的表達(dá)量比在25℃條件下的表達(dá)量顯著上調(diào)20倍以上, 但在第3天后其表達(dá)量顯著下調(diào), 比在25℃條件下的表達(dá)量顯著下調(diào)10倍以上(圖3-d), 表明是受低溫誘導(dǎo)表達(dá)的基因, 在ZH16中響應(yīng)較慢, 但在ZH413中響應(yīng)非常快。

表4 不同溫度處理條件下普通油酸花生ZH16和高油酸花生ZH413的種子發(fā)芽率

標(biāo)以不同小寫字母的值表示經(jīng)單因素方差分析和最小顯著差異法(LSD)檢驗差異達(dá)到顯著水平(< 0.05)。

Values followed by different lowercase letters are significantly different at< 0.05 are determined by one-way ANOVA and least significant difference (LSD) test.

圖2 不同溫度處理下普通油酸花生ZH16和高油酸花生ZH413的種子發(fā)芽情況

圖3 在不同溫度處理下各AhFAD2基因在ZH16和ZH413中的表達(dá)分析

a: 在不同溫度處理下,在ZH16中的表達(dá)模式; b: 在不同溫度處理下,在ZH16中的表達(dá)模式; c: 在不同溫度處理下,在ZH16中的表達(dá)模式; d: 在不同溫度處理下,在ZH413中的表達(dá)模式; e: 在不同溫度處理下,在ZH413中的表達(dá)模式; f: 在不同溫度處理下,在ZH413中的表達(dá)模式。經(jīng)單因素方差分析差異達(dá)到顯著水平, *< 0.05; **< 0.01; ***< 0.001。

a: expression pattern ofin ZH16 under different temperature treatment conditions; b: expression pattern ofin ZH16 under different temperature treatment conditions; c: expression pattern ofin ZH16 under different temperature treatment conditions; d: expression pattern ofin ZH413 under different temperature treatment conditions; e: expression pattern ofin ZH413 under different temperature treatment conditions; f: expression pattern ofin ZH413 under different temperature treatment conditions. Significant differences are determined by one-way analysis of variance. *< 0.05, **< 0.01, ***< 0.001.

在25℃條件下, ZH16和ZH413中表達(dá)量均隨著時間的延長而逐漸減少(圖3-b, e)。在15℃條件下, ZH16中的表達(dá)量顯著下調(diào), 且始終比其在25℃條件下的表達(dá)量低(圖3-b); 而ZH413中的表達(dá)量與其在25℃條件下的表達(dá)量差異不顯著(圖3-e)。

在25℃條件下, ZH16中不同時間點的表達(dá)量變化不顯著(圖3-c); 而ZH413中在6 d后表達(dá)量顯著上調(diào)(圖3-f)。在15℃條件下, ZH16中的表達(dá)量第3天出現(xiàn)顯著上調(diào), 在第6天時又顯著下調(diào)(圖3-c); 而ZH413中的表達(dá)量從第1天就顯著上調(diào), 且在處理的6 d中表達(dá)量一直維持在高水平, 雖然呈現(xiàn)下降趨勢, 但始終比其在25℃條件下的表達(dá)量高20倍以上(圖3-f)。以上結(jié)果表明,受低溫誘導(dǎo)表達(dá), 在ZH16中其表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢, 而在ZH413中始終維持在高水平表達(dá), 呈微弱下降趨勢。

綜合以上結(jié)果得出, 在低溫脅迫種子萌發(fā)過程中,和均受低溫誘導(dǎo)表達(dá), 而在高油酸材料中和的響應(yīng)速度都比在普通油酸材料中快, 表達(dá)量上調(diào)的倍數(shù)也比在普通油酸材料中多, 特別是基因在高油酸材料受到低溫脅迫時始終維持在高水平表達(dá), 推測其高水平的表達(dá)部分彌補(bǔ)了突變的的功能。

3 討論

花生屬于溫帶和亞熱帶作物, 整個生育期需要足夠的光照強(qiáng)度和合適的溫度條件, 溫度是限制花生種植分布的重要因素。低溫會造成花生爛種增多、發(fā)芽率降低、出苗遲緩, 致使基本苗減少, 生育期延長, 最終導(dǎo)致減產(chǎn)。已有研究表明, 細(xì)胞中多不飽和脂肪酸的含量與植物的抗寒能力具有一定相關(guān)性, 多不飽和脂肪酸含量越高, 抗寒性越強(qiáng)[12-16]。脂肪酸脫氫酶是生物體內(nèi)調(diào)控不飽和脂肪酸合成的關(guān)鍵酶, 細(xì)胞中脂肪酸脫氫酶的種類和數(shù)量是決定植物抗寒性的重要因素[17-19]。本研究系統(tǒng)分析了花生FAD2家族全部基因, 并調(diào)查了這些基因在花生15個組織中的表達(dá)模式, 以及它們在受到低溫脅迫時表達(dá)模式的變化。

基因是一個含有多個成員的基因家族, 甘藍(lán)型油菜中含有4個基因[20], 紅花()中含有11個基因[21]。本研究從栽培種花生中共克隆到7個基因, 其中6個成對出現(xiàn), 分布在A、B亞基因組的相應(yīng)位置, 僅基因沒有找到A亞基因組相對應(yīng)的拷貝?；虻牡?51位堿基G突變?yōu)門, 形成終止密碼子, 導(dǎo)致翻譯提前終止, 翻譯的蛋白不具有功能。阮建等[11]研究發(fā)現(xiàn)花生家族中含有6個基因, 與本研究結(jié)果基本一致, 但本研究克隆得到在A06染色體上的同源基因。

已有大量研究報道,和是與高油酸花生形成相關(guān)的基因[22-25], 通過表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn), 相較于其他基因,在發(fā)育種子中的表達(dá)量最高, 因此基因是花生種子中最重要的基因。這也解釋了為什么花生中存在6個有功能的基因, 僅和發(fā)生突變就可以使花生種子中油酸含量從40%提高到80%。

在花生發(fā)育種子中的表達(dá)量排第二, 但其在營養(yǎng)組織中的表達(dá)量更高。在花生發(fā)育種子中的表達(dá)量極低, 但是在根和花中的表達(dá)量很高。以上結(jié)果表明, 花生的基因具有表達(dá)的組織偏好性, 以此實現(xiàn)不同基因在花生生長發(fā)育過程中的分工。在其他植物中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象, 紅花中11個基因也具有表達(dá)的組織特異性,和主要在花和發(fā)育的種子中表達(dá),在各個組織中都表達(dá), 而和主要在根中特異表達(dá)[21]。

和均在受到低溫脅迫后上調(diào)表達(dá), 特別是在高油酸花生中,和的響應(yīng)速度和上調(diào)倍數(shù)均比在普通油酸材料中快且多。在其他植物中也發(fā)現(xiàn)基因受低溫誘導(dǎo)表達(dá)。橄欖中的在橄欖冷馴化的過程中參與冷脅迫響應(yīng), 轉(zhuǎn)錄活性提高, 提高種子中亞油酸含量, 促進(jìn)角質(zhì)的形成, 從而保護(hù)胚乳[26]。棉花中的和受到低溫脅迫后, 轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)[10]。唐桂英等[27]通過低溫處理花生幼苗葉片發(fā)現(xiàn),(對應(yīng)本研究中的)受低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。但本研究中在受到低溫脅迫后沒有表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄水平的變化, 可能由于處理的樣品是萌發(fā)種子, 也許它更多參與花生苗期或中后期的調(diào)控。大豆中在營養(yǎng)生長組織和發(fā)育的種子中均有表達(dá), 但在受到冷脅迫刺激時, 轉(zhuǎn)錄水平并無明顯差異[28]。

高油酸花生中基因發(fā)生突變, 引起種子中甘油三酯的脂肪酸組成變化, 即在大幅提高油酸含量的同時也大幅降低亞油酸的含量[29]。但是這種變化可能不局限于甘油三酯, 種子膜脂中亞油酸含量也有可能大幅降低[30-31]。而細(xì)胞膜中, 多不飽和脂肪酸(比如亞油酸、亞麻酸)含量越高, 越有利于細(xì)胞膜的流動性[32]。當(dāng)?shù)蜏孛{迫時, 細(xì)胞膜流動性下降, 黏度增加, 運(yùn)輸功能下降, 嚴(yán)重時細(xì)胞膜從常態(tài)的液晶相轉(zhuǎn)變?yōu)槟z相, 膜的結(jié)構(gòu)改變, 透性增大, 最終致細(xì)胞死亡[33]?；蛑饕诎l(fā)育的種子中表達(dá), 而在種子發(fā)育的過程中, 高油酸花生中合成的亞油酸總量可能比普通油酸花生中的總量少, 也有可能造成高油酸花生的細(xì)胞膜中亞油酸含量偏低, 即高油酸花生種子細(xì)胞膜流動性可能比普通油酸花生的差。因此, 當(dāng)高油酸花生和普通油酸花生在萌發(fā)時遭遇低溫脅迫, 有可能因為種子發(fā)育過程中造成的膜脂中亞油酸含量的差異, 從而影響萌發(fā)過程中的細(xì)胞膜流動性, 最終表現(xiàn)為發(fā)芽率的差異。本研究通過比較高油酸花生ZH413和普通油酸花生ZH16在低溫處理下的發(fā)芽率發(fā)現(xiàn), ZH413的發(fā)芽率并沒有顯著下降, 而ZH16發(fā)芽率顯著下降, 說明在影響花生耐寒性的諸多因素中,功能的缺失并不是決定其耐寒性的主要因素。主要在種子中表達(dá), 其功能的缺失并不會影響花生營養(yǎng)器官的生長發(fā)育, 而主要在營養(yǎng)器官中發(fā)揮作用, 高油酸花生中該基因并沒有發(fā)生突變, 理論上不會影響其營養(yǎng)器官的耐寒性。在萌發(fā)的種子中, 雖然高油酸花生中喪失了功能, 但在受到低溫脅迫時持續(xù)顯著上調(diào)表達(dá), 也部分彌補(bǔ)了缺失的功能, 及時合成亞油酸, 從而維持細(xì)胞膜的流動性, 保障了高油酸花生的耐寒性。因此, 高油酸花生的耐寒性是否一定比普通油酸花生差, 這一論斷仍然有待繼續(xù)深入研究。本研究結(jié)果為高油酸在高緯度、高海拔地區(qū)的普及提供了可能性, 通過篩選耐寒性較強(qiáng)的高油酸品種可以實現(xiàn)其在高緯度、高海拔地區(qū)的種植。

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Expression profiles ofgenes and their responses to cold stress in peanut

XUE Xiao-Meng1, LI Jian-Guo1, BAI Dong-Mei2, YAN Li-Ying1, WAN Li-Yun1, KANG Yan-Ping1, HUAI Dong-Xin1,*, LEI Yong1, and LIAO Bo-Shou1,*

1Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops, Ministry of Agriculture / Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430062, Hubei, China;2Industrial Crops Research Institute, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Fenyang 032200, Shanxi, China

To explore the roles ofin response to cold stress in peanut, we cloned sevengenes from normal oleate peanut ZH16 and high oleate peanut ZH413, respectively. The results of qRT-PCR showed that the expression patterns ofgenes were similar in ZH16 and ZH413.was highly expressed in flower and developing seed,was mainly expressed in leaf and stem, andwas expressed specifically in root and flower, indicating thatgenes played their respective roles in different developmental stages and tissues of peanut. At 6 days after inducing under 15℃, the germination rate of ZH16 was significantly decreased while that of ZH413 was not significantly affected. The expression of bothandwere induced by cold stress. The expression ofwas significantly up-regulated at 6 DAI in ZH16, while at 1 DAI in ZH413, suggesting thatwas induced by cold more quickly in high oleate peanut. Furthermore, the expression ofwas significantly up-regulated at 3 DAI in ZH16 and then decreased, while it was increased immediately and maintained at high level for six days in ZH413. Based on these results, we speculate thatup-regulation ofmay compensate the function ofthat is deactivated under cold stress in high oleate peanut, and the deactivation ofis not the most important factors affecting peanut cold tolerance. This study provides a theoretical basis in breeding of high oleate peanut with high tolerance to cold stress, and the theoretical support for extension of high oleate peanut in both high latitude and high altitude regions.

fatty acid desaturase 2 (FAD2); gene cloning; cold stress; expression profile

本研究由湖北省自然科學(xué)基金項目(2017CFB161), 國家自然科學(xué)基金項目(31671734, 31871662)和國家重點研發(fā)計劃項目(2018YFD1000901)資助。

This study was supported by the Hubei Provincial Natural Science Foundation of China (2017CFB161), the National Natural Science Foundation of China (31671734, 31871662), and the National Key R&D Program of China (2018YFD1000901).

淮東欣, E-mail: dxhuai@caas.cn; 廖伯壽, E-mail: lboshou@hotmail.com

E-mail: xiaomengxue1991@163.com

2018-12-27;

2019-05-12;

2019-06-13.

10.3724/SP.J.1006.2019.84177

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190612.0858.002.html