修媛娟 向翠英 邵振俊

摘 要 目的：對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)建立小鼠銀屑病模型進(jìn)行改良，建立銀屑病持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)、特征更典型的銀屑病動(dòng)物模型。方法：將小鼠隨機(jī)分為正常組（涂抹凡士林）、模型組[涂抹咪喹莫特乳膏60 mg/（2×3 cm2·d）]和改良組[涂抹咪喹莫特乳膏60 mg/（2×3 cm2·d）+皮下注射重組小鼠白細(xì)胞介素12（rmIL-12）和脂多糖（每周1次）]，連續(xù)21 d，每組10只。從造模第1天起每日觀察小鼠造模部位皮膚，對(duì)類似銀屑病樣皮損的紅斑、鱗屑、增厚等癥狀進(jìn)行銀屑病面積與嚴(yán)重性指數(shù)（PASI）評(píng)分；造模21 d后處死小鼠，取皮損部位進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，計(jì)算脾指數(shù)，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)皮膚中IL-17A、 IL-12的含量。結(jié)果：自給藥第3、2天起，模型組和改良組小鼠皮膚分別出現(xiàn)紅斑、鱗屑、增厚等類似銀屑病樣皮損，均在第12天PASI總分達(dá)到峰值；改良組從第11天起，小鼠皮膚紅斑、鱗屑、厚度較模型組更明顯，且連續(xù)9 d PASI總評(píng)分顯著高于模型組（P<0.05）；皮膚組織病理學(xué)觀察到模型組和改良組小鼠均出現(xiàn)Munro 微膿腫、棘層肥厚及真皮層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組比較，改良組小鼠脾指數(shù)更高（P<0.05）；與正常組比較，模型組和改良組小鼠皮膚中IL-17A、IL-12含量均升高，且改良組升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：建立的改良模型銀屑病典型特征維持時(shí)間更長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞 銀屑病模型；咪喹莫特；小鼠；銀屑病面積與嚴(yán)重性指數(shù)評(píng)分；白細(xì)胞介素12；白細(xì)胞介素17A

Establishment of Modified Model of Psoriasis Mice

XIU Yuanjuan，XIANG Cuiying，SHAO Zhenjun（Dept. of Research&Development， Huapont Pharm Co.， Ltd.， Chongqing 401121， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish psoriasis animal model with a longer duration and more typical psoriatic characteristics by modifying psoriasis model induced by imiquimod. METHODS： Mice were randomly divided into normal group （treated with vaseline）， model group [treated with Imiquimod cream 60 mg/（2×3 cm2·d）] and modified group [treated with Imiquimod cream 60 mg/（2×3 cm2·d）+subcutaneous injection of rmIL-12 and LPS once a week]， for consecutive 21 d， with 10 mice in each group. The skin of the model site was observed daily from the first day of modeling. Psoriasis area and severity index （PASI） score was conducted for skin lesions such as erythema， scales and thickening. 21 d after modeling， mice were sacrificed， and histopathological examination of the skin lesions was performed. The spleen index was calculated， and the contents of IL-17A and IL-12 in the skin were detected by ELISA. RESULTS： From the third and second day of medication， erythema， scales and thickening were both observed in model group and modified group respectively. The PASI score reached peak on the 12th day. From the 11th day， erythema， scales and thickening of the modified group were more serious than that in model group. PASI scores of modified group was significantly higher than that of model group for 9 consecutive days （P<0.05）. Histopathological observation showed that Munro microabscess， acanthosis and dermal inflammatory cell infiltration occurred in both model group and modified group. Compared with model group， spleen indexes of modified group were higher （P<0.05）. Compared with normal group， the contents of IL-17A and IL-12 in mice skin of model group and modified group were both increased， and there was statistical significance in modified group （P<0.05）. CONCLUSIONS： The estbalished modified model has the longer duration of typical characteristics of psoriasis.

KEYWORDS Psoriasis model； Imiquimod； Mice； Psoriasis area and severity index score； IL-12； IL-17A

銀屑病是一種常見并易復(fù)發(fā)的慢性炎癥性皮膚病，典型的臨床表現(xiàn)為皮損處紅色丘疹或斑塊，上覆厚層鱗屑，病理特征以皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞角化不全、角化過度、異常增生、血管形成和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為主，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，目前的治療措施雖然有效，但并不能達(dá)到長(zhǎng)期緩解的目的[1-2]。因此，銀屑病是當(dāng)前皮膚科領(lǐng)域內(nèi)重點(diǎn)研究的疾病之一，用于治療銀屑病的藥物是當(dāng)前新藥開發(fā)的熱點(diǎn)。銀屑病動(dòng)物模型是用于評(píng)價(jià)藥物療效的重要工具。目前用于研究銀屑病的模型有咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型、鼠尾鱗片模型、雌鼠陰道上皮模型、基因工程小鼠模型和異體移植模型等[3]，雖然模型眾多，但各有優(yōu)缺點(diǎn)，目前并無可同時(shí)用于銀屑病發(fā)病機(jī)制、藥物療效和作用機(jī)制評(píng)價(jià)的理想的動(dòng)物模型。咪喹莫特的臨床不良反應(yīng)之一為誘導(dǎo)銀屑病發(fā)作[4-5]，利用咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型操作簡(jiǎn)單、易于實(shí)現(xiàn)，且皮膚表型、病理特征具有組織間復(fù)雜相互作用并與臨床銀屑病類似的優(yōu)點(diǎn)[6]，因此目前研究較多[7-9]，并普遍應(yīng)用于藥物療效評(píng)價(jià)中；但該模型產(chǎn)生的炎癥持續(xù)時(shí)間較短，一般在1周左右達(dá)到皮損高峰后逐漸減輕，與人類銀屑病多數(shù)表現(xiàn)為遷延反復(fù)甚至終生不愈的慢性病程不相符[2，10]，癥狀的快速消退不利于藥物療效的評(píng)價(jià)，因此有必要進(jìn)行改良使之達(dá)到較為穩(wěn)定的狀態(tài)。由于活化的T細(xì)胞、樹突細(xì)胞和固有免疫系統(tǒng)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可驅(qū)動(dòng)銀屑病的發(fā)病[11]，因此本實(shí)驗(yàn)擬在給予咪喹莫特乳膏涂抹之后，加用細(xì)胞因子白細(xì)胞介素12（IL-12）刺激小鼠免疫系統(tǒng)，以延長(zhǎng)皮損持續(xù)時(shí)間，使銀屑病的特征更典型，以更好地用于銀屑病治療藥物的療效評(píng)價(jià)。

1 材料

1.1 儀器

ASP300自動(dòng)脫水機(jī)、RM2215RTS石蠟切片機(jī)、EG1150 HC石蠟包埋機(jī)（德國(guó)Leica Biosystems Inc.）；BX41顯微鏡（日本Olympus公司）；Rayto RT-6100酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）。

1.2 藥品與試劑

咪喹莫特乳膏（四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：18030140，規(guī)格：3 g）；醫(yī)用凡士林（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20151210）；IL-12注射液（使用產(chǎn)品為重組小鼠白介素-12 p70 ，rmIL-12 p70，BD Pharmingen Inc，批號(hào)：6278771，規(guī)格：5 μg）；脂多糖（LPS）凍干粉（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：045M4087V，規(guī)格：10 mg）；IL-17A、IL-12酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）試劑盒（上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司，批號(hào)：JL20171、JL20166）。

1.3 動(dòng)物

BALB/c小鼠，SPF級(jí)，♀♂各半，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，30只，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：11401500037928。小鼠飼養(yǎng)期間自由攝食飲水，控制環(huán)境溫度為18～24 ℃、相對(duì)濕度為40%～ 70%，明暗交替12 h。

2 方法

2.1 分組

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后分為3組：正常組、模型組、改良組，每組10只。

2.2 模型建立

小鼠背部脫毛后，正常組每日在小鼠背部涂抹凡士林；模型組每日在小鼠背部涂抹咪喹莫特乳膏，60 mg/（2×3 cm2·d）；改良組在小鼠背部涂抹咪喹莫特乳膏的第1天起，每周1次皮下注射rmIL-12 10 ng（5 μL）和LPS 20 μg（5 μL）[12]。小鼠持續(xù)造模21 d。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1 皮損評(píng)分 參考臨床銀屑病面積與嚴(yán)重性指數(shù)（PASI）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[13]，造模第1天開始，每日對(duì)皮損處紅斑、鱗屑、厚度按0～4評(píng)分，并將3項(xiàng)得分相加得到總分。PASI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[14]：（1）紅斑。0分為無紅斑，1分為紅斑呈淡紅色，2分為紅斑呈紅色，3分為紅斑呈深紅色，4分為紅斑極深；（2）鱗屑。0分為表面無鱗屑，1分為部分皮損表面上覆有鱗屑，2分為大多數(shù)皮損表面覆蓋有鱗屑，3分為皮損部位幾乎全部被鱗屑覆蓋，鱗屑呈層，4分為皮損部位全部被鱗屑覆蓋；（3）厚度。0分為皮損與正常皮膚齊平，1分為皮損較正常皮膚表面稍高，2分為皮損中等度隆起，3分為皮損肥厚，隆起明顯，4分為皮損高度肥厚，明顯凸起。對(duì)各組總分取平均值繪制曲線。

2.3.2 皮損組織病理學(xué)觀察 于造模給藥第22天處死小鼠，并剪取背部部分皮損固定于10%甲醛緩沖液中，標(biāo)本脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色。顯微鏡下觀察組織病理形態(tài)并照相。

2.3.3 脾指數(shù) 于造模給藥第22天小鼠稱體質(zhì)量后處死并取脾稱質(zhì)量，按以下公式計(jì)算脾指數(shù)：脾指數(shù)=脾質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）。

2.3.4 皮膚中細(xì)胞因子含量測(cè)定 于造模給藥第22天處死小鼠，取0.1 g背部皮損皮膚加入1 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS）后勻漿，以3 000 r/min離心20 min，取上清液檢測(cè)IL-17A、IL-12含量。具體操作步驟嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 16.0（SPSS Inc.）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以x±s表示，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。當(dāng)P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠皮損評(píng)分

與正常組比較，模型組和改良組小鼠分別從造模第3天和造模第2天開始陸續(xù)出現(xiàn)紅斑和鱗屑，皮膚增厚均在第7天觀察到；模型組小鼠紅斑PASI評(píng)分在第5天接近峰值，持續(xù)至第12天后開始下降；鱗屑PASI評(píng)分在第7天接近峰值，持續(xù)至第9天后開始下降，皮膚厚度在第11天PASI評(píng)分達(dá)峰后下降；改良組各觀察指標(biāo)在前期與模型組表現(xiàn)相似，中期表現(xiàn)更為明顯，后期下降更緩慢。根據(jù)PASI總分，模型組和改良組均在造模第12天達(dá)到PASI總分峰值，造模第1～10天，模型組和改良組的PASI總分均數(shù)無明顯差異（P>0.05），但從第11天起，連續(xù)9 d改良組PASI總分高于模型組（P<0.05）。各組小鼠造模第13天時(shí)背部皮損肉眼觀察結(jié)果見圖1，不同時(shí)間點(diǎn)背部皮損 PASI評(píng)分結(jié)果圖2（注：正常組有2份標(biāo)本在實(shí)驗(yàn)中遺失，故n=8）。

3.2 小鼠皮膚組織病理

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，正常組小鼠表皮層較薄，僅見1～2 層形態(tài)正常的細(xì)胞；模型組和改良組小鼠均出現(xiàn)表皮明顯增厚，部分位置的Munro微膿腫，棘層細(xì)胞數(shù)量增加，真皮層有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，與人類銀屑病皮損病理改變[1-2]基本相同。各組小鼠皮損的組織病理圖見圖3。

3.3 脾指數(shù)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與正常組比較，模型組與改良組小鼠脾指數(shù)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，改良組小鼠脾指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳見表1。

3.4 小鼠皮膚中細(xì)胞因子的含量

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與正常組比較，模型組和改良組小鼠皮膚中IL-17A和IL-12的含量均升高，但僅改良組的升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳見圖4。

4 討論

近年來的研究認(rèn)為，銀屑病的發(fā)病與IL-23/T hellper cell（Th）17軸和Th1/Th2平衡有關(guān)，且細(xì)胞因子[IL-17、IL-12、IL-1、腫瘤壞死因子（TNF）-α等]之間的相互作用可以解釋銀屑病的大多數(shù)臨床特征，如角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖、新生血管和炎癥的增加[11]。咪喹莫特可激活真皮樹突細(xì)胞分泌產(chǎn)生IL-23，后者與Th17細(xì)胞上的IL-23受體結(jié)合，激活信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3（STAT3）分子引起IL-17A表達(dá)上調(diào)，激活角質(zhì)細(xì)胞上的IL-17A和IL-17R同源二聚體而誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）信號(hào)活化產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[15]。IL-17A是驅(qū)動(dòng)銀屑病發(fā)病的已知的6種IL-17亞型中最重要的一種，是活化的記憶性T細(xì)胞的產(chǎn)物，可刺激角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生抗菌肽、促炎癥細(xì)胞因子及趨化因子，利于樹突細(xì)胞和T細(xì)胞在皮膚募集[16-18]。目前已研發(fā)出多種IL-17A拮抗藥，如蘇金單抗、Ixekizumab，已用于治療中、重度斑塊型銀屑病[19]。樹突細(xì)胞生成的IL-12與T細(xì)胞上的IL-12受體結(jié)合后能促進(jìn)分化的CD4+的Th1增殖，導(dǎo)致Th1/Th2平衡紊亂，引起銀屑病的發(fā)生[20-21]。有研究表明，銀屑病患者體內(nèi)的IL-12水平顯著高于健康人IL-12的水平[22]。LPS可直接刺激TNF-α、IL-6，并在較小程度上刺激小鼠皮膚來源的樹突細(xì)胞產(chǎn)生IL-12，可能涉及自身反應(yīng)性T細(xì)胞的促炎狀態(tài)[12]。鑒于咪喹莫特與IL-12各自對(duì)IL-23/Th17軸和Th1/Th2平衡的影響，采用咪喹莫特聯(lián)合IL-12及LPS，既能刺激小鼠的IL-23/Th17軸，又能影響Th1/Th2平衡，更符合銀屑病復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，達(dá)到改良模型的目的。

本研究希望通過改進(jìn)咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病動(dòng)物模型，達(dá)到模型更持久、特征更典型的目的，從而有利于銀屑病治療藥物的療效評(píng)價(jià)。目前臨床上銀屑病嚴(yán)重程度指標(biāo)主要為PASI評(píng)分[23-24]，銀屑病動(dòng)物模型多用PASI評(píng)分結(jié)合病理作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，因此肉眼觀察結(jié)果和PASI評(píng)分為模型建立的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)。目前許多文獻(xiàn)[7-9]已開展了咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病模型機(jī)制的研究，本研究在機(jī)制方面僅選擇了有代表性的、與造模劑相關(guān)的指標(biāo)。IL-17A和IL-12分別為IL-23/Th17軸和Th1/Th2平衡這兩條銀屑病致病途徑中的重要細(xì)胞因子，且目前也有許多靶向這兩種細(xì)胞因子的生物制劑用于治療銀屑病[25]。鑒于細(xì)胞因子水平的改變可間接反映皮損的變化趨勢(shì)，因此本實(shí)驗(yàn)僅選擇IL-17A和IL-12這兩個(gè)細(xì)胞因子用于反映改良組的效果。

在已有的咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病常規(guī)模型中，皮損在5～8 d達(dá)到峰值后，皮損會(huì)逐漸消退[26-28]，皮損中的IL-17A mRNA的水平也呈先升高后明顯降低的動(dòng)態(tài)變化過程[29]。在本實(shí)驗(yàn)中，改良組BALB/c小鼠每日涂抹咪喹莫特乳膏后每周皮下注射IL-12和LPS，造模周期延長(zhǎng)至21 d，該操作方法目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中，銀屑病模型在達(dá)到皮損峰值后，模型組與改良組皮損均開始消退，但改良組小鼠皮損的消退較慢，皮損程度也較為嚴(yán)重。皮損的組織病理檢查仍可見典型的銀屑病樣改變。改良組小鼠脾指數(shù)明顯高于模型組，提示改良方法可引起小鼠免疫系統(tǒng)亢進(jìn)加重。模型組小鼠皮損中的IL-17A和IL-12的含量雖然較正常組稍高，但差異已無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但改良組小鼠的IL-17A和IL-12含量仍處于較高水平，較正常組差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究從肉眼觀察、PASI評(píng)分、臟器指數(shù)和細(xì)胞因子幾個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果均表明改良組造模效果優(yōu)于模型組。綜上所述，改良的小鼠銀屑病典型特征維持時(shí)間更長(zhǎng)，是一種效果較好的模型。

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（收稿日期：2018-11-20 修回日期：2019-01-04）

（編輯：劉 萍）