賀小英　荊乾鴿　姜欣穎　吳憲　蘭宗寶　馬利兵

摘要：端粒酶與體細胞重編程是當今生物界最熱門的研究領(lǐng)域之一。研究端粒酶能揭示生物體胚胎早期發(fā)育、衰老和癌癥發(fā)生的機制;細胞重編程則有望從根本上解決體細胞克隆技術(shù)問題，從而開啟生命再造新時代。文章通過對端粒酶與體細胞重編程及二者互作機制的最新研究進展進行詳細闡述，發(fā)現(xiàn)細胞重編程面臨的主要問題是效率低下，其根本原因是對其作用機制尚未完全了解;而最新研究證實，生殖細胞的端粒酶活性發(fā)生時序性變化可能在胚胎發(fā)育及細胞重編程過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。因此，揭示細胞重編程機制是今后研究工作的重心，尤其是揭示端粒酶在胚胎發(fā)育過程的分子調(diào)控機理及端粒酶調(diào)控細胞重編程可能開啟的信號通路，對提高細胞重編程效率，推進克隆動物的生產(chǎn)實踐并開啟生命再造，以及為治療癌癥等人類重大疾病具有重要意義。

關(guān)鍵詞： 端粒酶;體細胞重編程;表觀修飾;調(diào)控作用;胚胎發(fā)育

中圖分類號： S814.8 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）05-1133-08

0 引言

端粒酶（Telomerase）是一種核糖核酸蛋白復(fù)合體，由端粒酶RNA（TER）、端粒酶催化亞基（TERT）及相關(guān)結(jié)合蛋白組成。其中，TERT是端粒酶蛋白組分中的催化亞單位，能直接刺激體外細胞增殖并延長細胞壽命（Blasco，2005）。端粒（Telomeres）是由簡單的DNA高度重復(fù)序列組成，且沿5'到3'方向富含GT，其中人類端粒由大量重復(fù)的TTAGGG組成。人們通常認為，端粒酶有延長端粒、保護端粒DNA完整性的功能，但越來越多研究證實其功能更強大和豐富。Park等（2009）研究表明，端粒酶通過與染色體重建蛋白BRG1相互作用而直接激活Wnt通路。Tsai等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，過表達端粒酶活性的神經(jīng)母細胞瘤經(jīng)RNA干擾手段滅活端粒酶后，細胞內(nèi)的DNA出現(xiàn)濃縮及細胞周期抑制現(xiàn)象。近十年來，關(guān)于端粒酶又有新的分子功能發(fā)現(xiàn)，即端粒酶調(diào)控細胞重編程。Zvereva等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，人類TERT能進行細胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和代謝重編程;Kinoshita等（2014）研究證實，當滅活供體細胞端粒酶活性時，許多與轉(zhuǎn)錄和表觀修飾相關(guān)的基因表達均發(fā)生一定程度的上調(diào)或下調(diào)。可見，端粒酶在體細胞重編程過程中發(fā)揮著極其重要的作用。關(guān)于端粒，曾認為其只是不編碼的一個簡單重復(fù)序列（TTAGGG）n，但現(xiàn)在越來越多研究認為端粒除了維持染色體的結(jié)構(gòu)完整和功能穩(wěn)定外，還在調(diào)控細胞生長、發(fā)育分化乃至細胞重編程等一系列生命活動中扮演著重要角色（Mason et al.，2011）?！禨cience》在2007年刊登了進一步的重大發(fā)現(xiàn)：瑞士實驗癌癥研究所的Joachim Linger及其同事發(fā)現(xiàn)端粒能充當RNA的合成模板，產(chǎn)生許多RNA分子（Azzalin et al.，2007），但至今尚未明確這些合成RNA的具體作用。Wang等（2012）研究報道，與生殖細胞相比，體細胞端粒異質(zhì)性極可能是引起核重編程不徹底的關(guān)鍵因素，最終導(dǎo)致核移植效率低下或失敗。端粒維持生殖細胞染色體的完整性，而端粒酶通過延長端粒使其在胚胎發(fā)育中實現(xiàn)完全重編程，與此不同的是，大多克隆動物重編程效率低下，其主要原因是端粒并未被完全重編程，即端粒酶和端?？赡苁怯绊懼鼐幊绦实年P(guān)鍵因素。為此，本文就端粒酶與體細胞重編程及二者互作機制的最新研究進展進行詳細闡述，為今后開展克隆動物生產(chǎn)及再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的相關(guān)研究提供參考。

1 端粒酶的調(diào)控作用

端粒酶是一種特殊的DNA逆轉(zhuǎn)錄酶。美國加州大學(xué)伯克利分校的研究人員對端粒酶結(jié)構(gòu)進行了更精細的繪制（Jiang et al.，2015，2018），根據(jù)結(jié)構(gòu)圖（圖1）發(fā)現(xiàn)了兩個新蛋白Teb2和Teb3，二者與單鏈端粒DNA結(jié)合蛋白Teb1形成復(fù)合物（TEB），以增加端粒酶的活性。這兩個新蛋白的發(fā)現(xiàn)更正了人們認為端粒酶由7個蛋白亞基和1個RNA鏈組成的觀點。此外，端粒酶的催化核心由RNA鏈及其互作蛋白TERT和p65組成。其中，RNA鏈形成一個環(huán)裹住TERT蛋白;端粒酶3個結(jié)構(gòu)蛋白p75、p45和p19較保守，四膜蟲與人類的結(jié)構(gòu)類似，且關(guān)鍵蛋白p50與TERT、Teb1和p75協(xié)同互作參與端粒酶的功能（Upton et al.，2017）。TER作為RNA模板，具有模板的核心和TER活化結(jié)構(gòu)域（CR4/5）兩部分結(jié)構(gòu)域，但其激活端粒酶的機制尚不清楚。最新研究發(fā)現(xiàn)，全酶蛋白TCAB1能控制CR4/5的構(gòu)象，從而調(diào)控端粒酶復(fù)合體的組裝及其活性功能（Chen et al.，2018）。在人類胚胎早期發(fā)育階段，端粒酶在多種組織中具有活性，尤其在體外培養(yǎng)的絕大多數(shù)癌細胞和永生化細胞中均能檢測到端粒酶活性，但在成體細胞中缺乏端粒酶活性。

人類TERT的表達調(diào)控在胚胎早期發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，且其表達量的調(diào)控對許多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點均有影響，如鋅指轉(zhuǎn)錄因子Sp1、癌基因（c-Myc）和抑癌基因（p53）在調(diào)控端粒酶活性中發(fā)揮重要作用。Sp1結(jié)合位點的任何突變均能顯著降低人類TERT啟動子轉(zhuǎn)錄表達（Su et al.，2018），通常Sp1需要與c-Myc協(xié)同作用才能激活端粒酶的表達（Zheng et al.，2018），而端粒酶活性的時序性調(diào)控不斷維持早期胚胎染色體的完整性和穩(wěn)定性。此外，端粒酶在胚胎發(fā)育過程中扮演著除延長端粒長度之外的其他重要調(diào)控作用。Lewinska等（2017）也研究證明，敲除人類TERT可導(dǎo)致p53轉(zhuǎn)錄升高，進而減少細胞增殖，進一步說明p53在人類TERT表達過程中發(fā)揮負反饋調(diào)控作用。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，TERT可直接與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，以輔助激活子的形式調(diào)控多個重要信號通路的下游靶基因表達（圖2）。信號通路TGF-β在胚胎發(fā)育和器官形成過程中發(fā)揮重要作用，其中，活化蛋白1（AP-1）能抑制人類TERT的轉(zhuǎn)錄，而AP1、TGF-β R1和SMAD3能抑制TGF-β活性途徑（Cherlet and Murphy，2007;Peek and Tollefsbol，2016;Yang et al.，2019）。也有研究認為，ERα與上游人類TERT調(diào)控區(qū)結(jié)合而激活雌激素，是通過抑制TGF-β受體或AP1干擾TGF-β途徑來實現(xiàn)（Peek and Tollefsbol，2016）。Yano等（2016）、Lewinska等（2017）、Qin等（2018）研究報道，p21、p53和E2F1能抑制人類TERT活性，CDK2/CDK4和Cyclin D卻激活人類TERT表達而影響細胞增殖，從而改變細胞周期信號途徑。PI3K/Akt與TERT間存在反饋調(diào)節(jié)，TERT表達可激活PI3K/Akt信號通路，而PI3K/Akt信號通路又可通過多種機制反作用增加TERT表達。PI3K/Akt和MAP激酶通路上調(diào)人類TERT轉(zhuǎn)錄是通過MAD1磷酸化，導(dǎo)致泛素介導(dǎo)的蛋白水解（Hein et al.，2011）。PI3K/Akt的通路作用可能導(dǎo)致人類TERT失調(diào)，最終導(dǎo)致細胞增殖甚至發(fā)生永生化（Peek and Tollefsbol，2016）?，F(xiàn)有研究證實，在PI3k/Akt信號通路中，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PI3K、Akt和mTOR參與正調(diào)控TERT（Blasco，2005;Hein et al.，2011;Dogan and Biray Avci，2018），而PTEN參與負調(diào)控TERT（Yang et al.，2019）。NF-κB和c-Myc誘導(dǎo)的人表皮生長因子受體2（HER2）在照射后能激活人類TERT的NF-κB通路，進而破壞細胞周期調(diào)控進程（Tilborghs et al.，2017）。此外，炎癥因子IKK通過激活端粒酶的活性而調(diào)控NF-κB通路，從而刺激細胞增殖（An et al.，2016）。最新研究發(fā)現(xiàn)，表皮生長因子受體（EGFR）可上調(diào)TERT的表達從而觸發(fā)MEK信號通路（Lin et al.，2018）。

2 端粒酶與體細胞重編程的互作機制

2. 1 體細胞重編程研究進展

細胞重編程是抹去基因組中原本存在的體細胞或生殖細胞類型特異的表觀遺傳修飾模式，建立起具有胚胎干細胞特異的表觀遺傳修飾模式，主要包括DNA甲基化修飾、組蛋白修飾、印記基因修飾及X染色體失活等表觀遺傳修飾的改變。

2. 1. 1 DNA甲基化修飾 當前的研究表明，克隆胚和克隆動物存在異常的表觀遺傳修飾，如較高的DNA甲基化和較低的組蛋白乙酰化水平（Silveira et al.，2018）。在克隆牛早期胚胎中可觀察到不完全的去甲基化現(xiàn)象（Bonk et al.，2008），而這種不完全的修飾會導(dǎo)致個體發(fā)育異常，如大型胎兒綜合癥等（Giraldo et al.，2008）。Kremenskoy等（2006）通過調(diào)查克隆牛胎兒全基因組范圍內(nèi)的DNA甲基化模式，發(fā)現(xiàn)克隆牛胎兒的腦部和胎盤存在異常DNA甲基化。Yang等（2007）研究顯示，正常牛胚胎重新甲基化發(fā)生在8-細胞期到16-細胞期，但克隆牛胚胎在4-細胞期提前發(fā)生重新甲基化，且滋養(yǎng)層細胞存在超甲基化的異常修飾。還有研究認為，甲基化程度較低的體細胞克隆胚重編程效率相對較高（Blelloch et al.，2006）。因此，克隆動物發(fā)育異常及克隆動物失敗均會發(fā)生DNA甲基修飾的異常，而選擇易于重編程的供體細胞類型至關(guān)重要（Solter，2000）。此外，Sahakyan等（2017）通過檢測克隆和非克隆公牛精子發(fā)育調(diào)節(jié)基因（PEG3、XIST、OCT4和NANOG）的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)二者并無明顯差異，且囊胚中的甲基化狀態(tài)也相似?？梢姡寺」５木釉谄浒l(fā)生過程中需要充分重新編程，才能產(chǎn)生表觀遺傳正常的胚胎，提示端粒酶在精子細胞重編程過程可能發(fā)揮重要作用。

2. 1. 2 組蛋白修飾 組蛋白修飾在細胞重編程過程中也發(fā)揮著重要作用，是由于組蛋白單一位點的修飾即可改變?nèi)旧w構(gòu)象，進而調(diào)控基因表達（Marx，2006;Park et al.，2018）。目前的研究表明，與體外受精（IVF）胚胎相比，核移植胚胎的組蛋白修飾存在不同程度的變異，從牛核移植胚胎原核期到8-細胞期的H3K9、H3K18、H4K5和H4K8乙酰化水平均顯著高于IVF胚胎，且在兩種胚胎中H3K9和H3K18的乙?；蕜討B(tài)變化：在8-細胞期減弱，在囊胚和桑椹胚期又明顯增強（Wu et al.，2011）。此外，卵子對供體細胞不完全重編程可能也與組蛋白修飾異常有關(guān)。Marión等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，體細胞的端粒DNA大部分呈甲基化修飾狀態(tài)，且富含組蛋白H3第9位賴氨酸三甲基化（H3K9me3）和H4第20位賴氨酸三甲基賴氨酸（H4K20me3）修飾，凡是能誘導(dǎo)成為iPS細胞的體細胞同樣伴隨著端粒重編程及其組蛋白的去甲基化修飾。

2. 1. 3 印記基因修飾 印記基因是指僅來自親本一方的等位基因表達，印記控制區(qū)（Imprinting control region，ICR）調(diào)控主要通過DNA甲基化的方式來實現(xiàn)。由于基因印記相關(guān)疾病的癥狀與體細胞克隆動物發(fā)育異常出現(xiàn)的癥狀相似，故推測重編程過程中的印記紊亂是導(dǎo)致體細胞克隆動物發(fā)育異常的原因之一（Shen et al.，2012）。有關(guān)發(fā)育異常和死亡的體細胞克隆動物研究發(fā)現(xiàn)，印記基因的表達和甲基化模式異常在體細胞克隆動物各組織上均有存在。Deng等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，死亡的克隆羊與存活的克隆羊相比，前者各組織中H19基因甲基化程度更高，但二者在腦組織中的差異不顯著。Curchoe等（2009）發(fā)現(xiàn)體細胞克隆牛兩個印記基因（H19和IGF2）間的區(qū)域表現(xiàn)出異常超低甲基化修飾。此外，有研究發(fā)現(xiàn)印記基因XIST可能與雌性克隆牛的存活率有關(guān)，IGF2基因可能參與雄性克隆牛的存活率，也就是說印記基因在克隆動物性別發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用（Ruan et al.，2018）。

2. 1. 4 X染色體失活 X染色體失活一般發(fā)生在哺乳動物的早期發(fā)育階段。X染色體失活是為了實現(xiàn)具有兩個X染色體的哺乳動物雌性和具有單個X染色體的雄性與性別決定性Y染色體間的劑量等效（Sahakyan et al.，2017）;在體細胞克隆過程中重編程不完全也會引起X染色體失活的異常。正常情況下，XIST基因僅作用于失活的X染色體（Inactive X chromosome，Xi），另一條有活性的X染色體（Active X chromosome，Xa）則不受其影響。已有研究表明，在雄性體外受精囊胚期的胚胎中檢測不到XIST基因mRNA，但在體細胞囊胚期發(fā)現(xiàn)有XIST基因 mRNA（Inoue et al.，2010）。在失活起始階段，X染色體被XIST基因包裹后，其組蛋白抑制性修飾如H3K27me3大量增加，而活性修飾如H3K4的甲基化被去除，在Xa染色體上則恰好相反，即H3K27me3相對較低而H3K4甲基化水平相對較高（Sado and Brockdorff，2013）。

2. 2 端粒酶調(diào)控體細胞重編程

2. 2. 1 端粒酶調(diào)控端粒重編程 端粒酶的首要生物學(xué)功能是維持端粒長度。體細胞中缺乏端粒酶的活性，端粒長度則隨DNA復(fù)制逐漸縮短;在生殖細胞中，同一精子產(chǎn)生的不同細胞端粒長度存在明顯差別。Achi等（2000）通過對小鼠未成熟精原細胞、不同階段生精細胞及成熟具有受精能力的精子進行端粒長度檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未成熟精原細胞的端粒較其他生精細胞的短，且在生精細胞到精子成熟的過程中端粒長度不斷增加。由于存在末端復(fù)制問題，盡管體細胞端粒長度隨年齡的增加而縮短，但精子端粒長度因端粒酶活性的存在保持不變，其目的是為了保護精子染色體遺傳物質(zhì)的完整性，最終實現(xiàn)親代精子在胚胎發(fā)育中端粒的完全重編程（Yatsenko et al.，2012）。關(guān)于克隆動物中端粒的重編程問題，Shiels等（1999）認為克隆羊多莉的端粒長度并未完全重編程，因此導(dǎo)致其表現(xiàn)出早衰現(xiàn)象;Betts和King（1999）在克隆牛的所有組織和細胞中也未發(fā)現(xiàn)端粒長度延長現(xiàn)象。但Lanza等（2000）研究得出完全不同的結(jié)論，即克隆牛的端粒長度顯著長于其供體成纖維細胞;Dean等（2001）同樣發(fā)現(xiàn)克隆豬的端粒發(fā)生了重編程現(xiàn)象。關(guān)于核移植后端粒是否發(fā)生重編程的報道各不相同，其原因可能是體細胞中端粒的長度變化是一個動態(tài)過程，且克隆動物的數(shù)量有限，不具有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，很難從克隆前、后動物的體細胞探究端粒的長度變化規(guī)律。目前，對于端粒酶和端粒在體細胞重編程過程中的作用機制尚不清楚，但可以肯定的是在胚胎形成期通過端粒酶重新合成端粒DNA具有重要意義（Schaetzlein and Rudolph，2005）。Wang等（2012）研究報道，在誘導(dǎo)iPS細胞重編程過程中端粒酶的活性起關(guān)鍵調(diào)控作用，端粒長度發(fā)生動態(tài)變化，且這種動態(tài)變化可能在指導(dǎo)胚胎不斷發(fā)育和分化。

端粒重編程發(fā)生不僅包括端粒的長度變化，還包括許多參與端粒結(jié)合及與端粒調(diào)控有關(guān)的蛋白變化。至今已發(fā)現(xiàn)的端粒相關(guān)蛋白有TRF1、TRF2、TP1、TERT、Tankyrase和POT1等，其中，TRF1和TRF2是兩種端粒DNA結(jié)合蛋白（Telomere-specific DNA binding protein），且有學(xué)者認為TRF1可能是通過抑制端粒酶來調(diào)控端粒長度，TRF2則可能具有保護染色體末端的作用（Smogorzewska et al.，2000）。TP1是端粒酶蛋白組分中的亞單位，從構(gòu)成上來看是一種多功能蛋白（Blasco，2005）;Tankyrase是一種人類端粒相關(guān)蛋白，推測其是通過失活TRF1的途徑來調(diào)控端粒酶活性;而人類端粒保護蛋白1（Human protection of telomeres 1，hPOT1）能與端粒單鏈重復(fù)序列TTAGGG特異性結(jié)合，并與其他端粒結(jié)合蛋白及端粒酶等共同完成端粒的保護和長度調(diào)節(jié)（Hockemeyer et al.，2006）。此外，Huang等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，人類的Stn1蛋白在保護端粒完整性上發(fā)揮重要作用;Mersaoui和Wellinger（2019）研究發(fā)現(xiàn)，酵母端粒長度調(diào)控蛋白Cdc13特殊區(qū)域的突變會引起DNA分子破壞。因此，在端粒重編程過程中這些關(guān)鍵調(diào)控端粒的相關(guān)蛋白是否會發(fā)生變化，尚有待進一步探究。

2. 2. 2 端粒酶調(diào)控體細胞重編程 目前，針對端粒酶的研究主要集中在衰老和癌癥方面，細胞重編程的研究也以表觀修飾和調(diào)控為主，有關(guān)端粒酶和體細胞重編程互作方面的報道很少，但近期有研究表明端粒酶活性在細胞重編程過程中發(fā)揮著極其重要的作用。Marión等（2009a）研究認為，只有供體細胞中具有端粒酶活性才能有效誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS細胞，此時供體細胞的端粒發(fā)生重編程，獲得的iPS細胞與胚胎干細胞（ES細胞）特征一致。此后，Blasco及其研究團隊在2009年的《Nature》雜志上報道，當供體細胞缺失端粒酶活性就會導(dǎo)致端粒很短或DNA發(fā)生損失，此時供體細胞會阻礙細胞重編程的發(fā)生（Marión et al.，2009b）。Huang等（2011）也研究證實，供體細胞端粒長度是否被重編程決定了ESCs/iPSCs最終能否進行多能性發(fā)育?？梢?，體細胞作為供核細胞時，其端粒與端粒酶活性在誘導(dǎo)iPS細胞重編程過程中發(fā)揮著重要作用，因此確定端粒酶在體細胞核移植后核重編程過程中同樣具有極其重要的作用。Wang等（2012）研究表明，與生殖細胞相比，體細胞端粒的異質(zhì)性極可能是引起核重編程不徹底的關(guān)鍵因素，最終導(dǎo)致核移植效率低下或失敗。此外，有報道稱端粒酶在體細胞核移植中除了延長端粒長度外，還發(fā)揮著其他作用。當供體細胞敲除TERT或突變TERT致使端粒酶失活后，在細胞重編程中發(fā)現(xiàn)有75個基因表達上調(diào)和1571個基因表達下調(diào)，而且這些基因大多數(shù)與轉(zhuǎn)錄和表觀修飾相關(guān)（Kinoshita et al.，2014）。最新研究還發(fā)現(xiàn)關(guān)于TERT基因DNA甲基化在細胞重編程相關(guān)基因表達中的一個新功能：在人類誘導(dǎo)多能干細胞與親代細胞的遠端區(qū)域TERT啟動子存在差異甲基化區(qū)域（DMR），在誘導(dǎo)多能干細胞TERT基因高度甲基化后，供體細胞呈低水平甲基化，即甲基化TERT-DMR能上調(diào)IPSC的啟動子活性，從而調(diào)控細胞重編程進程（Takasawa et al.，2018）。

端粒酶活性在哺乳動物生殖細胞和早期胚胎發(fā)育過程還具有時序性變化規(guī)律。早期腔前和排卵前卵母細胞的端粒酶活性較高，但成熟卵母細胞的端粒酶活性很低（Kosebent et al.，2018）。對于雄性的性源細胞來說，精母細胞和精子細胞具有端粒酶活性，而在成熟精子中檢測不到端粒酶活性（Ravindranath et al.，1997;Pech et al.，2015）。值得注意的是，卵母細胞受精后端粒酶活性明顯升高，但其發(fā)育成正常體細胞后端粒酶活性幾乎完全消失（Kosebent et al.，2018）。受精卵在胚胎發(fā)育的不同階段其端粒酶活性也會發(fā)生時序性變化，Betts和King（1999）研究發(fā)現(xiàn)在不同物種包括人類和牛受精胚在4-細胞期端粒酶活性再次出現(xiàn)，且囊胚期活性表現(xiàn)相當高。早期胚胎中的端粒延長呈端粒酶依賴性，Schaetzlein等（2004）研究表明，在小鼠和牛的桑椹胚到胚泡過渡期發(fā)生端粒重編程，并在胚胎發(fā)生過程中建立了特定的端粒長度，無論供體細胞核的端粒長度如何，該過程都能恢復(fù)克隆胚中的端粒長度。胚胎發(fā)育過程中端粒的延伸對于確保從親本到子代的正常端粒長度分離至關(guān)重要，且可能對子代的再生、衰老和致癌等具有直接影響。Xu和Yang（2001）通過檢查來自孤雌激活和體細胞克隆牛胚胎中的端粒酶活性，并在胚胎發(fā)育不同階段獲取從受精卵到胚泡的端粒酶活性，結(jié)果顯示孤雌激活和體細胞克隆牛胚胎中的端粒酶活性與IVF胚胎具有相似的動態(tài)特征。此外，在鼠和牛的胚胎發(fā)育期間，端粒酶在桑椹胚/胚泡轉(zhuǎn)變中被強烈激活，端粒明顯延長。在胚胎發(fā)育的不同階段，無論胚胎獲得方法如何，檢測到的端粒酶活性均在胚泡階段達最高水平。

3 展望

細胞重編程在《Science》2008年評出的“十大科學(xué)進展”中位列第一，日本科學(xué)家山中伸彌和英國科學(xué)家約翰·伯特蘭·格登也因研究細胞重編程取得重大突破而獲得2012年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。至此，細胞重編程成為當今生物界許多學(xué)者熱衷研究的領(lǐng)域之一。由于細胞重編程有望從根本上解決體細胞克隆技術(shù)問題及攻克再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨的技術(shù)難題，因此是未來動物改良育種、人類不孕不育乃至癌癥等重大疾病治療中最具應(yīng)用價值的一項前沿技術(shù)。目前，細胞重編程面臨的共同問題是效率低下，而根本原因是對其作用機制尚未完全了解，例如生殖細胞的端粒酶活性不斷發(fā)生時序性變化在胚胎發(fā)育乃至細胞重編程過程中究竟發(fā)揮著怎樣的作用，是否在有序調(diào)控細胞重編程或開啟某些信號通路的變化等。因此，闡明細胞重編程機制，尤其是揭示端粒酶在胚胎發(fā)育過程中的分子調(diào)控機理及端粒酶調(diào)控細胞重編程可能開啟的信號通路，對提高細胞重編程效率，推進克隆動物的生產(chǎn)實踐并開啟生命再造，以及治療癌癥等人類重大疾病具有重要意義。

參考文獻：

Achi M V，Ravindranath N，Dym M. 2000. Telomere length in male germ cells is inversely correlated with telomerase activity[J]. Biology of Reproduction，63（2）：591-598.

An J，Wu M，Xin X，Lin Z，Li X，Zheng Q，Gui X，Li T，Pu H，Li H，Lu D. 2016. Inflammatory related gene IKKα，IKKβ，IKKγ cooperates to determine liver cancer stem cells progression by altering telomere via heterochromatin protein 1-HOTAIR axis[J]. Oncotarget，7（31）：50131-50149.

Azzalin C M，Reichenbach P，Khoriauli L，Giulotto E，Ling-ner J. 2007. Telomeric，repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends[J]. Science，318（5851）：798-801.

Betts D H，King W A. 1999. Telomerase activity and telomere detection during early bovine development[J]. Developmental Genetics，25（4）：397-403.

Blasco M A. 2005. Telomeres and human disease：Ageing，cancer and beyond[J]. Nature Reviews Genetics，6（8）：611-622.

Blelloch R，Wang Z，Meissner A，Pollard S，Smith A，Jaenisch R. 2006. Reprogramming efficiency following somatic cell nuclear transfer is influenced by the differentiation and methylation state of the donor nucleus[J]. Stem Cells，24（9）：2007-2013.

Bonk A J，Li R，Lai L，Hao Y，Liu Z，Samuel M，F(xiàn)ergason E A，Whitworth K M，Murphy C N，Antoniou E，Prather R S. 2008. Aberrant DNA methylation in porcine in vitro- parthenogenetic-，and somatic cell nuclear transfer-produced blastocysts[J]. Molecular Reproduction Development，75（2）：250-264.

Chen L，Roake C M，F(xiàn)reund A，Batista P J，Tian S，Yin Y A，Gajera C R，Lin S，Lee B，Pech M F，Venteicher A S，Das R，Chang H Y，Artandi S E. 2018. An activity switch in human telomerase based on RNA conformation and shaped by TCAB1[J]. Cell，174（1）：218-230.

Cherlet T，Murphy L C. 2007. Estrogen receptors inhibit Smad3 transcriptional activity through Ap-1 transcription factors[J]. Molecular and Cellular Biochemistry，306（1-2）：33-42.

Curchoe C L，Zhang S Q，Yang L，Page R，Tian X C. 2009. Hypomethylation trends in the intergenic region of the imprinted IGF2 and H19 genes in cloned cattle[J]. Animal Reproduction Science，116（3-4）：213-225.

Dean W，Santos F，Stojkovic M，Zakhartchenko V，Walter J，Wolf E，Reik W. 2001. Conservation of methylation reprogramming in mammalian development：Aberrant reprogramming in cloned embryos[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Ame-rica，98（24）：13734-13738.

Deng M，Ren C，Liu Z，Zhang G，Wang F，Wan Y. 2017. Epigenetic status of H19-Igf2 imprinted genes and loss of 5-Hydroxymethylcytosine in the brain of cloned goats[J]. Cellular Reprogramming，19（3）：199-207.

Dogan F，Biray Avci C. 2018. Correlation between telomerase and mTOR pathway in cancer stem cells[J]. Gene，641：235-239.

Giraldo A M，Hylan D A，Ballard C B，Purpera M N，Vaught T D，Lynn J W，Godke R A，Bondioli K R. 2008. Effect of epigenetic modifications of donor somatic cells on the subsequent chromatin remodeling of cloned bovine embryos[J]. Biology of Reproduction，78（5）：832-840.

Hein N，Jiang K，Cornelissen C，Lüscher B. 2011. TGFβ1 enhances MAD1 expression and stimulates promoter-bound Pol II phosphorylation：Basic functions of C/EBP，SP and SMAD3 transcription factors[J]. BMC Molecular Biology，12：9. doi：10.1186/1471-2199-12-9.

Hockemeyer D，Daniela J P，Takai H，de Lange T. 2006. Recent expansion of the telomeric complex in rodents：Two distinct POT1 proteins protect mouse telomeres[J]. Cell，126（1）：63-77.

Huang C H，Dai X Y，Chai W H. 2012. Human Stn1 protects telomere integrity by promoting efficient lagging-strand synthesis at telomeres and mediating C-strand fill-in[J]. Cell Research，22（12）：1681-1695.

Huang J J，Wang F，Okuka M，Liu N，Ji G，Ye X，Zuo B，Li M，Liang P，Ge W W，Tsibris J C，Keefe D L，Liu L. 2011. Association of telomere length with authentic pluripotency of ES/iPS cells[J]. Cell Research，21（5）：779-792.

Inoue K，Kohda T，Sugimoto M，Sado T，Odonuki N，Matoba S，Shiura H，Ikeda R，Mochida K，F(xiàn)ujii T，Sawai K，Otte A P，Tian X C，Yang X，Ishino F，Abe K，Ogura A. 2010. Impeding Xist expression from the active X chromosome improves mouse somatic cell nuclear transfer[J]. Science，330（6003）：496-499.

Jiang J，Chan H，Cash D D，Miracco E J，Ogorzalek Loo R R，Upton H E，Cascio D，O’Brien Johnson R，Collins K，Loo J A，Zhou Z H，F(xiàn)eigon J. 2015. Structure of Tetrahymena telomerase reveals previously unknown subunits，functions，and interactions[J]. Science，350（6260）：aab4070. doi：10.1126/science.aab4070.

Jiang J，Wang Y，Su?ac L，Chan H，Basu R，Zhou Z H，F(xiàn)eigon J. 2018. Structure of telomerase with telomeric DNA[J]. Cell，173（5）：1179-1190.

Kinoshita T，Nagamatsu G，Saito S，Takubo K，Horimoto K，Suda T. 2014. Telomerase reverse transcriptase has an extratelomeric function in somatic cell reprogramming[J]. The Journal of Biological Chemistry，289（22）：15776-15787.

Kosebent E G，Uysal F，Ozturk S. 2018. Telomere length and telomerase activity during folliculogenesis in mammals[J]. The Journal of Reproduction and Development，64（6）：477-484.

Kremenskoy M，Kremenska Y，Suzuki M，Imai K，Takahashi S，Hashizume K，Yaqi S，Shiota K. 2006. DNA methylation profiles of donor nuclei cells and tissues of cloned bovine fetuses[J]. The Journal of Reproduction and Development，52（2）：259-266.

Lanza R P，Cibelli J B，Blackwell C，Cristofalo V J，F(xiàn)rancis M K，Baerlocher G M，Mak J，Schertzer M，Chavez E A，Sawyer N，Lansdorp P M，West M D. 2000. Extension of cell life-span and telomere length in animals cloned from senescent somatic cells[J]. Science，288（5466）：665-669.

Lewinska A，Adamczyk-Grochala J，Kwasniewicz E，Wnuk M. 2017. Downregulation of methyltransferase Dnmt2 results in condition-dependent telomere shortening and senescence or apoptosis in mouse fibroblasts[J]. Journal of Cellular Physiology，232（12）：3714-3726.

Lin C，Qin Y，Zhang H，Gao M Y，Wang Y F. 2018. EGF upregulates RFPL3 and hTERT via the MEK signaling pathway in non-small cell lung cancer cells[J]. Oncology Reports，40（1）：29-38.

Marión R M，Schotta G，Ortega S， Blasco M A. 2011. Suv4-20h abrogation enhances telomere elongation during reprogramming and confers a higher tumorigenic potential to iPS cells[J]. PLoS One，6（10）：e25680.

Marión R M，Strati K，Li H，Murga M，Blanco R，Ortega S，F(xiàn)ernandez-Capetillo O，Serrano M，Blasco M A. 2009a. A p53-mediated DNA damage response limits reprogramming to ensure iPS cell genomic integrity[J]. Nature，460（7259）：1149-1153.

Marión R M，Strati K，Li H，Tejera A，Schoeftner S，Ortega S，Serrano M，Blasco M A. 2009b. Telomeres acquire em-bryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells[J]. Cell Stem Cell，4（2）：141-154.

Marx J. 2006. Molecular biology. Protein tail modification opens way for gene activity[J]. Science，311（5762）：757.

Mason M，Schuller A，Skordalakes E. 2011. Telomerase structure function[J]. Current Opinion in Structural Biology，21（1）：92-100.

Mersaoui S Y，Wellinger R J. 2019. Fine tuning the level of the Cdc13 telomere-capping protein for maximal chromosome stability performance[J]. Current Genetics，65（1）;109-118.

Park J I，Venteicher A S，Hong J Y，Choi J，Jun S，Shkreli M，Chang W，Meng Z，Cheung P，Ji H，McLauqhin M，Veenstra T D，Nusse R，McCrea P D，Artandi S E. 2009. Telomerase modulates Wnt signalling by association with target gene chromatin[J]. Nature，460（7251）：66-72.

Park J，Lee H，Han N，Kwak S，Lee H T，Kim J H，Kang K，Youn B H，Jeong H J，Kang J S，Kim S Y，Han J W，Youn H D，Cho E J. 2018. Long non-coding RNA ChRO1 facilitates ATRX/DAXX-dependent H3.3 deposition for transcription- associated heterochromatin reorganization[J]. Nucleic Acids Research. doi： 10. 1093/nar/gky923.

Pech M F，Garbuzov A，Hasegawa K，Sukhwani M，Zhang R J，Benayoun B A，Brockman S A，Lin S，Brunet A，Orwig K E，Artandi S E. 2015. High telomerase is a hallmark of undifferentiated spermatogonia and is required for maintenance of male germline stem cells[J]. Genes & Development，29（23）：2420-2434.

Peek G W，Tollefsbol T O. 2016. Down-regulation of hTERT and Cyclin D1 transcription via PI3K/Akt and TGF-β pathways in MCF-7 cancer cells with PX-866 and raloxifene[J]. Experimental Cell Research，344（1）：95-102.

Qin Q P，Wang S L，Tan M X，Wang Z F，Luo D M，Zou B Q，Liu Y C，Yao P F，Liang H. 2018. Novel tacrine platinum（II） complexes display high anticancer activity via inhibition of telomerase activity，dysfunction of mitochondria，and activation of the p53 signaling pathway[J]. European Journal of Medicinal Chemistry，158：106-122.

Ravindranath N，Dalal R，Solomon B，Djakiew D，Dym M. 1997. Loss of telomerase activity during male germ cell differentiation[J]. Endocrinology，138（9）：4026-4029.

Ruan Z，Zhao X，Qin X，Luo C，Liu X，Deng Y，Zhu P，Li Z，Huang B，Shi D，Lu F. 2018. DNA methylation and expression of imprinted genes are associated with the viability of different sexual cloned buffaloes[J]. Reproduction in Domestic Animals，53（1）：203-212.

Sado T，Brockdorff N. 2013. Advances in understanding chromosome silencing by the long non-coding RNA XIST[J]. Philosophical Transactions of the Royal Society of London（Series B），368（1609）：20110325. doi： 10.1098/rstb.2011.0325.

Sahakyan A，Plath K，Rougeulle C. 2017. Regulation of X-chromosome dosage compensation in human：Mechanisms and model systems[J]. Philosophical Transactions of the Royal Society of London（Series B），372（1733）. Pii：20160363. doi：10.1098/rstb.2016.0363.

Schaetzlein S，Lucas-Hahn A，Lemme E，Kues W A，Dorsch M，Manns M P，Niemann H，Rudolph K L. 2004. Telomere length is reset during early mammalian embryogene-sis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，101（21）：8034-8038.

Schaetzlein S，Rudolph K L. 2005. Telomere length regulation during cloning， embryogenesis and ageing[J]. Reproduction，F(xiàn)ertility，and Development，17（1-2）：85-96.

Shen C J，Cheng W K，Wu S C，Chen H L，Tsai T C，Yang S H，Chen C M. 2012. Differential differences in methylation status of putative imprinted genes among cloned swine genomes[J]. PLoS One，7（2）：e32812.

Shiels P G，Kind A J，Campbell K H，Waddington D，Wilmut I，Colman A，Schnieke A E. 1999. Analysis of telomere lengths in cloned sheep[J]. Nature，399（6734）：316-317.

Silveira M M，Salgado Bay?o H X，Dos Santos Mendon?a A，Borges N A，Vargas L N，Caetano A R，Rumpf R，F(xiàn)ranco M M. 2018. DNA methylation profile at a satellite region is associated with aberrant placentation in cloned calves[J]. Placenta，70：25-33. doi：10.1016/j.placenta.2018. 08.007.

Smogorzewska A，van Steensel B，Bianchi A，Oelmann S，Schaefer M R，Schnapp G，de Lange T. 2000. Control of human telomere length by TRF1 and TRF2[J]. Molecular and Cellular Biology，20（5）：1659-1668.

Solter D. 2000. Mammalian cloning：Advances and limitations[J]. Nature Reviews. Genetics，1（3）：199-207.

Su Y，Chen C，Guo L，Du J，Li X，Liu Y. 2018. Ecological balance of oral microbiota is required to maintain oral mesenchymal stem cell homeostasis[J]. Stem Cells，36（4）：551-561.

Takasawa K，Arai Y，Yamazaki-Inoue M，Toyoda M，Akutsu H，Umezawa A，Nishino K. 2018. DNA hypermethylation enhanced telomerase reverse transcriptase expression in human-induced pluripotent stem cells[J]. Human Cell，31（1）：78-86.

Tilborghs S，Corthouts J，Verhoeven Y，Arias D，Rolfo C，Trinh X B，van Dam P A. 2017. The role of nuclear factor-kappa B signaling in human cervical cancer[J]. Critical Reviews in Oncology/Hematology，120：141-150.

Tsai M D，Chen P R，Tien L T，Cai Y J，Lee Y J. 2013. Nuc-lear condensation and cell cycle arrest induced by telome-rase siRNA in neuroblastoma cells[J]. Journal of Neu-ro-oncology，111（3）：265-272.

Upton H E，Chan H，F(xiàn)eigon J，Collins K. 2017. Shared subunits of tetrahymena telomerase holoenzyme and replication protein a have different functions in different cellular complexes[J]. The Journal of Biological Chemistry，292（1）：217-228.

Wang F，Yin Y，Ye X，Liu K，Zhu H，Wang L，Chiourea M，Okuka M，Ji G，Dan J，Zou B，Li M，Zhang Q，Liu N，Chen L，Pan X， Gagos S，Keefe D L，Liu L. 2012. Molecular insights into the heterogeneity of telomere reprogramming in induced pluripotent stem cells[J]. Cell Research，22（4）：757-768.

Wu X，Li Y，Xue L，Wang L，Yue Y，Li K，Bou S，Li G P，Yu H. 2011. Multiple histone site epigenetic modifications in nuclear transfer and in vitro fertilized bovine embryos[J]. Zygote，19（1）：31-45.

Xu J，Yang X. 2001. Telomerase activity in early bovine embryos derived from parthenogenetic activation and nuc-lear transfer[J]. Biology of Reproduction，64（3）：770-774.

Yang W，Wu Z，Yang K，Han Y，Chen Y，Zhao W，Huang F，Jin Y，Jin W. 2019. BMI1 promotes cardiac fibrosis in ischemia-induced heart failure via the PTEN-PI3K/AKT-mTOR signaling pathway[J]. American Journal of Physio-logy，316（1）：H61-H69.

Yang X Z，Smith S L，Tian X C，Lewin H A，Renard J P，Wakayama T. 2007. Nuclear reprogramming of cloned embryos and its implications for therapeutic cloning[J]. Nature Genetics，39（3）：295-302.

Yano S，Takehara K，Tazawa H，Kishimoto H，Urata Y，Kagawa S，F(xiàn)ujiwara T，Hoffman R M. 2016. Efficacy of a cell-cycle decoying killer adenovirus on 3-D gelfoam?-histoculture and tumor-sphere models of chemo-resistant stomach carcinomatosis visualized by FUCCI imaging[J]. PLoS One，11（9）：e0162991.

Yatsenko S A，Hixson P，Roney E K，Scott D A，Schaaf C P，Ng Y T，Palmer R，F(xiàn)isher R B，Patel A，Cheung S W，Lupski J R. 2012. Human subtelomeric copy number gains suggest a DNA replication mechanism for formation：Beyond breakage-fusion-bridge for telomere stabilization[J]. Human Genetics，131（12）：1895-1910.

Zheng L，Suzuki H，Nakajo Y，Nakano A，Kato M. 2018. Re-gulation of c-MYC transcriptional activity by transforming growth factor-beta 1-stimulated clone 22[J]. Cancer Scien-ce，109（2）：395-402.

Zvereva M I，Shcherbakova D M，Dontsova O A. 2010. Telomerase：Structure，functions，and activity regulation[J]. Biochemistry，75（13）：1563-1583.

（責任編輯 陳 燕）