吳麗芳　魏曉梅

摘要：? 該研究以蔗糖、麥芽糖、山梨醇及PEG（6000）為滲透劑，探討了不同滲透劑對白刺花體細(xì)胞胚發(fā)育、胚成熟及萌發(fā)的影響。結(jié)果表明：白刺花下胚軸形成的胚性愈傷組織接種至MS + 2，4-D 0.2 mg·L-1 + NAA 1.0 mg·L-1 + 6-BA 2.0 mg·L-1 + TDZ 1.0 mg·L-1+蔗糖40 g·L-1+ 谷氨酰胺100 mg·L-1+植物凝膠3 g·L-1的培養(yǎng)基上，體細(xì)胞胚發(fā)生率高達(dá)66.21%，總胚數(shù)為79個;7%蔗糖可使體細(xì)胞胚成熟率高達(dá)64.36%，同時也可提高多子葉畸形胚形成;2%麥芽糖+2%山梨醇+4%蔗糖組合使體細(xì)胞胚成熟率最高達(dá)88.89%，畸形胚比例最低;30 g·L-1PEG培養(yǎng)時，體細(xì)胞成熟率最高，為82.35%;魚雷期的體細(xì)胞胚最合適轉(zhuǎn)接，可使體胚萌發(fā)率達(dá)90.58%，復(fù)合糖上培養(yǎng)得到的成熟體細(xì)胞胚生根率最高，為87.47%。這為實(shí)現(xiàn)白刺花體細(xì)胞胚育苗奠定了理論基礎(chǔ)，并提供了可行的方案。

關(guān)鍵詞： 白刺花， 滲透劑， 體細(xì)胞胚， 體細(xì)胞胚成熟， 體細(xì)胞胚萌發(fā)

中圖分類號：? Q943.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：? A文章編號：? 1000-3142（2019）08-1107-08

Abstract：? To discuss the effect of different penetrants on maturation and germination of somatic embryo of Sophora davidii. Sucrose， maltose， sorbitol and PEG （6000） were used as penetrant in this paper. The development， maturation， and germination of somatic embryo was determined by different penetrant comparation. The results were as follows： the rate of somatic embryogenesis reached up to 66.21%， and the total number of embryos can achieve 79 when embryonic callus from hypocotyl of Sophora davidii were cultured in MS+ 2，4-D 0.2 mg·L-1 +NAA 1.0 mg·L-1+ 6-BA 2.0 mg·L-1 + TDZ 1.0 mg·L-1+sucrose 40 g·L-1+ glutamine 100 mg·L-1+plant gel 3 g·L-1. Adding 7% sucrose could promote the maturation rate of somatic embryo to 64.36%， meanwhile could also increase the development of polycotyledonous abnormal embryo. The maturation rate of somatic embryo went up as high as 88.89%， and the proportion of abnormal embryo the lowest， when somatic embryo were cultured in 2% maltose +2% sorbitol +4% sucrose combination medium. The maturation rate of somatic embryo was 82.35%， when the concentration of PEG was 30 g·L-1. Torpedo embryo was suitable for transported culture， the formative rate of somatic embryo was up to 90.58%. The rooting rate of mature somatic embryo was high， for 87.47% from three sugar combination culture. This study provides a theoretical reference and a feasible scheme for the development of somatic embryo seedling of Sophora davidii.

Key words： Sophora davidii，? penetrant， somatic embryo， somatic embryo maturation， somatic embryo germination

植物組織培養(yǎng)中體細(xì)胞胚發(fā)生途徑是獲得再生植株有效方法之一，由于體細(xì)胞胚發(fā)生具有數(shù)量多、來源于單個的原始胚性細(xì)胞、遺傳相對穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)完整、再生率高、可作為外源基因轉(zhuǎn)化受體等優(yōu)點(diǎn)（Gupta & Pullman，1991），已成為遺傳改良和人工種子生產(chǎn)的原材料以及快速繁育和商品化生產(chǎn)種苗的前提（胡頌平和劉選明，2014）。最早通過體細(xì)胞胚發(fā)生的報(bào)道來自Steward（1958）和Reinert（1959）對胡蘿卜根的培養(yǎng)，隨后在一些草本植物中相繼培養(yǎng)獲得成功，木本植物由于生長發(fā)育規(guī)律、器官部位等與草本植物有較大差異，使木本植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生的種類很有限，在世界范圍內(nèi)，目前通過體細(xì)胞胚發(fā)生途徑誘導(dǎo)并培育出再生植株的木本植物180余種。國外對櫟屬（Quercus L.）、楊屬（Populus L.）、挪威云杉（P. abies）、白云杉（P. glauca）、黑云杉（P. mariana）等研究較為深入全面，且花旗松（Pseudotsuga menziesii）、火炬松（Pinus taeda）、輻射松（P. radiata）、挪威云杉（Picea abies）、水曲柳（Fraxinus mandshurica）、雜交鵝掌楸（Liriodendron hybrids）等體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)和再生植株已成功應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中，并進(jìn)行商業(yè)化的苗木生產(chǎn)。桉樹（Eucalyptus camakdulensis）、北美鵝掌楸（Liriodendron tulipifera）、歐洲落葉松（Larix decidua）等利用其體細(xì)胞胚發(fā)生體系，實(shí)現(xiàn)了抗病蟲、抗逆等基因轉(zhuǎn)移（陳金慧等，2003）。然而，截至目前為止，白刺花（Sophora davidii）有關(guān)方面的研究尚屬空白。

白刺花（Sophora davidii）為豆科槐屬落葉灌木，在西南喀斯特地區(qū)和北方干旱地區(qū)常作水土保持的先鋒樹種（李芳蘭等，2009;何曉，2007;何建利等，2018）。白刺花根、莖、葉、花、和種子均可入藥，具有清熱利咽、消熱解暑和涼血消腫等功效（毛曉健等，2009）。小花數(shù)多、密集，是春天優(yōu)良的蜜源植物和天然無公害“綠色食品”（樊建，2005）。在白刺花的開發(fā)利用中調(diào)查發(fā)現(xiàn)，白刺花雖然開花數(shù)多，結(jié)實(shí)量大，但由于種子硬實(shí)（吳麗芳等，2014）、種皮透水透氣性差且具有休眠性（吳麗芳等，2018），所以自然狀態(tài)下幼苗少、種群更新慢，從而限制了幼苗的生長及定居。若能通過體細(xì)胞胚發(fā)生途徑形成再生植株，這無疑是解決有性繁殖種苗慢的有效途徑之一。然而，通過前期對白刺花的研究發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)中存在誘導(dǎo)率低、萌發(fā)率低等問題。因此，本研究在前期研究基礎(chǔ)上，以優(yōu)化白刺花體細(xì)胞胚培養(yǎng)條件，提高體胚的成熟和萌發(fā)，探索影響體胚分化中生長素和細(xì)胞分裂素濃度配比，篩選適宜的培養(yǎng)條件，針對體胚萌發(fā)率低的問題，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的滲透壓和培養(yǎng)基內(nèi)的組成成分來確定萌發(fā)過程中所需要的營養(yǎng)物質(zhì)和關(guān)鍵因素，以期為實(shí)現(xiàn)白刺花體細(xì)胞胚育苗奠定理論基礎(chǔ)和提供可行的方案。

1.5 白刺花生根培養(yǎng)與植株再生

不同滲透劑培養(yǎng)得到的成熟體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進(jìn)一步培養(yǎng)，生根培養(yǎng)為1/2MS+ NAA0.2 mg·L1+2 g·L1活性炭+蔗糖30 g·L1+瓊脂7 g·L1，直至獲得完整植株，最后將幼苗煉苗后移栽至裝有基質(zhì)（腐殖土∶珍珠巖= 2∶1）的花盆中，30 d后統(tǒng)計(jì)植株成活率。

植株成活率=移栽成活的植株（株）/移栽的總株數(shù)（株）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 白刺花體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)

胚性愈傷組織接種至MS + 2，4D 0.2 mg·L1 +NAA 1.0 mg·L1+6BA 2.0 mg·L1+TDZ 1.0 mg·L1+蔗糖40 g·L1+谷氨酰胺100 mg·L1+植物凝膠3 g·L1的培養(yǎng)基后，前10 d內(nèi)可見胚性愈傷組生長，表面松軟，稍顆粒狀（圖1：A）。隨著培養(yǎng)時間的增長，愈傷表面淡黃色，光滑突起，30 d左右突起圓柱狀縱向伸長（圖1：B），有幼小的體胚開始發(fā)育而成（圖1：C）。培養(yǎng)40 d后，可以得到高頻發(fā)生的白刺花體細(xì)胞胚，包括球形胚、心形胚、魚雷形和少部分子葉胚。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，體細(xì)胞胚發(fā)生率為66.21%，每克愈傷組織上獲得的總胚數(shù)為79個，其中球形胚52個，心形胚18個，魚雷胚8個，子葉胚4個。形成的子葉胚中，一個僅有1片子葉，1個有多個子葉，另外兩個形態(tài)正常。

2.2 滲透劑對白刺花體細(xì)胞胚成熟的影響

2.2.1 蔗糖對白刺花體細(xì)胞胚成熟的影響 蔗糖在植物離體培養(yǎng)時既可以提供能源，又能起到調(diào)節(jié)滲透壓的作用，以4%的蔗糖為研究對照。從表1可以看出，隨著蔗糖濃度的增加，體細(xì)胞胚趨于成熟，蔗糖濃度為7%時，體細(xì)胞胚成熟率最高，達(dá)64.36%;蔗糖濃度為2%時，體細(xì)胞胚成熟率最低，僅35.58%。從研究中觀察到，低濃度的蔗糖和高濃度的蔗糖都不利于正常體細(xì)胞胚的發(fā)育。低濃度時，體細(xì)胞胚長勢差，出現(xiàn)透明水漬狀的玻璃胚，生活力弱，逐漸變褐死亡;高濃度蔗糖時，多子葉畸形胚形成，且有簇生的類似單子葉胚擁有共同胚軸的體胚，此類體細(xì)胞胚不能進(jìn)一步發(fā)育。相對適合的蔗糖濃度為5%～6%，體胚粗壯膨大，下胚軸伸長。

2.2.2 復(fù)合糖對白刺花體細(xì)胞胚成熟的影響 麥芽糖、蔗糖和山梨醇不同組合對白刺花體細(xì)胞胚成熟的影響結(jié)果見表2。從表2可以看出，在不同濃度的麥芽糖與蔗糖組合中， 體細(xì)胞胚成熟率隨著麥芽糖濃度的增加而上升。當(dāng)麥芽糖濃度為7%時，體細(xì)胞胚成熟率最高，達(dá)86.27%，相應(yīng)的畸形胚發(fā)生率也最高，為22.73%;麥芽糖濃度為2%時，體胚成熟率為57.41%，畸形胚占總成熟胚的比例為22.58%;麥芽糖濃度為5%時，畸形胚比例最低，僅為10.81%。在山梨醇與蔗糖的組合中，成熟體細(xì)胞胚胎數(shù)也是隨著山梨醇濃度的增加而增加。2%的山梨醇與蔗糖組合時，體細(xì)胞胚成熟率最低，僅51.79%;7%的蔗糖時，體細(xì)胞胚成熟率最高，為78.18%，畸形胚比例為18.60%;山梨醇為中等濃度5%時，體細(xì)胞胚成熟率為71.93%，畸形體胚率最低， 為9.76%。在2%麥芽糖與2%山梨醇和4%蔗糖組合中，得到的體細(xì)胞胚成熟率最高，為88.89%，畸形胚比例最低，僅6.25%。這說明糖源的種類及濃度對體細(xì)胞胚成熟率和畸形胚的比例有影響作用。

2.3 PEG對白刺花體細(xì)胞胚成熟的影響

PEG作為滲透劑通常能引起水分脅迫， 使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成受抑，細(xì)胞分別受阻，加速體細(xì)胞胚的發(fā)育。表3為不同濃度PEG對白刺花體細(xì)胞胚成熟的研究結(jié)果。由表3可知，PEG濃度為30 g·L1時，體細(xì)胞成熟率最高，達(dá)82.35%，畸形胚比例僅為9.52%;而PEG濃度超過30 g·L1，體細(xì)胞胚成熟率則開始下降，當(dāng)PEG濃度為70 g·L1時，體細(xì)胞胚成熟率僅為41.51%，而畸形胚比例卻高達(dá)31.82%。

2.4 白刺花體細(xì)胞胚的萌發(fā)

過渡期得到的不同發(fā)育期的體細(xì)胞胚接種于不含任何激素的體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上，其體細(xì)胞胚萌發(fā)能力不一致，球形胚接種后需先經(jīng)心形期，魚雷期和子葉期，再形成子葉胚直至發(fā)育出幼苗，40 d左右，成苗時間長，形成的幼苗長勢稍弱。心形胚培養(yǎng)時，其發(fā)育仍先發(fā)育成魚雷胚再經(jīng)歷子葉胚;子葉胚培養(yǎng)時，部分體胚顏色會先變成米白色呈衰老狀態(tài)最終褐化而死;而魚雷胚轉(zhuǎn)接時，10 d后則轉(zhuǎn)變?yōu)樽尤~胚，子葉逐漸展開，隨后顏色變?yōu)榫G色，胚軸伸長，基部主根開始生長，20 d左右，可見小幼苗長成，成苗時間快，畸形苗少，形成的幼苗長勢健壯。不同的體細(xì)胞胚其萌發(fā)能力見表4，魚雷期的體胚萌發(fā)能力最高，為90.58%，成苗質(zhì)量為每棵103 mg，而球形期的體胚萌發(fā)率則最低，僅69.77%，成苗質(zhì)量為每棵81 mg。

2.5 白刺花生根培養(yǎng)與植株再生

不同滲透劑培養(yǎng)得到的成熟體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)（圖2： A），麥芽糖+山梨醇+蔗糖組合培養(yǎng)基的成熟體細(xì)胞胚生根率最高，為87.47%，除主根長出外，有些小苗還有5～6根側(cè)根，且下胚軸健壯、根粗壯、子葉舒展（圖2： B）;僅蔗糖的培養(yǎng)基上，生根率（為77.51%）不如復(fù)合糖上的培養(yǎng);而在PEG的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的體細(xì)胞胚，生根率則介于兩者之間，為82.13%。將得到的幼苗（圖2： C）在培養(yǎng)室打開瓶塞煉苗7 d后，移栽至溫室花盆中，前20 d內(nèi)保持濕度在80%以上，避免強(qiáng)烈陽光直射，30 d后幼苗移栽成活率在92%以上。

3 討論

植物組織培養(yǎng)中添加的糖類有蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇等。糖類除為細(xì)胞提供C、H、O、N等必要元素外，還起到調(diào)節(jié)滲透壓的作用。蔗糖是植物培養(yǎng)時經(jīng)常使用的糖類，一般使用濃度為2%～5%，特殊培養(yǎng)如花藥或幼胚培養(yǎng)需較高的蔗糖濃度，從而對體細(xì)胞胚的發(fā)育起到重要作用。細(xì)胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)時，為了使培養(yǎng)物生長良好，除蔗糖外，還需配合其它糖類。許建秀等（2017）在抗松材線蟲病赤松體細(xì)胞胚的發(fā)育和成熟萌發(fā)研究中使用麥芽糖與蔗糖對比，得出60 g·L1麥芽糖比蔗糖更適宜抗病赤松的體細(xì)胞胚發(fā)育和成熟。齊力旺等（2004）對華北落葉松的研究表明，3%麥芽糖與4%的PEG（4000）的組合比蔗糖與PEG（4000）組合效果好，且體細(xì)胞胚成熟頻率高，植株生根率達(dá)57.89%，體細(xì)胞胚質(zhì)量優(yōu)于蔗糖和PEG4000組合。顧曉川等（2018）對橡膠的研究中發(fā)現(xiàn)，蔗糖添加量不影響胚狀體的再生率，蔗糖添加量對橡膠樹胚狀體植株再生的株高和抽葉影響較大。本研究不同糖類及糖類組合均影響體細(xì)胞胚的成熟。單一使用蔗糖濃度為5%～6%，形成的體細(xì)胞胚粗壯膨大，下胚軸伸長。過高的蔗糖濃度，雖可提高白刺花體細(xì)胞胚成熟率，但會增加畸形胚的比例。

PEG作為滲透調(diào)節(jié)劑促進(jìn)體細(xì)胞胚成熟早有報(bào)道，其原理是引起細(xì)胞失水，使細(xì)胞內(nèi)含物的濃度相應(yīng)提高，促進(jìn)體胚的成熟及萌發(fā)。孫桂君（2009）對水曲柳體細(xì)胞胚成熟及萌發(fā)的研究中發(fā)現(xiàn)，添加70 g·L1的PEG對水曲柳的體胚成熟有明顯的促進(jìn)作用，研究認(rèn)為適度的PEG可促進(jìn)體細(xì)胞胚的成熟，但過高濃度的PEG反而會使體細(xì)胞胚成熟率降低和增加畸形胚比例。分析其原因可能是適當(dāng)PEG透壓引起水分脅迫，能夠使細(xì)胞內(nèi)正常的蛋白質(zhì)合成受阻，而相應(yīng)地誘導(dǎo)一些脅迫蛋白質(zhì)合成，達(dá)到調(diào)節(jié)代謝，則抑制愈傷組織細(xì)胞的分裂，加速胚的發(fā)育，使體細(xì)胞胚胎早熟并抑制成熟胚的萌發(fā)（高述民，2001）。

白刺花下胚軸經(jīng)過胚性愈傷組織誘導(dǎo)，在MS+2，4D 0.2 mg·L1 +NAA 1.0 mg·L1+6BA 2.0 mg·L1+TDZ 1.0 mg·L1+蔗糖4%+谷氨酰胺100 mg·L1+植物凝膠0.3%的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)體細(xì)胞發(fā)生，可使體細(xì)胞胚發(fā)生率達(dá)66.21%;蔗糖濃度會影響體細(xì)胞胚的成熟和增加畸形胚的比例。2%麥芽糖+2%山梨醇+4%蔗糖培養(yǎng)時，體細(xì)胞胚成熟率高達(dá)88.89%， 30 g·L1PEG可使體細(xì)胞胚成熟率達(dá)82.35%，魚雷期體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)接最合適，幼苗煉苗后，移栽成活率達(dá)92%。本研究結(jié)果可為實(shí)現(xiàn)白刺花體細(xì)胞胚育苗奠定理論基礎(chǔ)和提供可行的方案。

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