蘇麟

摘 要：GLK轉(zhuǎn)錄因子隸屬于GARP家族，廣泛存在于高等植物中，其編碼的轉(zhuǎn)錄因子能夠起到促進(jìn)葉綠體發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，水稻中有一對(duì)GLK基因，分別為OsGLK1與OsGLK2。為深入探究該基因的功能，本文克隆了水稻中OsGLK2的啟動(dòng)子序列，并對(duì)水稻GLK基因的表達(dá)進(jìn)行分析。在OsGLK2啟動(dòng)子上發(fā)現(xiàn)了8個(gè)TATA-box，13個(gè)CAAT-box，5個(gè)G-box位點(diǎn);不同水稻種質(zhì)上OsGLK2基因啟動(dòng)子存在很大多態(tài)性，OsGLK1及OsGLK2主要在葉子及根中表達(dá)，不同種質(zhì)間的表達(dá)差異明顯，3個(gè)基因型的表達(dá)量明顯低于及其他樣;分析發(fā)現(xiàn)CAAT-box是影響OsGLK2表達(dá)量的調(diào)控位點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：水稻（Oryza sativa）;GLK轉(zhuǎn)錄因子;啟動(dòng)子;多態(tài)性;表達(dá)模式

中圖分類號(hào)：S511

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2019）05-0001-05 國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.05.001

Genetic polymorphisms of rice transcription factor GLK promoters and the expression patterns of OsGLK gene

WEN Su-lin

（College of Life Sciences，Lanzhou University，Lanzhou ，Gansu 730000，China）

Abstract：GLK transcription factors belong to GARP family，and are widely found in higher plants. The transcription factors encoded by them play a regulatory role in chloroplast development. To date，two members of GLK genes，i.e. OsGLK1 and OsGLK2 have been uncovered in rice so far. To better understand the roles of this GLK transcription factor，the promoter of OsGLK2 was cloned from rice and sequenced，of which 8 TATA-box，13 CAAT-box，and 5 G-box sites were investigated. Diverse mutation sites were obtained from OsGLK2 promoter among the tested genotypes. Generally，OsGLK1and OsGLK2 expressed in leaves and roots. Further，the expression levels diversified among the germplasms，and three genotypes，i.e. L132，L149 and L160 demonstrated the lowest levels. CAAT-box is a regulatory site for OsGLK2 expression.

Key words：Rice （Oryza sativa）; tanscription factor GLK; promoter; polymorphism; expression pattern

GLK轉(zhuǎn)錄因子屬于GARP家族，普遍存在于高等植物中，能夠調(diào)控葉綠體的發(fā)育[1]。在擬南芥上，雙突變體 AtGLK1和 AtGLK2 在所有光合組織中呈淡綠色，呈現(xiàn)減少 Granal 類囊體葉綠體特征[1] ;而過表達(dá) AtGLK1和 AtGLK2 使淡綠色表型更加突出[2]。ZmGLK1 同源到 Golden2 （G2）上，并且玉米 g2 突變體葉片顯淡綠色[3]。 從小立宛蘚（Physcomitrella patens）中分離 GLK 基因，表明它們規(guī)管在葉綠體發(fā)育中。因此，GLK 轉(zhuǎn)錄因子在植物上具有調(diào)節(jié)葉綠體發(fā)育的功能。

前人研究表明，水稻中有一對(duì)GLK基因，分別為OsGLK1與OsGLK2。OsGLK1 能直系同源到玉米 Golden2 - 1 （ZmGLK1） 基因[4]。插入突變體證明OsGLK1 和 OsGLK2 的作用可能類似，反映了一定程度的功能冗余[4]。含 OsGLK2-FOX 序列D 愈傷組織在 N6D 培養(yǎng)基上顯示綠色，OsGLK2野生型愈傷組織再生過程中表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式[5]。本文對(duì)OsGLK2的啟動(dòng)子進(jìn)行克隆和序列分析，同時(shí)利用實(shí)驗(yàn)室的豐富水稻種質(zhì)資源，分析該基因在不同種質(zhì)中的表達(dá)模式，旨在為深入認(rèn)識(shí)GLK基因在水稻上的進(jìn)化模式及在不同種質(zhì)中的表達(dá)特性提供新信息。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本實(shí)驗(yàn)所用水稻材料來源于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，包括50份水稻突變體（L124-L173，表1）及對(duì)照中花11（ZH11），采集開花后10天的葉、根、花以及成熟種子，液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取

液氮將植物組織組織研磨成細(xì)粉，加入65℃預(yù)熱的2×CTAB抽提液1000μL和β-巰基乙醇4 μL，混勻，65℃溫育1.5 h，間斷混勻。12000 rpm離心10 min，轉(zhuǎn)移上清，加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）（v/v），抽提上清，顛倒混勻7 min，12000 rmp離心10 min。轉(zhuǎn)移上清，再用等體積的氯仿/異戊醇（24：1）（v/v）抽提上清液，12000 rpm離心10 min，轉(zhuǎn)移上清。上清加入等體積的異丙醇，-20℃冰浴1 h。12000 rpm離心10 min，棄上清。75%酒精洗滌2次，用ddH2O溶解DNA。用Thermo 超微量核酸檢測(cè)儀檢測(cè) DNA 濃度與質(zhì)量。

1.3 RNA提取

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需取擬南芥一定部位材料0.1 g左右，液氮中研磨，加入500 μL RNAiso Plus（Takara）試劑分離RNA，震蕩均勻，室溫放置10 min。加入200 μL氯仿，震蕩，后靜置3 min 12000 g，4℃離心15 min。取無色水相層置入新的1.5 mL離心管中，加入與其體積相同的異丙醇，-20℃下靜置1 h，然后12000 g、4℃離心10 min。用75%乙醇洗滌兩次后晾干，用RNase-free水進(jìn)行溶解，用Thermo 超微量核酸檢測(cè)儀檢測(cè)DNA 濃度與質(zhì)量。

1.4 RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA

RNA反轉(zhuǎn)錄首先用DNAase去除RNA中的雜質(zhì)DNA，后用Takara公司的5*PrimeScript RT Master Mix進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，體系如下：5*PrimeScript RT Master Mix 2 μL，RNA 500 ng，添加ddH2O至10 μL。然后將混合液放入PCR儀，進(jìn)行如下條件的反應(yīng)：37℃ 15 min，85℃ 5 s。反應(yīng)完成后將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA儲(chǔ)存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 基因表達(dá)的qRT-PCR分析

本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行檢驗(yàn)，儀器型號(hào)Bio-RAD CFX96。采用如下體系：cDNA 1 mg/μL，qRT-FP 5 μL，qRT-RP 0.5 μL，TransStart Top Green qRT-PCR SuperMix（全式金公司）7.5 μL，加dd H2O至15 μL。該實(shí)驗(yàn)使用引物為GLK2-qRT-F：AGAGCATAGACGCAGCCATC，GLK2-qRT-R：TGCTTGTGCAGCTCAGACAT。qRT-PCR過程為：首先95℃預(yù)變性30 s，接著95℃變形30 s，56℃退火10 s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)完成后，得到Ct值，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.7 OsGLK2啟動(dòng)子的克隆

擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為50 μL：TaKaRaprimSTAR（2×）25 μL，ddH2O 21 μL，模版 基因組DNA 2 μL，上下游引物（10 μM）各1 μL;擴(kuò)增程序?yàn)?8℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min 30 s，37個(gè)循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，用 SanPrep 柱式DNA膠回收試劑盒（生工，上海）對(duì)獲得的特異性擴(kuò)增片段進(jìn)行回收。該實(shí)驗(yàn)使用引物為GLK2-Promoter-F：AAGCTTGCTCCACGCTTTCCAAGTTCCT，GLK2-Promoter-R：GGATCCCCCAAAATCTCTCCCCTCTACA。

對(duì)片段進(jìn)行回收、克隆，反應(yīng)體系：在微型離心管中依次加入PCR 產(chǎn)物 0.5～4 μL（根據(jù)PCR 產(chǎn)物量可適當(dāng)增減，最多不超過4 μL），pEASY- T3 Cloning Vector 1 μL輕輕混合，室溫 （20 ℃-37 ℃） 反應(yīng)5 分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將離心管置于冰上。

轉(zhuǎn)化過程：加連接產(chǎn)物于50 μL Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中（在感受態(tài)細(xì)胞剛剛解凍時(shí)加入連接產(chǎn)物），輕彈混勻，冰浴20～30 min。42℃熱激30 s，立即置于冰上2 min。加250 μL平衡至室溫的SOC/LB，200轉(zhuǎn)、37℃孵育1 h。 取8 μL 500 mM IPTG，40 μL 20 mg/mL X-gal混合，均勻地涂于準(zhǔn)備好的平板（AIX培養(yǎng)基）上，在37℃ 放置30 min。待IPTG，X-gal 被吸收后，取200 μL 菌液鋪板，培養(yǎng)過夜。

用SanPrep 柱式質(zhì)粒 DNA 小量抽提試劑盒（生工公司）提取質(zhì)粒，酶切鑒定后選取合適的質(zhì)粒送測(cè)序公司測(cè)序，測(cè)序引物用T7和SP6。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsGLK2啟動(dòng)子克隆

通過合適的PCR體系擴(kuò)增得到了OsGLK2啟動(dòng)子片段，所擴(kuò)增片段大小在2000 bp 左右，符合目的片段大小。雖然電泳結(jié)果呈現(xiàn)輕微雜帶，但是經(jīng)過對(duì)目的片段的切膠回收后，能夠保證目的片段的純度。取得該片段后，用目的片段連接測(cè)序載體p-Easy T3，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，送到測(cè)序公司測(cè)序。

A.ZH11的OsGLK2啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增結(jié)果;B.L124-L127的OsGLK2啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖1 OsGLK2啟動(dòng)子部分PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1 OsGLK2 promoter partial PCR amplification results

2.2 OsGLK2啟動(dòng)子序列分析

為了探究啟動(dòng)子序列對(duì)于OsGLK2基因表達(dá)的影響，對(duì)中花11（對(duì)照）中OsGLK2基因啟動(dòng)子元件進(jìn)行分析（圖1）。結(jié)果顯示，以主要的啟動(dòng)子元件為例（表1），OsGLK2上具有8個(gè)TATA-box，13個(gè)CAAT-box，5個(gè)G-box。以上調(diào)控元件主要功能是：TATA-box，核心啟動(dòng)子;CAAT-box，增強(qiáng)子;G-box，光響應(yīng)的順勢(shì)調(diào)控元件。

2.3 OsGLK2啟動(dòng)子在不同種質(zhì)中的多態(tài)性

以ZH11為參照，通過測(cè)序后的序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，50組水稻種質(zhì)樣品均準(zhǔn)確地克隆到了目的片段，即OsGLK2的啟動(dòng)子。我們還分析了50份水稻種質(zhì)資源在OsGLK2啟動(dòng)子區(qū)的多態(tài)性位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表1），許多種質(zhì)在該區(qū)段部分都出現(xiàn)了堿基的突變，其中L132、L149及L160由于第1860位點(diǎn)的堿基發(fā)生突變（A/T），造成了該位置CAAT-box被破壞;另外，L133的1265堿基發(fā)生突變（T/G），造成該位置受到破壞。

2.4 OsGLK1及OsGLK2的表達(dá)分析

以ZH11為材料，取花、葉片（花后10 d）、根（花后10 d）及成熟種子，分析兩個(gè)GLK基因的表達(dá)模式），結(jié)果顯示（圖2 A），OsGLK1及OsGLK2主要在葉子及根中表達(dá)，花中少量表達(dá)，成熟種子中極少表達(dá);不同種質(zhì)間分析表明（圖2 B），L132、L149及L160的基因表達(dá)量明顯低于對(duì)照ZH11及其他樣品，而其他樣品間差異不明顯。

3 結(jié)論與討論

GLK2基因在過去被發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)葉綠體發(fā)育，抵抗生物脅迫，非生物脅迫以及抵抗植物衰老等功能[6]?？紤]到啟動(dòng)子是調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵因素[7]，本文克隆了OsGLK2的啟動(dòng)子序列，序列分析發(fā)現(xiàn)OsGLK2存在許多調(diào)控元件，例如TATA-box、CAAT-box、G-box，它們都是植物中生理調(diào)控的重要調(diào)控元件，是轉(zhuǎn)錄因子重要的結(jié)合域[8]。在OsGLK2啟動(dòng)子上，CAAT-box占據(jù)了大多數(shù)，它是重要的增強(qiáng)子[9]，推測(cè)它在增強(qiáng)OsGLK2轉(zhuǎn)錄方面起到重要作用;另外，TATA-box是重要的轉(zhuǎn)錄起始元件，在基因轉(zhuǎn)錄中也扮演著重要角色[10]，能看到OsGLK2啟動(dòng)子也遍布著TATA-box。G-box主要是響應(yīng)光信號(hào)的調(diào)控元件，由于OsGLK2與葉綠體發(fā)育相關(guān)[11]，因此推測(cè)G-box可能也在OsGLK2轉(zhuǎn)錄過程中扮演著重要角色。

缺失了OsGLK2基因1860位點(diǎn)CAAT-box的樣品L132，L149，L160，OsGLK2基因的表達(dá)量受到一定影響。考慮到OsGLK2基因主要功能是促進(jìn)葉綠體發(fā)育[5]，因此葉綠體發(fā)育在這些樣品中可能會(huì)受到輕微程度的影響;另外，L133樣品在1265位點(diǎn)處出現(xiàn)堿基變異導(dǎo)致TATA-box結(jié)構(gòu)被破壞，但是未能明顯影響OsGLK2的表達(dá)，說明該位點(diǎn)的TATA-box不是對(duì)基因表達(dá)起核心影響的元件。此外GLK基因普遍能夠響應(yīng)生物脅迫及非生物脅迫[6]，且遍布OsGLK2啟動(dòng)子上的G-box元件是一種脅迫應(yīng)答元件[12]，因此G-box是否影響OsGLK2的脅迫應(yīng)答是一個(gè)值得研究的問題。

不同種質(zhì)OsGLK2基因啟動(dòng)子存在較大的多態(tài)性（表1），就其產(chǎn)生的原因，我們推測(cè)在這些種質(zhì)遺傳傳代過程中，許多外因及內(nèi)因造成了這些位點(diǎn)的單堿基突變。例如，從物理因素來說，各種射線（包括x射線，γ射線）、激光、紫外線等，溫度的劇烈改變會(huì)引起了基因突變[13]。這些因素可能干擾DNA的復(fù)制，使DNA在復(fù)制過程中發(fā)生差錯(cuò)而導(dǎo)致基因分子結(jié)構(gòu)中堿基序列的改變;就化學(xué)因素來說，各種能夠與DNA分子發(fā)生作用而改變DNA分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的物質(zhì)，如一些化學(xué)致癌物質(zhì)砷、笨、煤焦油、硫酸二乙酯、秋水仙素等的存在，能夠與DNA發(fā)生作用，使其在DNA復(fù)制過程中發(fā)生差錯(cuò)的可能性增加，從而產(chǎn)生突變的位點(diǎn)[13]。生物因素上，某些病毒和細(xì)菌能夠使DNA產(chǎn)生突變位點(diǎn)[14]。因此，這些因素的綜合影響使得水稻材料在生長過程中，出現(xiàn)了或多或少基因?qū)用嫔系淖儺?，但不一定?huì)影響其性狀[15]。推測(cè)本文研究中的不同種質(zhì)資源在長期的自然選擇過程中，許多基因的自然變異被保留了下來，因此OsGLK2啟動(dòng)子部分出現(xiàn)了諸多核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。

葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的核心部位，其發(fā)育直接關(guān)系到植物生長[5]。GLK家族基因在水稻葉片中表達(dá)水平最高，符合GLK基因主要功能是促進(jìn)葉綠體發(fā)育的報(bào)道[5]。由于該基因在水稻根中也有較高的表達(dá)量，因此也可能參與根中某些生理過程的調(diào)控，對(duì)此推測(cè)有待進(jìn)一步研究。

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